专利名称：具有双重筛选标记的多形汉逊酵母菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有双重筛选标记的多形汉逊酵母菌及其应用。
背景技术：
酵母菌作为单细胞真核生物，既具有原核生物生长快，遗传操作简单的特点，又具有与高等真核生物相似的基因表达调控和翻译后修饰机制，因此是生物技术领域应用非常广泛的微生物细胞工厂，在大宗发酵产品、精细医药化工原料和蛋白质药物的生产中发挥着重要作用。甲醇营养型酵母是近年来备受关注的一类酵母菌，其中的多型汉逊酵母 (Hansenula polymorpha)因具有以下优势(1)可利用自身强启动子高效启动外源基因的表达；( 非同源重组的频率高，可以使目标基因高拷贝整合到染色体上，易获得高拷贝整合的转化子；C3)表达的外源蛋白通常贮存在过氧化物酶体内，可使其免受胞内蛋白酶的降解，并且降低了对细胞的毒害作用；(4)外源蛋白的表达量和分泌效率比酿酒酵母高 10-100倍，且没有过度糖基化的现象；( 能用廉价的培养基进行高密度发酵，进一步提高外源基因的表达水平；(6)耐高温，最适生长温度为37°C-43°C，生长速率快，大规模发酵的培养时间短、污染率低。因此是目前国际上公认的生产医药用蛋白的理想宿主，适于大规模发酵生产目的蛋白。近期研究发现，汉逊酵母能在较高温度下实现木糖和乙醇的转化，在生物质能转化中糖化发酵同步进行发挥重要功能，因此受到国内外研究者的极大关注。汉逊酵母将不断成为生物技术领域新的微生物细胞工厂。近年来，关于汉逊酵母遗传操作系统的研究取得了较大的进展，但目前的遗传操作系统基本上利用的是单筛选标记，难以满足对该酵母菌进行功能基因组学研究、组合生物合成和代谢工程改造、以及功能蛋白高效表达等的需要。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种尿嘧啶合成和色氨酸合成双缺陷型多形汉逊酵母菌。本发明所提供的尿嘧啶合成和色氨酸合成双缺陷型多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha) HUT-31，其保藏号为 CGMCC No. 4778。本发明的另一个目的是提供一种尿嘧啶合成和色氨酸合成双缺陷型基因工程酵母菌。本发明所提供的尿嘧啶合成和色氨酸合成双缺陷型基因工程酵母菌，为尿嘧啶合成缺陷型酵母菌中的5-磷酸核糖氨基苯甲酸异构酶编码基因的功能丧失，得到的重组菌即为基因工程酵母菌。所述将尿嘧啶合成缺陷型酵母菌中的5-磷酸核糖氨基苯甲酸异构酶编码基因的功能丧失是通过同源重组实现的；所述尿嘧啶合成缺陷型酵母菌为多型汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)
4HU-IICGMCC No. 1218。所述同源重组的方法包括如下步骤向多型汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha) HU-Il中导入序列表中序列2所示的DNA。本发明的又一个目的是提供一种表达外源蛋白的试剂盒。本发明所提供的表达外源蛋白的试剂盒，包括所述的多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HUT-31或所述基因工程酵母菌和酵母表达载体，所述酵母表达载体为如下1) 和/或幻所示1)满足如下条件的酵母表达载体I 将所述酵母表达载体I转入所述的多形汉逊酵母菌(Hansenula p0lym0rpha)HUT-31或所述基因工程酵母菌后，得到的酵母菌能够合成尿嘧啶；2)满足如下条件的酵母表达载体II 将所述酵母表达载体II转入所述的多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HUT-31或所述基因工程酵母菌后，得到的酵母菌能够合成色氨酸。所述酵母表达载体I按照如下方法制备在载体YEp352的多克隆位点上插入由甲醇氧化酶基因启动子ΜΟΧρ、外源蛋白编码基因和醇氧化酶基因终止子AOXlTT依次连接而成的表达盒得到的酵母表达载体；所述酵母表达载体II按照如下方法制备在载体P352HTRP的多克隆位点上插入由甲醇氧化酶基因启动子ΜΟΧρ、外源蛋白编码基因和醇氧化酶基因终止子AOXlTT依次连接而成的表达盒得到的酵母表达载体；所述甲醇氧化酶基因启动子MOXp的核苷酸序列如序列表中序列3第1位到1517 位所示；所述醇氧化酶基因终止子Α0Χ1ΤΤ的核苷酸序列如序列表中序列3第3286位到 3690位所示；所述载体P352HTRP按照如下方法制备将序列表中序列1所示的DNA序列插入表达载体ΥΕρ352的MuI和NdeI酶切位点得到的重组载体。所述的多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha) HUT-31或所述基因工程酵母菌在表达外源蛋白中的应用也属于本发明的保护范围；所述试剂盒在表达外源蛋白中的应用也属于本发明的保护范围。本发明的又一个目的是提供一种表达外源蛋白的方法。本发明所提供的表达外源蛋白的方法，包括如下步骤1)将外源蛋白的编码基因通过酵母表达载体导入所述的多形汉逊酵母菌 (Hansenula polymorpha) HUT-31或所述基因工程酵母菌中，得到重组酵母菌；2)用筛选培养基培养所述重组酵母菌，得到存活的重组酵母菌；3)培养所述存活的重组酵母菌，得到所述外源蛋白；所述步骤1)中的酵母表达载体为酵母表达载体I时，所述步骤2、中的筛选培养基为培养酵母菌的培养基，且其中不含有尿嘧啶但含有色氨酸；所述步骤1)中的酵母表达载体为酵母表达载体II时，所述步骤幻中的筛选培养基为培养酵母菌的培养基，且其中不含有色氨酸但含有尿嘧啶；所述步骤1)中的酵母表达载体为酵母表达载体I和酵母表达载体II时，所述步骤2)中的筛选培养基为培养酵母菌的培养基，且其中不含有色氨酸也不含有尿嘧啶。所述培养酵母菌的培养基为酵母菌基本培养基YNB。一种DNA分子，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。本发明利用小片段同源序列介导的同源重组和整合构建了遗传稳定的、乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURAiB)和5-磷酸核糖氨基苯甲酸异构酶基因(HTRPl)同时被阻断的尿嘧啶和色氨酸双营养缺陷的多形汉逊酵母重组菌，特别是多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HUT-3ICGMCC No. 4778。该菌株同时具有尿嘧啶和色氨酸双营养缺陷筛选标记，并保持了野生型菌株的生理生化特性，有利于重组菌株的培养和外源蛋白的高效表达， 不但可以简单快速筛选到重组菌株，而且双重筛选标记可以提高目标基因在染色体上整合的拷贝数，提高目标蛋白的表达量，具有重要的工业应用价值。同时双重筛选标记也将用于汉逊酵母功能基因组学、合成生物学及代谢工程的多基因遗传修饰。
图1为多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HUT-31的表型分析。图2为质粒ρΜΟΧΖ α -ALP、pMU α A禾口 ρΜΤ α A的物理图谱。图3为重组菌株HUTA-I和HP_A_1产α -淀粉酶能力比较。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用限制性内切酶和T4-DNA连接酶均购自TaKaRa公司；pfu DNA聚合酶mix购自天根生化科技(北京)有限公司。实施例1、多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha) HUT-31的构建及生物学分析一、尿嘧啶和色氨酸合成双缺陷多形汉逊酵母菌的构建1,5-磷酸核糖氨基苯甲酸异构酶基因HTRPl的克隆和序列分析根据已报道的多形汉逊酵母菌的HTRPl的核苷酸序列(GenBank Access No. AY795576自5'末端第1-1010位的脱氧核糖核苷酸所示的序列)，设计的引物序列如下引物1 :5
位点)引物2:5
位点)以多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha) JCM3621 (CGMCC 2. 2498)(购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC)的总DNA为模板，在引物1和引物2 的引导下进行PCR反应扩增HTRPl，PCR反应体系为模板DNA 0. 6yg，引物10. 5μπιο1/ L，引物20. 5ymol/L，pfu DNA聚合酶mix 25 μ L，用去离子水补至50 μ L，混勻；用TECHNE TC-3000PCR仪进行DNA扩增，设置PCR反应条件为94°C 5分钟，循环1次；94°C 40秒， 540C 1分钟，72°C 2分钟，四个循环；94°C 40秒，54°C 1分钟，72°C 15分钟，循环1次。将PCR产物回收并纯化后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明得到了大小约
-ATAAGGCCTCGGAGGATCGCAGGAGACGG-3 ‘(划线部分碱基为 StuI 识别 -TCACATATGCGCCGAGGAGGTCATTGCTG-3 ‘(划线部分碱基为 NdeI 识别1. Ikb的DNA片段，与预期的大小一致，将其命名为HTRPl，其核苷酸序列如序列表中序列1 所示。用StuI和NdeI酶切PCR扩增到的HTRPl，回收约1. 11Λ的DNA片段；同时用 StuI和NdeI酶切穿梭载体YEp352(公众可从中国科学院微生物研究所获得，记载过穿梭载体YEp；352的非专利文献是Hill JE, Meyers AM, Koerner TJ, et al. A yeast/E. coli shuttle vectors with multiple unique restriction sites. Yeast,1993,9 :163-167), 纯化回收约4. 71Λ的载体大片段，在T4DNA连接酶作用下，将回收的载体大片段与回收的 1. Ikb的HTRPl基因片段连接，16°C反应10小时进行连接，得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中，通过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体YEp352的MuI和NdeI酶切位点间插入的DNA序列为序列表中的序列1，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为P352HTRP， P352HTRP的其他元件与载体YEp352相同，但用HTRPl替换了载体YEp352上的&URA3。重组质粒P352HTRP可以互补酿酒酵母的5-磷酸核糖氨基苯甲酸异构酶基因功能缺陷，说明本发明扩增到的多形汉逊酵母菌HTRPl基因是5-磷酸核糖氨基苯甲酸异构酶基因的编码序列，HTRPl编码的5-磷酸核糖氨基苯甲酸异构酶催化色氨酸合成途径中N-(5'-磷酸核糖)-氨基苯甲酸向烯醇式1- (0-羧基苯氨基)-1-脱氧核酮糖-5-磷酸的转化，因此HTRPl 基因被破坏后菌株不能合成色氨酸，产生色氨酸营养缺陷。2、HTRP1基因被破坏的重组DNA的构建根据YEp352质粒上URA3和IacZ基因序列，设计引物，引物序列如下引物 3 5' -TGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCG-3‘(划线部分为 HindIII 识别序列)引物 4 5‘ -ATCGTCGACTAACAAGAGCTTTTCAATTCATC-3‘(划线部分为 SalI 识别序列)以质粒YEp352为模板，在引物3和引物4的引导下进行PCR反应，扩增DNA片段 UZjPCR 反应体系为模板 DNA 0. 6 μ g，引物 30. 5 μ mol/L，引物 40. 5 μ mol/L，pfu DNA 聚合酶mix 25 μ L，用去离子水补至50 μ L，混勻；用TECHNE TC-3000PCR仪进行DNA扩增，设置 PCR反应条件为94°C 5分钟，循环1次；94°C 30秒，1分钟，72°C 2分钟，四个循环； 940C 30秒，540C 1分钟，72°C 15分钟，循环1次。电泳检测PCR产物为约1. 3kb的DNA片段，与预期大小一致，将扩增得到的DNA片段命名为UZ。用HindIII和Mil酶切PCR产物，回收约1. 3kb的UZ片段，同时用HindIII和 MlI酶切载体PUC18 (Takara公司)，回收载体大片段，将回收的载体大片段与回收的1. 3kb 的UZ片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中，通过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体PUC18的HindIII和MlI酶切位点间插入了 UZ片段，证明质粒构建正确，将获得的重组质粒命名为P18UZ。合成引物，序列如下引物 5 -gcttgcagggtaccgagctcgaattctcctgcgagagcttcatgac-3‘，引物 6 -gtcatgaagctctcgcaggagaattcgagctcggtaccctgcaagc-3‘，引物 7 :5' -cgatcacgggcagatcgagaccgcatcaggcgccattcgcc-3‘，引物 8 :5' -ggcgaatggcgcctgatgcggtctcgatctgcccgtgatcg-3‘。以重组质粒p352HTRP为模板，利用引物1和引物5进行PCR扩增HTRPl的5 ‘端约500bp的序列HTRP1-5 ‘，利用引物8和引物2进行PCR扩增HTRPl的3 ‘端约500bp的序列HTRP1-3'；以重组质粒pl8UZ为模板，利用引物6和引物7进行PCR扩增1. 5kb的ZUZ 片断。PCR反应体系为模板DNA 0. 6yg，上游引物0. 5ymol/L，下游引物0. 5ymol/L，pfu DNA聚合酶mix 25 μ L，用去离子水补至50 μ L，混勻；用TECHNETC-3000PCR仪进行DNA扩增，设置PCR反应条件为94°C 5分钟，循环1次；94°C 30秒，54°C 1分钟，72°C 1分钟，29 个循环；94°C 30秒，54°C 1分钟，72°C 15分钟，循环1次。利用PCR清洁试剂盒纯化回收上述三种PCR产物，然后将三种PCR产物等量混合，得到PCR产物混合物；以上述PCR产物混合物为模板，利用引物1和引物2进行PCR扩增，PCR反应体系为模板DNA 0.6yg，引物 10. 5 μ mol/L，引物 20. SymolA^Long-iTaq DNA 聚合酶mix 25 μ L，用去离子水补至 50 μ L， 混勻；用TECHNE TC-3000PCR仪进行DNA扩增，设置PCR反应条件为94°C 5分钟，循环1 次；94°C 30 秒，540C 1 分钟，72°C 3 分钟，29 个循环；94°C 30 秒，54°C 1 分钟，72°C 15 分钟， 循环1次。电泳检测PCR产物有两种，为大小分别为约1. 2kb和2. 5kb的DNA片段，序列分析表明约1. 2kb的小片段为HTRPl基因被破坏的重组DNA，该重组DNA是由179bp的IacZ 序列取代了 HTRPl基因中约60bp的序列形成的重组DNA，将该重组DNA命名为m_HTRPl，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。3、酵母菌遗传转化及尿嘧啶和色氨酸合成双缺陷多形汉逊酵母菌的筛选将重组DNA 片段m-HTRPl 通过电转化法(Bio-Rad Gene-Pulser 仪，1. 5kV,50y F, 200Q,3mSec)转化尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha) HU-1ICGMCC No. 1218 (专利号 ZL200410080517. 2)，在含有 90mg/l 色氨酸、0. 5g/l 2-氨基 ~5~ 氟苯甲酸(5-FAA)的YEPDS培养基(10g/l酵母粉、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖、182g/L山梨醇和 10g/L琼脂粉)平板上筛选转化子。将上述平板上长出的单菌落分别接于无菌水中混勻，室温静置4小时，然后分别接种于酵母菌基本培养基YNB(10g/L葡萄糖、7g/L Yeast Nitrogen Base和10g/L琼脂粉) 平板(A)、添加30mg/l尿嘧啶的YNB平板(B)、添加90mg/l色氨酸的YNB平板(C)和同时添加30mg/l尿嘧啶和90mg/l色氨酸的YNB平板⑶上，37°C培养48小时，获得在同时添加尿嘧啶和色氨酸的YNB平板上能够正常生长，而在YNB培养基、添加30mg/l尿嘧啶的YNB 平板和添加90mg/l色氨酸的YNB平板上不能生长的菌株，将上述菌株在YEPD平板上划线培养，每个菌株挑取20个单菌落分别置于无菌水中，室温静置4小时后，分别接种于上述不同的A、B、C和D筛选培养基平板上，对不同菌株的营养缺陷特性进行进一步验证，获得尿嘧啶合成和色氨酸合成同时被阻断的双缺陷汉逊酵母菌株，记作双缺陷重组酵母菌。用质粒YEp352(带有ScURA； )和p352HTRP (带有HTRP1)共同转化上述双缺陷汉逊酵母菌株，转化菌株能够在不添加尿嘧啶和色氨酸的基本培养基YNB上生长，说明尿嘧啶合成缺陷可以被YEp352的&URA3互补、色氨酸合成缺陷可以被p352HTRP的HTRPl互补，从生物学功能上证明上述双缺陷重组酵母菌(尿嘧啶和色氨酸双缺陷菌)为HURA3和 HTRPl基因功能缺失的汉逊酵母菌。将双缺陷重组酵母菌中的一株命名为多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha) HUT-31。该多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha) HUT-31,已于2011年4月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 4778。其菌落呈凸起状、乳白色、有光泽、边缘整齐，细胞呈椭圆形，该菌株的最适生长温度为37°C，pH 为 5. 5。二、多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HUT-31 表型分析将上述步骤一构建的尿嘧啶和色氨酸双缺陷型多形汉逊酵母菌HUT-31与尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母菌HU-Il分别接种于酵母菌基本培养基YNB平板(A)、添加30mg/ 1尿嘧啶的YNB平板(B)、添加90mg/l色氨酸的YNB平板(C)和同时添加30mg/l尿嘧啶和90mg/l色氨酸的YNB平板(D)上，37°C培养48小时，结果表明多形汉逊酵母菌HUT-31 只能在同时添加尿嘧啶和色氨酸的YNB平板(D)上能够正常生长，而在YNB培养基(A)、添加30mg/l尿嘧啶的YNB平板⑶和添加90mg/l色氨酸的YNB平板(C)上不能生长；而多形汉逊酵母菌HU-Il可在添加30mg/l尿嘧啶的YNB平板⑶和同时添加30mg/l尿嘧啶和 90mg/l色氨酸的YNB平板(D)上正常生长(图1，图1中a为HUT-31和HU-Il在YNB培养基上的生长情况；图1中b为HUT-31和HU-Il在添加30mg/l尿嘧啶的YNB平板上的生长情况；图1中c为HUT-31和HU-Il在添加90mg/l色氨酸的YNB平板上的生长情况；图1中 d为HUT-31和HU-Il在同时添加30mg/l尿嘧啶和90mg/l色氨酸的YNB平板上的生长情况)。三、尿嘧啶和色氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha) HUT-31的生物学特性将尿嘧啶和色氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha) HUT-31 CGMCC No. 4778和尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha) HU-11CGMCC No. 1218分别接种于^iil YEPD液体培养基中，37°C振荡培养16小时；再按10% 接种量转接于10ml YEPD液体培养基中，37°C摇床振荡培养16小时；离心收集菌体细胞，将细胞用无菌水洗两次，重悬于5ml无菌水中，再分别转接于50ml YEPD液体培养基中和50ml YEPM (甲醇代替YEPD中的葡萄糖)液体培养基中，于37°C摇床振荡培养对小时，离心收集细胞，用无菌水洗一次，再次离心后，将收集的细胞沉淀称重，计算其生物量。在以葡萄糖为碳源的YEPD培养基中，培养M小时，尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母菌HU-Il和尿嘧啶和色氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌HUT-31的生物量分别为25. 8g/L和25. 4g/L ；以甲醇为碳源的YEPM培养基中，尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母菌HU-11和尿嘧啶和色氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌HUT-31的生物量分别为23. 5g/L和22. 7g/L。因此尿嘧啶和色氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌HUT-31和尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母菌HU-Il之间在细胞生长特性方面没有明显差异，生长较稳定。四、尿嘧啶和色氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha) HUT-31的遗传稳定性分析将上述步骤一构建的尿嘧啶和色氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HUT-31在YEPD液体培养基中传代培养10次，每次M小时；培养液经IO7稀释后，涂布于YEPD平板，37°C培养48小时，随机挑取100个单菌落分别置于2ml无菌水中， 在室温下饥饿4-6小时；取饥饿后的菌液分别接种于酵母菌基本培养基YNB平板(A)、添加 30mg/l尿嘧啶的YNB平板(B)、添加90mg/l色氨酸的YNB平板(C)和同时添加30mg/l尿嘧啶和90mg/l色氨酸的YNB平板(D)上，37°C培养48小时，结果表明所有单菌落在同时添加尿嘧啶和色氨酸的YNB基本培养基(D)上都生长，在添加30mg/l尿嘧啶的YNB平板(B)、 添加90mg/l色氨酸的YNB平板(C)和酵母菌基本培养基YNB平板(A)上则完全不能生长， 证明本发明构建的多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HUT-31是一株遗传稳定的尿嘧啶和色氨酸双营养缺陷型重组菌株。实施例2、α -淀粉酶在多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HUT-31中的分泌表达一、α -淀粉酶基因ALPl表达质粒的构建根据报道的扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera) α -淀粉酶基因 ALPl的核苷酸序列(GenBank Access No. X79051自5'末端第1530-3030位的脱氧核糖核苷酸所示的序列)设计引物，序列如下引物 9 5 ‘ -CCGAATTCAATATGCAAATTTCAAAAGC-3 ‘，(划线部分碱基为 EcoRI 识别位点)；引物 10 :5' -CATTCTAGAGCCATCATGAACAAATGTCAG-3‘，(划线部分为 XbaI 识别位点)ο以扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)CGMCC No. 2. 16 (购自中国普通微生物保藏管理中心CGMCC)染色体DNA为模板，在引物9和引物10的引导下进行PCR 反应，PCR 反应体系为模板 DNA 0. 6 μ g，引物 90. 5 μ mol/L，引物 100. 5 μ mol/L，pfu DNA 聚合酶mix 25 μ L，用去离子水补至50 μ L，混勻；用TECHNETC-3000PCR仪进行DNA扩增， 设置PCR反应条件为94°C 5分钟，循环1次；94°C 40秒，1分钟，72 °C 2分钟，四个循环；94°C 40秒，54°C 1分钟，72°C 15分钟，循环1次。将PCR产物回收并纯化后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明得到了大小约 1. 51Λ的DNA片段，与预期的大小一致，序列分析表明与文献报道的序列完全一致，将其命名为ALPl。用EcoRI和XbaI酶切PCR产物，回收约1. 5kb的ALPl片段，同时用EcoRI和XbaI 酶切载体pMOXZ-alpha-A (专利申请号200810101801. 1)，回收载体大片段，将回收的载体大片段与回收的1. 5kb的ALPl片段在T4DNA连接酶作用下进行连接，得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中，通过^ocin抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养， 提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pMOXZ-alpha-A的EcoRI和)(baI酶切位点间插入了 ALPl片段，证明质粒构建正确，将获得的重组质粒命名为ρΜΟΧΖ α -ALP。该质粒的物理图谱如图2中A所示。依据载体pMOXZ-alpha-A中MOXp和A0X1TT序列设计引物，序列如下
引物 11 5 ‘ -TCATCGACGCGGAGAACGATCTCCT-3 ‘，引物 12 5 ‘ -ACTGCACAAACGAAGGTCTC-3 ‘。以重组质粒ρΜΟΧΖα-ALP的DNA为模板，在引物11和引物12的引导下进行PCR 反应，PCR 反应体系为模板DNA 0. 6μ g，引物 110. 5ymol/L，引物 120. 5ymol/L，Long-Taq DNA聚合酶mix 25 μ L，用去离子水补至50 μ L，混勻；用TECHNE TC-3000PCR仪进行DNA扩增，设置PCR反应条件为94°C 5分钟，循环1次；94°C 40秒，1分钟，72°C 3分钟，四个循环；94°C 40秒，54°C 1分钟，72°C 15分钟，循环1次。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增到约3. 7kb的DNA片段，与预期大小一致，命名为MOXp- α ALP1-A0X1TT,序列分析表明其核苷酸序列如序列表中序列3所示，其中第1787位到3285位为α-淀粉酶基因ALP1，第1位到1517位为甲醇氧化酶基因启动子ΜΟΧρ，第 3286位到3690位为醇氧化酶基因终止子Α0Χ1ΤΤ。纯化回收约3. 7kb的PCR产物，并将其插入到载体YEp352的SmaI位点，得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中，氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体YEp352的SmaI酶切位点插入了 MOXp- α ALP1-A0X1TT片段，证明质粒构建正确，将获得的重组质粒命名为PMU α A(该质粒的物理图谱如图2中B所示)。同时，将纯化回收的约3. 7kb的PCR产物插入到载体P352HTRP的SmaI位点，得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中，氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养， 提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体P352HTRP的SmaI酶切位点插入了 MOXp- α ALP1-A0X1TT片段，证明质粒构建正确，将获得的重组质粒命名为ρΜΤ α Α(该质粒的物理图谱如图2中C所示)。获得的重组质粒pMU α A和重组质粒ρΜΤ α A均带有表达框 MOXp- α ALP1-A0X1TT，其中重组质粒pMU α A带有ScURA3筛选标记，重组质粒ρΜΤ α A带有 HTRPl筛选标记。二、酵母遗传转化及重组汉逊酵母的构建1、尿嘧啶营养缺陷互补筛选转化子用SacII酶切重组质粒pMUa A使质粒线性化。将线性化的质粒pMU a A通过电转化法(Bio-I ad Gene-Pulser 仪，1. 5kV，50y F，200Q，3n^ec)转化多形汉逊酵母菌 (Hansenula polymorpha) HUT-31，在含有90mg/l色氨酸的酵母菌基本培养基YNB (10g/L葡萄糖、7g/L Yeast Nitrogen Base和10g/L琼脂粉)平板上，通过尿嘧啶营养缺陷互补筛选转化子，在该培养基上存活的重组酵母菌即为目的重组酵母菌(即尿嘧啶营养缺陷互补的转化子)。挑取多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HUT-31和尿嘧啶营养缺陷互补的转化子单菌落置于Iml无菌水中，在室温条件下饥饿4-6小时，取饥饿后的菌液分别接种于酵母菌基本培养基YNB平板(A)、添加30mg/l尿嘧啶的YNB平板(B)、添加90mg/l色氨酸的 YNB平板(C)和同时添加30mg/l尿嘧啶和90mg/l色氨酸的YNB平板⑶上，37°C培养48 小时，结果宿主菌HUT-31只能在同时添加30mg/l尿嘧啶和90mg/l色氨酸的YNB平板⑶ 上生长，而转化子单菌落可在添加90mg/l色氨酸的YNB平板(C)和同时添加30mg/l尿嘧啶和90mg/l色氨酸的YNB平板⑶上正常生长，说明重组质粒pMU α A上的ScURA3互补了宿主菌HUT-31中的尿嘧啶合成缺陷。将宿主菌HUT-31和转化菌分别接于10ml YPG培养基(2g/100ml蛋白胨，lg/100ml 酵母粉，lml/100ml甘油)中，37°C，200rpm培养20小时，离心收集细胞，无菌水洗两次后， 细胞重悬于10ml YPM培养基(2g/100ml蛋白胨，lg/100ml酵母粉，lml/100ml甲醇)中， 37°C，200rpm进行诱导培养72小时，每M小时补加甲醇至终浓度为0. 5ml/100ml。每 M小时取发酵液，通过3，5-二硝基水扬酸法测定发酵液中α-淀粉酶活性(Miller几， Glennon WE,Burton AL. Measurement of carboxymethylcellulase activity. Analytical Biochemistry, 1960, 2 :127-132)。在宿主菌发酵液中没有检测到α-淀粉酶活性，但在转化菌株中检测到α-淀粉酶活性，诱导培养72小时后α-淀粉酶活性水平为2300IU/ L4600IU/L，其中上清液中的酶活力为总活力的91%。将发酵液中α-淀粉酶活性最高的
11转化菌株命名为多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha) HUTA-I。2、色氨酸营养缺陷互补筛选转化子用SacII酶切重组质粒ρΜΤ α A使质粒线性化。将线性化的质粒ρΜΤ α A通过电转化法(Bio-Rad Gene-Pulser仪，1. 5kV，50 μ F，200 Ω，3n^ec)转化上述构建的尿嘧啶营养缺陷互补的多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HUTA-I，在酵母菌基本培养基 YNB(10g/L葡萄糖、7g/L Yeast Nitrogen Base和10g/L琼脂粉)上，通过尿嘧啶和色氨酸营养缺陷互补筛选转化子，在该培养基上存活的重组酵母菌即为目的重组酵母菌(即尿嘧啶和色氨酸双营养缺陷互补的转化子)。分别挑取尿嘧啶和色氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌HUT-31、尿嘧啶营养缺陷互补的多形汉逊酵母菌HUTA-I和尿嘧啶和色氨酸双营养缺陷互补的转化子单菌落置于 Iml无菌水中，在室温条件下饥饿4-6小时，取饥饿后的菌液分别接种于酵母菌基本培养基 YNB平板(A)、添加30mg/l尿嘧啶的YNB平板(B)、添加90mg/l色氨酸的YNB平板(C)和同时添加30mg/l尿嘧啶和90mg/l色氨酸的YNB平板(D)上，37°C培养48小时。结果尿嘧啶和色氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌HUT-31只能在同时添加30mg/l尿嘧啶和90mg/ 1色氨酸的YNB平板(D)上生长，尿嘧啶营养缺陷互补的多形汉逊酵母菌HUTA-I可在添加 90mg/l色氨酸的YNB平板(C)和同时添加30mg/l尿嘧啶和90mg/l色氨酸的YNB平板(D) 上正常生长，尿嘧啶和色氨酸双营养缺陷互补的转化子在上述四种上述不同的A、B、C和D 培养基上均可生长。说明通过线性化重组质粒PMU α A和重组质粒ρΜΤ α A的遗传转化，使多形汉逊酵母菌HUT-31的尿嘧啶和色氨酸合成缺陷同时得到互补。按前述3，5-二硝基水扬酸法测定多形汉逊酵母菌HUT-31、多形汉逊酵母菌 HUTA-I和尿嘧啶和色氨酸双营养缺陷互补的转化菌株发酵液中α -淀粉酶活性，在多形汉逊酵母菌HUT-31发酵液中没有检测到α -淀粉酶活性，但在多形汉逊酵母菌HUTA-I和尿嘧啶和色氨酸双营养缺陷互补的转化菌株中均检测到α-淀粉酶活性。诱导培养72小时后，多形汉逊酵母菌HUTA-I发酵液中α -淀粉酶活性水平为^30IU/L，尿嘧啶和色氨酸双营养缺陷互补的转化菌株发酵液中的α-淀粉酶活力为2710IU/L-3060IU/L。将发酵液中 α-淀粉酶活性最高的尿嘧啶和色氨酸双营养缺陷互补的转化菌株命名为多形汉逊酵母菌 (Hansenula polymorpha)HP-A-1。三、表达淀粉酶的不同重组汉逊酵母产酶特性比较将多形汉逊酵母菌HUTA-I和多形汉逊酵母菌HP-A-I分别接于10ml YPG培养基中，37°C，200rpm培养16小时，离心收集细胞，无菌水洗两次后，细胞重悬于IOmlYPM培养基中，按10%接种量转接到装有45ml YPM培养基的250ml三角瓶中，37°C，200rpm进行诱导培养96小时，每M小时补加甲醇至终浓度为0. 5ml/100ml。每12小时取发酵液，按前述 3. 5-二硝基水扬酸法测定α-淀粉酶活性。实验设三次重复。结果多形汉逊酵母菌HUTA-I 和多形汉逊酵母菌HP-A-I均在诱导培养72小时后α -淀粉酶活性达到最高，而且在整个检测时间范围内，多形汉逊酵母菌HP-A-I发酵液中的α -淀粉酶活性均高于多形汉逊酵母菌HUTA-I，而两菌株细胞生长趋势基本一致，生物量没有明显差异(图3)。
权利要求
1.尿嘧啶合成和色氨酸合成双缺陷型多形汉逊酵母菌(Hansenulapolymorpha) HUT-31，其保藏号为 CGMCC No. 4778。
2.一种尿嘧啶合成和色氨酸合成双缺陷型基因工程酵母菌，为将尿嘧啶合成缺陷型酵母菌中的5-磷酸核糖氨基苯甲酸异构酶编码基因的功能丧失，得到的重组菌即为尿嘧啶合成和色氨酸合成双缺陷型基因工程酵母菌。
3.根据权利要求2所述的基因工程酵母菌，其特征在于所述将尿嘧啶合成缺陷型酵母菌中的5-磷酸核糖氨基苯甲酸异构酶编码基因的功能丧失是通过同源重组实现的；所述尿嘧啶合成缺陷型酵母菌为多型汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha) HU-IICGMCC No. 1218。
4.根据权利要求2或3所述的基因工程酵母菌，其特征在于所述同源重组的方法包括如下步骤向多型汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-Il中导入序列表中序列2所示的DNA。
5.一种表达外源蛋白的试剂盒，包括权利要求1所述的多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha) HUT-31或权利要求2_4中任一所述基因工程酵母菌和酵母表达载体，所述酵母表达载体为如下1)和/或2、所示1)满足如下条件的酵母表达载体I将所述酵母表达载体I转入权利要求1所述的多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HUT-31或权利要求2_4中任一所述基因工程酵母菌后，得到的酵母菌能够合成尿嘧啶；2)满足如下条件的酵母表达载体II将所述酵母表达载体II转入权利要求1所述的多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha) HUT-31或权利要求2_4中任一所述基因工程酵母菌后，得到的酵母菌能够合成色氨酸。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述酵母表达载体I按照如下方法制备在载体YEp352的多克隆位点上插入由甲醇氧化酶基因启动子ΜΟΧρ、外源蛋白编码基因和醇氧化酶基因终止子AOXlTT依次连接而成的表达盒得到的酵母表达载体；所述酵母表达载体II按照如下方法制备在载体P352HTRP的多克隆位点上插入由甲醇氧化酶基因启动子ΜΟΧρ、外源蛋白编码基因和醇氧化酶基因终止子AOXlTT依次连接而成的表达盒得到的酵母表达载体；所述甲醇氧化酶基因启动子MOXp的核苷酸序列如序列表中序列3第1位到1517位所示；所述醇氧化酶基因终止子AOXlTT的核苷酸序列如序列表中序列3第3286位到3690 位所示；所述载体P352HTRP按照如下方法制备将序列表中序列1所示的DNA序列插入表达载体ΥΕρ352的MuI和NdeI酶切位点得到的重组载体。
7.权利要求1所述的多形汉逊酵母菌(Hansenulapolymorpha) HUT-31或权利要求2_4 中任一所述基因工程酵母菌在表达外源蛋白中的应用；或权利要求5所述试剂盒在表达外源蛋白中的应用。
8.—种表达外源蛋白的方法，包括如下步骤1)将外源蛋白的编码基因通过酵母表达载体导入权利要求1所述的多形汉逊酵母菌 (Hansenula polymorpha) HUT-31或权利要求2_4中任一所述基因工程酵母菌中，得到重组酵母菌；2)用筛选培养基培养所述重组酵母菌，得到存活的重组酵母菌；3)培养所述存活的重组酵母菌，得到所述外源蛋白；所述步骤1)中的酵母表达载体为酵母表达载体I时，所述步骤幻中的筛选培养基为培养酵母菌的培养基，且其中不含有尿嘧啶但含有色氨酸；所述步骤1)中的酵母表达载体为酵母表达载体II时，所述步骤幻中的筛选培养基为培养酵母菌的培养基，且其中不含有色氨酸但含有尿嘧啶；所述步骤1)中的酵母表达载体为酵母表达载体I和酵母表达载体II时，所述步骤2) 中的筛选培养基为培养酵母菌的培养基，且其中不含有色氨酸也不含有尿嘧啶。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述培养酵母菌的培养基为酵母菌基本培养基YNB。
10.一种DNA分子，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。
全文摘要
本发明公开了具有双重筛选标记的多形汉逊酵母菌及其应用。本发明所提供的具有双重筛选标记的多形汉逊酵母为尿嘧啶合成和色氨酸合成双缺陷型多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HUT-31，其保藏号为CGMCC No.4778。该菌株同时具有尿嘧啶和色氨酸双营养缺陷筛选标记，并保持了野生型菌株的生理生化特性，有利于重组菌株的培养和外源蛋白的高效表达，不但可以简单快速筛选到重组菌株，而且双重筛选标记可以提高目标基因在染色体上整合的拷贝数，提高目标蛋白的表达量，具有重要的工业应用价值。同时双重筛选标记也将用于汉逊酵母功能基因组学、合成生物学及代谢工程的多基因遗传修饰。
文档编号C12N1/16GK102226154SQ20111012227
公开日2011年10月26日 申请日期2011年5月12日 优先权日2011年5月12日
发明者何秀萍, 张博润, 郭雪娜 申请人:中国科学院微生物研究所