专利名称：与猪血液参数性状相关的microRNA分子标记及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于家畜基因工程技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择的与血液参数(免疫)性状相关的HIiCT0RNA分子标记的克隆及应用。
背景技术：
MicroRNAs (miRNAs)为一类大小约22个碱基通过与其祀mRNA结合而诱导转录后基因沉默的小RNA(BarteI et al. ,2004 ；Kim et al. ,2005) 哺乳动物中miRNA的加工过程可分为多步。起先，大部分miRNA通过RNA聚合酶II (RNA polymerase II)转录成一条长的原初转录物(pri-miRNA) (Lee et al. , 2004),随后，pri-miRNA被由III型RNA核酸酶Drosha和双链RNA结合蛋白DGCR8组成的微处理复合体切割成大小为70 80nt的前体miRNA (pre-miRNA) (Lee et al. , 2003 ；Gregory et al. , 2004 ；Denli et al. ,2004)。接着由核输出蛋白Exportin-5及协同作用因子Ran-GTP —起将发夹前体miRNA转运出核(Yiet al. , 2003 ；Lund et al. , 2004 ；Bohnsack et al. ,2004)。在细胞质中，前体 miRNA 被另一个III型RNA核酸酶Dicer切割形成双链miRNA复合体。随后解旋，其中一条成为成熟miRNA进入核糖蛋白复合体，形成RNA干扰沉默复合体(RISC) (Preall et al.，2005)。在RISC中，miRNA通过两种方式调节靶基因的表达，如果其与靶基因3 ^ UTR完全互补，则使其降解；若不完全互补结合，则阻碍其翻译。体内miRNA的生物合成受到严密的调控，存在于pri-miRNA、pre-miRNA及成熟miRNA序列上的突变会不同程度地影响最终成熟miRNA的生成。在哺乳动物中，miRNA作为内源性阻遏物，通过结合靶mRNA的3' UTR区阻遏编码基因的翻译。由于在靶位点序列上存在的SNP可影响miRNA的调控作用，靶位点自然产生的SNP是miRNA功能研究的重点对象(Saunders, et al. 2007)。近年来越来越多的研究发现，编码合成人类miRNA的基因(包括miRNA原始转录本pri-miRNA, miRNA前体pre_miRNA和成熟miRNA)以及miRNA的祀基因结合序列内也存在SNP(Duan，et al. 2007)。Duan等研究has_miR-125a基因时发现，该基因位点也存在SNP，从而含miR-125a-G和miR-125a_U两种等位的miR_125a，其中miR-125a_U能显著影响DGCR8与pri-miRNA-125a的结合和剪接，使成熟的miR_125a生成减少，使miR_125a对靶基因Lin-28的翻译抑制作用减弱(Duan,et al. 2007)。Sethupathy等研究发现,位于AGTRl基因has-miR-155结合位点下游的SNP(rs5186)可影响与has-miR-155的结合,has-miR-155对该位点为A等位的AGTRl mRNA的结合能力增强，对AGTRI基因表达的下调作用更明显，而该位点为 C 等位的 AGTRl mRNA 表达不受 has-miR-155 影响(Sethupathy, et al.，2007)。miRNA在免疫调节中的扮演十分重要的角色，相比于损伤相关分子模式的microRNA, miR-155是与病原相关分子模式相关的miRNA (Hideho Okada, 2010)，而且miR-155作为一个原癌基因(Tam et al.，1997)，在多种肿瘤中高表达。miR-155功能广泛，它参与造血、炎症和免疫等许多生物过程(Isabella Faraoni，etal.，2009)。BIC/miR-155在维持免疫系统正常功能及稳态中发挥重要作用(Rodriguez，et al.，2007)。人与小鼠mir-155分别定位于各自基因组的第21号、16号染色体上，均来源于一条非编码长链RNA，BIC(B-cellIntegration Cluster)。BIC最初被鉴定为存在于由禽类白血病病毒诱导的B淋巴细胞癌的一个常见逆转录病毒整合位点上的基因，它可被插入的启动子活性激活转录(Tam et al.，1997)。2005年Eis等发现miR-155由bic RNA经加工剪切而产生，bic共包含三个外显子，而miR-155的前体存在于第三个外显子中(小鼠miR-155前体起始于第三个外显子的第 88nt) (Eis et al. , 2005)。近年来，对miRNA的深入研究给我们展示了一个全新的免疫调控机制。目前对参与免疫调节的miRNA的研究比较透彻的就有miR-155。Rodriguez等(2007)发现，在miR-155基因敲除的小鼠中，T细胞、B细胞以及DC细胞的功能都遭到破坏，此说明miR-155对于机体维持正常的免疫功能是必须的。O' Connell等(2007)在用聚肌胞(Poly I C)和IFN-β刺激鼠源性巨噬细胞后，利用基因芯片检测相关miRNA的差异表达，发现miR-155是唯一受这两种因子刺激后持续上调表达的miRNA。通过药理学方式抑制激酶JNK能阻止Poly I :C或IFN-β诱导miR-155的生成，表明JNK通路调控诱导产生miR-155 (O’Connell etal. ,2007)。Tili等(2007)发现，LPS能够诱导巨噬细胞miR-155的表达上调，miR_125b的表达下调，miR-155和miR-125b均参与调控免疫反应。迄今为止，尚未见全面研究猪miR-155基因功能的报道，而研究突变位点在群体中的多态性以及性状关联分析是研究基因功能的一个非常有力的手段。所以申请人对miR-155的基因序列进行了多态研究和关联分析，以期能够发现它与猪血液参数的关联，进而发现miR-155在免疫方面的功能。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，克隆与猪免疫相关miciORNA-155的前体及侧翼序列，寻找该片段的突变位点，筛选一种与猪血液参数性状相关microRNA分子标记，利用该分子标记作为猪的标记辅助选择的应用。本发明通过以下技术方案实现申请人:克隆得到与猪血液参数性状相关的micix)RNA-155前体及侧翼序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 2所述。PCR扩增的micix)RNA-155前体及侧翼序列全长为472bp，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO : 2所述和图2所示(图2括号内显示碱基突变位置)。在序列表SEQ ID NO 2的第297bp处存在一个等位基因的碱基突变(T297-C297)，该突变导致 Hha I-RFLP 多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism)。扩增miR-155前体及侧翼序列，测序并检测T297-C297处碱基突变所用的引物对的核苷酸序列如下所示正向引物5'CCAAAGCAACTGCAGGATAG 3'；反向引物5'CTTCTTTGTCATCCTCCC 3'。本发明所述的microRNA分子标记的制备方法是在miRBase(http:// microrna. sanger. ac. uk/sequences/)中下载人 / 鼠 miR-155前体序列，用NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)猪基因组数据库进行BLASTn比对,钓取同源猪miR-155基因的部分DNA序列(包括前体序列及侧翼序列)，设计PCR引物，提取猪基因组DNA，进行PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得如序列表SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。应用常规的PCR-RFLP的方法对序列表SEQ ID NO 2所示的第297位碱基突变进行了检测，并初步进行其基因型与猪的部分免疫性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。更详细的技术方案参见《具体实施方式
》。
序列表SEQ ID NO 1是用生物信息学的方法拼接得到的猪microRNA-155基因片段。序列全长为960bp。 序列表SEQ ID NO 2是本发明克隆的与猪血液参数性状相关的microRNA分子标记的核苷酸序列。图I :本发明的技术流程图。图2 :本发明中是克隆的与部分血液参数性状相关的microRNA分子标记的核苷酸序列，序列长度为472bp，括号内为等位基因的突变。图3 :本发明中杜洛克、梅山猪纯种猪的miR-155基因序列(472bp)的比对图。图4 :本发明中二花脸、长白猪纯种猪的miR-155基因序列(471bp)的比对图。图5 :本发明中长白猪、杜洛克纯种猪miR-155基因序列(467bp)的比对图。图6 :本发明中杜洛克、梅山猪纯种猪的多条测序序列比对。图7 :本发明中猪microRNA-155基因的Hha I-RFLP的三种基因型(CC，TC，TT)电泳图谱。M泳道为DNA分子量标准(DL2000)
具体实施例方式实施例I :(I)猪miciORNA-155前体及部分侧翼DNA序列的扩增在miRBase (http:// microrna.sanger.ac.uk/sequences/)中下载人 / 鼠miRNA-155 前体序列(基因登录号MI0000681/MI0000177)，在 NCBI (http://www. ncbi.nlm. nih. gov/)猪基因组数据库进行BLASTn比对，钓取同源猪miRNA-155基因序列，选择钓取到的同源性大于98%的20余条序列，导入DNASTAR软件seqman程序中，拼接出一条可信度较高的序列(其全长为960bp，见SEQ ID N0:1所示)以供后续的分析。根据拼接所得序列设计PCR引物(如下所示)，提取猪基因组DNA，进行PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得如序列表SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。通过对miRNA-155前体和侧翼部分序列(472bp)的扩增测序比对，于297bp处发现了 I个等位基因的突变(即T297-C297)，对此突变进行酶切分析，发现该突变恰好可被内切酶HhaI的识别。扩增miRNA-155前体及侧翼序列，测序并检测T297-C297处碱基突变所用的引物对的核苷酸序列如下所示正向引物5'GGGTGGGAATCGTTCAAAGG 3'，反向引物5'CATCCATCTTCCAGGAGCCA 3'。(2)PCR产物的纯化、克隆和测序
PCR扩增条件10uL的反应体系中加入DNA模板I μ L，双蒸水7 μ L，10XPCRbuffer I μ L, dNTPO. 3 μ L, IOmM 引物前后各 O. 3 μ L，Taq 酶 1U。PCR 反应条件为94°C预变性5min后，94°C变性30s、60。。退火30s、72。。延伸30s，33个循环，最后72°C延伸5min。PCR产物经I. 5%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物的纯化为获得足够量的PCR产物以进行后续的克隆，按照第一步的扩增条件，扩增100 μ IPCR产物，PCR产物短时间内可置4度冰箱保存。称取O. 3g琼脂糖加入20mlTAE电泳缓冲液，于微波炉内煮沸，直至液体变透明，稍微冷却后倒入插好大齿回收梳子的凝胶板。待凝胶冷却固化，取下梳子，置电泳槽中，加入合适体积的TAE电泳缓冲液，以没过凝胶为宜。在100μ I per产物中加入20μ I 6 X上样缓冲液(6 X loading buffer)，其中已加入GelRed (EB的替代品，较安全)。同时取10μ1 DL2000 DNA Ladder作为marker。电压120V，电流100mA，待溴酚蓝染料跑离胶孔3-4cm远处，小心取凝胶放入凝胶成像系统成像。然后在切胶仪内，小心切下含目的条带的小块凝胶，放入一干净的I. 5ml离心管内。依照天根普通DNA凝胶回收试剂盒(DP209)说明书，进行凝胶回收纯化。大致包含以下步 骤 柱平衡向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500μ I平衡液BL，12000rpm离心I分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。向装有切下来的凝胶条的I. 5ml离心管内加入3倍体积PN(凝胶重为0. lg，其体积可视为100 μ I)。50°C水浴放置10分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中(已平衡)，室温放置2分钟，12000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。向吸附柱CA2中加入600 μ I漂洗液PW，12000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。向吸附柱CA2中加入600 μ I漂洗液PW，12000rpm离心30-60秒，倒掉废液。将吸附柱CA2放回收集管中，12000rpm离心2分钟，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附柱中间位置悬空滴加适量洗脱液EB，室温放置2分钟。12000rpm离心2分钟收集DNA溶液。(一般加入35 μ I洗脱液)。纯化回收的目的片段就在洗脱所得的液体中；将部分产物送上海英俊生物公司直接测序。(3) DNA序列同源性检索鉴定通过美国国家生物技术信息中心(NCBI, http://www. ncbi. nlm. nih. gov)网站的BLAST (Basic LocalAlignment Search Tool)软件,将测序后获得的 DNA序列与 GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信
肩、O在本实施例中，PCR扩增产物经I. 5%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异的PCR产物。将PCR产物回收纯化后克隆测序，测序结果显示PCR得到的DNA序列全长为472bp,包括miRNA-155成熟序列，前体序列及部分侧翼序列(如序列表SEQ ID NO 2所示)，测序结果表明在该DNA序列的297bp处存在T297-C297突变，测序结果见图3所示。
( 二)PCR-RFLP诊断方法建立RFLP检测将PCR产物6 μ L，IOXBuffer I μ L，限制性内切酶Hha I为
O.2yL(2U)，加双蒸水补至10 μ L，将样品混匀后离心，37°C培养箱放置12h，用2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。用上述引物对扩增猪基因组DNA得到了 472bp特异性扩增片段，序列分析结果表明在297bp处存在T297-C297突变，并导致Hha I多态性。该基因突变位点由两个等位基因控制，其中T是没有形成酶切位点的等位基因，C是形成酶切位点的等位基因。这两个等位基因可组成三种基因型其中TT型为未发生酶切的纯合型(电泳检测时只有472bp —条DNA带)，CC型为发生酶切的纯合型(电泳检测时出现256bp和216bp两条DNA带)，TC为杂合型(电泳检测时出现472bp、256bp和216bp三条DNA带)。实施例2
实验猪群杜洛克X 二花脸资源群体为申请人所在的动物遗传育种与繁殖分子生物学实验室建立，由8头杜洛克公猪与13头二花脸母猪杂交产生，群体共计392头F2个体用于本实施例SNP性状关联分析。对所有392头F2个体进行了血常规性状的检测及记录，保存了完善的性状资料。对杜洛克X 二花脸F2群体共392头猪进行miR-155基因分型检测，确定每头猪miR-155基因型，整理每头猪标号与基因型的对应关系。申请人共检测出386头猪的基因型(其中6头猪未检出基因型)。使用SAS (视窗V8版)软件中的混合线性模型(Mixed Model,Mixed)程序对miR-155存在的T/C多态与性状进行关联分析。模型如下所示Y = Genotype+Sire+Dam(Sire);其中Genotype代表基因型效应,Sire代表公畜效应，Dam代表母畜效应。对猪miR-155基因多态性位点基因型检测结果表明在386个个体中TT基因型有113个，基因频率O. 29 ;TC基因型有185个，基因频率为O. 48 ;CC基因型有88个，基因频率为O. 23。所分析的性状有主要血常规指标。分别对F2个体在20日龄、33日龄、35日龄、80日龄进行检测，最后得出miR-155基因的SNP位点跟33日龄的血红蛋白浓度(HGB)、35日龄的嗜碱性粒细胞(BA)、35日龄的红细胞平均血红蛋白量(MCH)显著相关，与80日龄的嗜酸性粒细胞(EO)极显著相关，与生产性状有效乳头数极显著相关。相关具体参数如以下表所示。表lmiR-155基因多态性位点不同基因型与20日龄部分血常规指标的关联分析检测
权利要求
1.一种克隆的与猪血液参数性状相关的HiiCT0RNA分子标记，其核苷酸序列如序列表SEQID NO 2 所示。
2.根据权利要求I所述的分子标记，其特征在于，在序列表SEQID NO :2所示序列的第297位碱基处有一个T297-C297的碱基突变，导致Hha I-RFLP多态性。
3.扩增权利要求I或2所述分子标记的引物对，其特征在于所述引物对的核苷酸序列如下所示 正向引物5' CCAAAGCAACTGCAGGATAG 3'； 反向引物5' CTTCTTTGTCATCCTCCC 3'。
4.权利要求I或2所述的分子标记在猪血液参数性状辅助选择中的应用。
全文摘要
本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择应用的与血液参数(免疫)性状相关的microRNA分子标记及应用。所述的分子标记由猪microRNA miR-155前体及侧翼序列克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO2所示。序列表SEQ ID NO2所示序列的第297位碱基处有一个T297-C297的碱基突变，导致Hha I-RFLP多态性。本发明还公开了获得上述分子标记的制备方法和多态性检测方法的应用，为猪的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。
文档编号C12Q1/68GK102776178SQ20111012235
公开日2012年11月14日 申请日期2011年5月12日 优先权日2011年5月12日
发明者何华斌, 余梅, 曹建华, 朱猛进, 李新云, 李聪聪, 李长春, 赵书红 申请人:华中农业大学