专利名称：一种筛查转入靶标基因的转基因样本的方法
技术领域：
本发明涉及一种筛查转入靶标基因的转基因样本的方法。
背景技术：
1983年，世界首例转基因植物一抗病毒转基因烟草在美国华盛顿大学培育成功， 标志着人类利用转基因技术改良农作物的开始。基因工程与转基因作为一种农作物遗传改良的新方法，极大地提高了育种工作的质量和效率。从首次商业化种植转基因作物的1996 年到2008年，转基因作物累计种植面积超过8亿公顷，说明转基因作物已经成为农业人口接受最快的农作物技术。截止到2010年，已有30个国家批准种植转基因作物，全球转基因作物面积约达到每年1. 5亿公顷。国际上获得转基因植株的植物已有超过35个科120多个种，它们主要集中在七大类农作物上，即大豆、玉米、棉花、油菜、马铃薯、南瓜、西葫芦和木瓜。我国也是转基因作物主要种植国家之一。加强农业转基因生物安全管理，是推进转基因技术研究与应用的重要保障。2010 年农业部对市场上普通非转基因粮食作物品种推行转基因成份筛查，以避免非转基因品种中含有转基因成份，使所有转基因农作物生产与产品处于可控状态。因此，从大量样本中筛查转基因成份阳性样本，已成为普通商业品种重要的常规监测内容之一。此外，受植物遗传转化技术的限制，现有的遗传转化方法的转化效率并不高，以玉米中应用最为广泛农杆菌介导的幼胚遗传转化方法为例，通常在3-5%左右。因此，一般的遗传转化操作与转基因研究中，也需要从大量样本中筛除阳性样本。目前，转基因生物与环境安全备受关注，而转基因植物中选择标记的存在是影响转基因植物安全评价的重要因素。开发无选择标记转基因技术是发展趋势之一。然而，由于无选择标记，将面临从大量材料中选择阳性个体的步骤，进一步加大的材料筛选的工作量。因此，开发高效的筛查技术将是无选择转基因技术的重要保障。当前，基于PCR技术的转基因阳性样本筛查都是单个样本逐一分析，工作量大，效率低，成本高。正是基于转基因研发本身与转基因产品监管等需要，开发从大量样本中高效定性筛查含转基因成份样本技术具有重要的技术意义，具备很好的应用前景。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种从样本群中辅助鉴别转入靶标基因的转基因样本的方法。本发明所提供的从样本群中辅助鉴别转入靶标基因的转基因样本的方法，包括如下步骤1)将待测样本群按照如下方法进行三维排列设置沿X方向设置m行，即第1行、第2行、……、第m行；沿Y方向设置η列，即第A列、第B列、……、第η列；沿Z方向设置ρ层，即第1层、第2层、……、第ρ层；
每层有m行和η列；2)进行如下PCR扩增反应将每层上的所有待测样本的DNA或RNA混合，共有ρ种混合物，每种混合物是m*n 个样本的混合物；每种混合物分别作为PCR反应的模板，则共有ρ个PCR反应；若所述ρ个PCR反应均没有得到目的PCR扩增产物，则候选地确认所述待测样本群中不含有转入靶标基因的转基因样本；若所述ρ个PCR反应中至少一个PCR反应得到目的PCR扩增产物，则进行如下步骤3)3)进行如下PCR扩增反应将ρ层的对应的同一行号上的待测样本的DNA或RNA混合，共有m种混合物，每种混合物是P*n个样本的混合物；每种混合物分别作为PCR反应的模板，则共有m个PCR反应；将ρ层的对应的同一列号上的待测样本的DNA或RNA混合，共有η种混合物，每种混合物是P*m个样本的混合物；每种混合物分别作为PCR反应的模板，则共有η个PCR反应；上述m+n个PCR反应中，得到目的PCR扩增产物的PCR反应所对应的行、列和层的交叉点位置上的样本即候选为转入靶标基因的转基因样本；所述PCR反应均使用相同的引物；所述引物为用于检测所述靶标基因的引物；所述目的PCR扩增产物为所述靶标基因或所述靶标基因的片段。上述方法中，m为12，η为8，q为5。上述任一所述方法中，所述待测样本的DNA或RNA的浓度均为500ng/ μ L。上述任一所述方法中，每个PCR反应中的模板DNA或RNA的体积为2ul，浓度为 50ng/μ L0上述任一所述方法中，所述待测样本为植物、动物或微生物。上述任一所述方法中，所述植物为农作物，具体为玉米。上述任一所述方法中，所述转入靶标基因的转基因样本为转外源基因Cryl4b的玉米。上述任一所述方法中，所述引物为如下引物对1)或引物对2)引物对1) =SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 所示 DNA 分子；引物对 2) =SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 所示 DNA 分子.本发明利用三维混合池三维交叉唯一性原理与PCR检测的灵敏性与特异性，高效定性筛查样本中的阳性个体。该发明的原理请见图1。本发明的基本原理以图1以480个样本，5个96孔板为例。分别构建三维(X、Y、Z)混合池。X维混合池为各板混合池，每个混合池含单块96孔板样本个数，即96个样本，本例为板I到板V共5个混合池；Y维混合池为各行混合池，指把板I到板V相同的行所有样本混合构成，1-12行共12个混合池，本例中单个行混合池含5 X 8 = 40个样本；Z维混合池为各列混合池，共A-H共8个混合池，把板 I到V同一列所有DNA样本混合构成，本例中单个列混合池含5X 12 = 60个样本。三维混合池相加共有25个混合池。X、Y、Z三维混合池每一种排列组合的交叉点对应的样本是唯一的，本例中共25个混合池的排列组合是000=5X12X8 = 480，等于本例中总样本个数。利用PCR检测对于DNA模板的灵敏性，分别对各混合池分别作PCR检测，阳性三维混合池检测到交叉点对应的样本为阳性样本。如板II池、B行池与2列池均检测到CrylAb
阳性，则表明IIB2样本为CrylAb阳性样本。以此类推.......同时，对于样本II2B进行
再一次的PCR扩增和检测，以验证该实验的可靠性。因此，鉴定480个样本含有阳性事件检测的工作量为25个PCR反应，而普通单株检测则需要480个反应，本方法检测工作量是分单株检测的5.2%。如果样本数扩大到960个，则为10个96孔板，X维池为10个，而Y维与Z维混合池不变，三维共30个混合池，其检测工作量则为30个反应，而常规则需要960 个反应，工作量为常规方法的3. 13%。本发明方法大大减少了 PCR的反应次数，省时省力， 节约了成本。当前，应加强农业转基因生物安全管理需要，农业监管部门对市场上普通非转基因粮食作物品种推行转基因成份筛查，以避免非转基因品种中含有转基因成份，使所有转基因农作物生产与产品处于可控状态。本发明可以应用于此类检测。受植物遗传转化技术的限制，现有的遗传转化方法的转化效率并不高，一般的遗传转化操作与转基因研究中，也需要从大量样本中筛除阳性样本。尤其是无选择标记，将面临从大量材料中选择阳性个体的步骤，进一步加大的材料筛选的工作量。本发明可以应用于转基因研究之中。本发明也可应用于基于PCR技术从大量样本中筛查阳性个体的任何工作。
图1为DNA混合池法高效筛选阳性PCR检测方法原理。图2为以ddH20与阴性DNA为对照，检测稀释阳性DNA的PCR检测的灵敏性。(a) ddH20稀释阳性DNA的PCR检测(b)阴性DNA稀释阳性DNA的PCR检测M =Marker CK+ 阳性Bt 176 ；ddH20 空白对照；CK_ 阴性对照；数字1 9 阳性样本被ddH20和阴性DNA模板分别稀释 16、26、36、46、56、66、76、86、96 倍。图3为三种混合池的PCR检测。(a) 5个板池的PCR检测(b)各板行池和列池的 PCR检测。M =Marker CK+ 阳性Btl76 ddH20 空白对照；CK—阴性对照I-V 各板混合池A-H 列池1-12 行池。图4为候选阳性样本和阳性样本的单个样本PCR验证检测。(a)候选阳性样本的 PCR检测(b)阳性样本的PCR检测。M:Marker CK+:阳性Btl76 ddH20:空白对照；CK_ 阴性对照数字推测的阳性样本、阳性样本编号。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。Uracil-N-Glycosylase (简称 UNG 酶，Fermentas)、rTaq DNA 聚合酶(TAKARA)、 dNTPs (TIANGEN)、琼脂糖、EB、异丙醇、70 % 的乙醇、分子量 Marker :D2000 (TANGEN)、 10XPCR缓冲液、IX TAE缓冲液、6 X上样缓冲液、TIANGEN快捷型植物基因组DNA提取系统、液氮等。研钵、台式小型离心机、Centrifuge 5415D型离心机(Eppendorf)、天平、SPEXGEN0 2010 GRINDER 高通量组织研磨机(SPEX SamplePreP, USA)、冷藏冰冻冰箱、 C1000 Thermal Cycler型基因扩增仪(Bio-Rad)、电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司)、PCR 超净工作台、Thermo ΝΑΝΟ DR0P2000 型分光光度计(Thermo Scientific, USA)、 微量移液器、凝胶成像系统(Bio-fcid)、Eppendorf管1. 5mL、2mL ；PCR反应管200 μ L。实施例1、DNA模板浓度的计算以5个96孔板混合样本为例计算，本方法中最高混合样本数为各板池，其中有96个样本混合，96个个体中每个二倍体基因组学10倍覆盖，则为2500Mb [Patrick S. Schnable,et al. ,2009. The B73 Maize Genome :Complexity,Diversity,and Dynamics. Science 326 (5956) ,1112.](玉米单倍体基因组)X 2 ( 二倍体)X 10 (覆盖倍数)X96 (混合样本个数)/978 (每 ρ 克 DNA Mb 数)=4907. 97pg = 4. 9ng (lng = 1 X l(T9g) [Dolezel J' Bartos J'Voglmayr H,Greilhuber J(2003). " Nuclear DNA content and genome size of trout and human" . Cytometry A 51 (2) :127-128.]。因此,96 样本混合池中，4. 9ng DNA即包含了每个样本二倍体基因组学10倍覆盖的DNA量，即IOng DNA模板量中约含有 96个样本中每个样本20倍二倍体基因组覆盖的DNA量，理论上排除因DNA混合模板中由于阳性样本DNA缺失而导致的假阴性的可能性，此实验中使用初始浓度为500ng/ μ L进行96 倍混合稀释，每个PCR反应中模板浓度为2. 45ng/ μ L，2 μ L的模板DNA进行PCR反应，满足最低DNA浓度的要求。实施例2、混合样本灵敏度与模板浓度试验一96倍ddH20稀释及96倍样本DNA模板稀释一、材料1、本发明以玉米CrylAb为例说明，玉米CrylAb阳性种子，普通玉米(CrylAb阴性)种子。2、检测转基因玉米外源基因的引物表1中CryIAb。表1、引物信息
权利要求
1.一种从样本群中辅助鉴别转入靶标基因的转基因样本的方法，包括如下步骤1)将待测样本群按照如下方法进行三维排列设置 沿X方向设置m行，即第1行、第2行、……、第m行； 沿Y方向设置η列，即第A列、第B列、……、第η列； 沿Z方向设置ρ层，即第1层、第2层、……、第ρ层； 每层有m行和η列；2)进行如下PCR扩增反应将每层上的所有待测样本的DNA或RNA混合，共有ρ种混合物，每种混合物是m*n个样本的混合物；每种混合物分别作为PCR反应的模板，则共有ρ个PCR反应；若所述P个PCR反应均没有得到目的PCR扩增产物，则候选地确认所述待测样本群中不含有转入靶标基因的转基因样本；若所述P个PCR反应中至少一个PCR反应得到目的PCR扩增产物，则进行如下步骤3)3)进行如下PCR扩增反应将P层的对应的同一行号上的待测样本的DNA或RNA混合，共有m种混合物，每种混合物是P*n个样本的混合物；每种混合物分别作为PCR反应的模板，则共有m个PCR反应；将P层的对应的同一列号上的待测样本的DNA或RNA混合，共有η种混合物，每种混合物是P*m个样本的混合物；每种混合物分别作为PCR反应的模板，则共有η个PCR反应；上述m+n个PCR反应中，得到目的PCR扩增产物的PCR反应所对应的行、列和层的交叉点位置上的样本即候选为转入靶标基因的转基因样本；所述PCR反应均使用相同的引物；所述引物为用于检测所述靶标基因的引物；所述目的PCR扩增产物为所述靶标基因或所述靶标基因的片段。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于m为12，η为8，q为5。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述待测样本的DNA或RNA的浓度均为 500ng/y L0
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于每个PCR反应中的模板DNA或 RNA的体积为2ul，浓度为50ng/y L。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述待测样本为植物、动物或微生物。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述植物为农作物，具体为玉米。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述转入靶标基因的转基因样本为转外源基因CrylAb的玉米。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述引物为如下引物对1)或引物对2) 引物对 1) :SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 所示 DNA 分子；引物对 2) =SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 所示 DNA 分子。
全文摘要
本发明公开了一种筛查转入靶标基因的转基因样本的方法。该方法，包括如下步骤1)将待测样本群按照如下方法进行三维排列设置沿X方向设置m行，沿Y方向设置n列，沿Z方向设置p层，每层有m行和n列；2)进行如下PCR扩增反应将每层上的所有待测样本的DNA或RNA混合，共有p种混合物，每种混合物是m＊n个样本的混合物；每种混合物分别作为PCR反应的模板，则共有p个PCR反应；若所述p个PCR反应均没有得到目的PCR扩增产物，则候选地确认所述待测样本群中不含有转入靶标基因的转基因样本。本发明方法大大减少了PCR的反应次数，省时省力，节约了成本。
文档编号C12Q1/68GK102220429SQ20111012227
公开日2011年10月19日 申请日期2011年5月12日 优先权日2011年5月12日
发明者刘文文, 宋新元, 张世煌, 张德贵, 李新海, 李明顺, 李猛, 白丽, 翁建峰, 谢传晓, 郝转芳 申请人:中国农业科学院作物科学研究所