专利名称：一种克隆类病毒全基因序列的方法
技术领域：
本发明属于类病毒的基因工程领域，涉及一种克隆植物类病毒全基因序列的方法，特别是涉及克隆马铃薯纺锤块茎类病毒属(Pospiviroid)全基因序列的方法。
背景技术：
类病毒(viroid)是迄今为止发现的最小病原物，是一类单链共价闭合环状的裸露RNA分子，由246 400个核苷酸组成，是目前已知的最小的能够自我复制的遗传单位， 不编码任何蛋白质，因此是一类不同于病毒的低分子致病因子，危害高等植物可造成严重经济损失。目前发现的类病毒有30种，其中有26种属中央保守区、无核酶活性的马铃薯纺锤块茎类病毒科(Pospiviroidae)和4种属无中央保守区、有核酶活性的鳄梨日斑类病毒科(Avsunviroidae)。马铃薯纺锤块茎类病毒科(Pospiviroidae)可分为马铃薯纺锤块茎类病毒属(Pospiviroid)、苹果锈果类病毒属(Apscaviroid)、锦紫苏类病毒属 (Coleviroid)、椰子死亡类病毒属(Cocadviroid)、啤酒花矮化类病毒属(Hostuviroid)等 5个属，其中马铃薯纺锤块茎类病毒属(Pospiviroid)为最大的属，有PSTVd、TCDVd、CEVd、 TPMVcU MPVcU CSVcU TASVd, IrVd, CLVd 等 9 个种(Flores et al, Annu. Rev. Phytopathol, 2005. 43 117-139)。Bostan等针对马铃薯纺锤块茎类病毒属的保守序列设计了一对引物能检测其中除 CLVd 外的 8 个种(Bostan et al，Journal of Virological Methods, 2004, 116(2) :189-193)，片段长度因类病毒种不同而不同，都在200bp左右。目前，根据类病毒环状RNA的特点和RT-PCR克隆存在引物与模板个别碱基错配造成获得的全基因序列不准确的特点，为确保克隆序列的准确性，RT-PCR克隆类病毒全基因序列时多根据已知类病毒基因序列的2个保守区域设计两对重叠部分序列的正方向引物， 进行两次RT-PCR克隆，获得2个全长序列，相互验证，去掉引物序列和重复序列，以获得准确的全长序列(Behjatnia et al, Phytopathology, 1996,86 (8) :880_886)。因此，需要进行两次RT-PCR克隆，既费时，又费试剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高准确率、一次完成类病毒全基因序列克隆的方法， 且能用一对引物克隆马铃薯纺锤块茎类病毒属(Pospiviroid)中的大部分类病毒种的全基因序列。本发明的目的是通过以下技术方案实现的。一种克隆类病毒全基因序列的方法，包括以下步骤1)类病毒基因组RNA的获得；2)以步骤1)得到的类病毒基因组RNA为模板，通过反转录，得到引物之间的目标序列加上至少一个类病毒全基因组序列长度的cDNA ；3)以步骤2)得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，回收、纯化PCR产物，克隆、测序；4)通过比对、分析序列获得类病毒全长基因序列。
一种克隆马铃薯纺锤块茎类病毒属类病毒全基因序列的方法，包括以下步骤(1)选择感 染马铃薯纺锤块茎类病毒属类病毒的植物植株顶部的幼嫩叶片， SDS-LiCL方法提取植物总RNA和类病毒RNA ；(2)以反向引物 5，-AGCTTCAGTTGTTTCCACCGGGT-3，作为 RT 引物，以步骤(1)提取的基因组RNA为模板，通过反转录获得cDNA产物；(3)PCR扩增与片段回收以 5' -ATTAATCCCCGGGGAAACCTGGAG-3 ‘ 为正向弓I 物， 5，-AGCTTCAGTTGTTTCCACCGGGT-3，为反向引物，以步骤(2)得到的cDNA为模板，进行PCR 扩增；(4)纯化PCR产物克隆，测序，通过比对、分析序列获得类病毒全长基因序列。步骤(2)所述的RT 反应体系5 X RT buffer :2 μ 1，0. IM 的 DTT :1 μ 1，100 μ g/L 的 RT 反向引物0. 5μ l，5mM 的 dNTPs :2μ 1，RNasin 酶:10U，M-MLV RT 酶:100U，超纯水补至 7· 5μ 1 ；反应程序0.2μ g/μ 1 的 RNA 2. 5 μ 1 65°C变性 8min，冰浴 3min，加 7. 5 μ 1 的 RT-反应体系，42 °C水浴至少Ih，95°C温浴2min终止反应，获得cDNA产物。步骤(3)所述的PCR反应体系不含Mg2+的IOXbuffer :2· 5 μ 1，100 μ g/L的正、 反向引物各 0. 5μ l，5mM 的 dNTPs 1 μ l,25mM 的 MgCl2 :1· 5μ l，Taq 酶 1U, cDNA 2 μ 1，超纯水补至25 μ 1 ；PCR扩增程序92°C 5分钟预变性后，30个PCR循环参数为95°C 30秒，56V 5个循环30秒，540C 5个循环30秒，520C 10个循环30秒，50°C 10个循环30秒，72V 60秒，最后72°C 10分钟。 步骤⑷PCR扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳，挑取560bp附近的条带，试剂盒回收、纯化PCR产物。为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是利用Bostan等(Bostan et al, Journal of Virological Methods, 2004,116(2) 189-193)设计的检测马铃薯纺锤块茎类病毒属类病毒的RT-PCR引物作为PCR引物。引物序列如下正向引物，5，-ATTAATCCCCGGGGAAACCTGGAG-3，反向引物，5，-AGCTTCAGTTGTTTCCACCGGGT-3，以反向引物5，-AGC TTC AGT TGT TTC CAC CGG GT-3，作为RT引物。用此引物进行反转录时，由于类病毒是长为246-400bp的环状RNA分子，只要反转录的时间足够长， 反转录能绕着环状RNA分子不断进行，所得到的cDNA长度会超过其类病毒全基因组序列的长度，在进行PCR时，会出现多个大小不同的目的片段(即两个引物之间的序列)，除最短的200bp左右的目的片段外，其他片段均包含了 200bp左右的目的片段和1个或多个全长序列，回收包含200bp左右和1个全长序列的目的片段，通过克隆、测序、比对，为提高准确率，去掉两端引物起始部分序列，再去掉重复序列，可获得类病毒全基因序列。由于此正反向引物能与马铃薯纺锤块茎类病毒属(Pospiviroid)中8种类病毒都能很好的配对，因此能用于克隆马铃薯纺锤块茎类病毒属(Pospiviroid)中的大部分类病毒的全基因序列。
图1为RT-PCR扩增PSTVd产物凝胶电泳结果M =DNA ladder ；H 健康对照植株；1，2为PSTVd感染植株材料。
具体实施例方式以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。实施例1本发明选择马铃薯纺锤状块茎类 病毒(Potato spindle tuber viroid，PSTVd)作为研究对象，采用该方法一次性完成其全长基因组序列的克隆测序，其步骤如下(1)选择感染PSTVd的马铃薯植株顶部的幼嫩叶片，SDS-LiCL方法提取总RNA (包括植物总RNA和类病毒RNA)；(2)以反向引物 5，-AGCTTCAGTTGTTTCCACCGGGT-3，作为 RT 引物，以提取的总 RNA
为模板，进行反转录。反应体系，7.5μ1 RT-mix :5XRT buffer 2 μ 1,0. IM DTT 1 μ 1，RT 引物(100 μ g/ L) 0. 5 μ 1，dNTPs (5mM) 2 μ 1，RNasin 酶 10U, M-MLV RT 酶 100U,超纯水补至所需体积。反应程序，2.5 μ 1 RNA(0. 5μ g)65°C变性 8min，冰浴 3min，加 7· 5 μ 1 RT-mix, 42°C 水浴Ih，95°C温浴2min终止反应，获得cDNA产物。(3) PCR扩增与片段回收以 5，-ATTAATCCCCGGGGAAACCTGGAG-3， 为正向弓I 物， 5，-AGCTTCAGTTGTTTCCACCGGGT-3，为反向引物，cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物用 0. 8%琼脂糖凝胶电泳，挑取560bp左右的条带，试剂盒回收、纯化PCR产物(图1)。25 μ 1 PCR 反应体系10Xbuffer (不含 Mg2+) 2. 5 μ 1，正、反向引物(100 μ g/L)各 0. 5 μ 1, dNTPs (5mM) 1 μ 1，MgCl2 (25mM) 1. 5 μ 1，Taq 酶 1U，cDNA 2 μ 1，超纯水补至所需体积。PCR扩增程序92°C 5分钟预变性后，30个PCR循环参数为95°C 30秒，56_50°C 30 秒(5615个循环，5415个循环，521 10个循环，50°C 10个循环)，72°C 60秒，最后72°C 10 分钟。(3)用Qiagen克隆试剂盒将纯化的560bp左右的PCR产物克隆、测序。测序结果
如下
A TTAA TCCCCaaadAAA CCTGGA 6ΤΟΑΑΓΤΓ,ΓμΓΑΑΑΑΑΑΓΜΓ.ΑΓΓ,ΓΜΤΓ.Γ.Γ,Γ,ΑΓΜΤΓ.ΓΓ
CAGCGGCCGACAGGAGTAATTCCCGCCGAAACAGGGTTTTCACCCTTCCTTTCTT
CGGGTGTCCTTCCTCGCGCCCGCAGGACCACCCCTCGCCCCCTTTGCGCTGTCGC
TTCGGCTACT_4QCQGdeiO_i4CHGTd4ii.CICCCGAGAACCGCTTTTTCTCTA
TCTTACTTGCTTCGGGGCGAGGGTGTTAATCCCTTGGAACCGCAGTTGGTTCCTC
GGAAGTTAACTCGTGGTTCCTGTGGTTCACACCTGACCTCCTGAGCAGAAAAGAA ΑΑΑΑΓμΑΑΓΜΓτΓΓτΓΜΓΤΓΓΜΓΜΑΓτΓτΑΓΜΓΓΜΓΤΤΓΑΓτΓΜΓΜΑΤΓΓΓΓΓΜΓτΓτΓΜΑΑΑΓΓΤΓΜΓΜΑΓτ
CGAACTGGCAAAAAAGGACGGTGGGGAGTGCCCAGCGGCCGACAGGAGTAATTCCCGCCGAAACAGGGTTTTCAC CCTTCCTTTCTTCGGGTGTCCTTCCTCGCGCCCGCAGGACCACCCCTCGCCCCCTTTGCGCTGTCGCTTCGGCT
ACT lCO^H^MidOMCXi^MGO:
全长序列为558bp，两端斜体标注的序列为引物序列，斜体下划双线为正向引物序列，斜体下划虚线为反向引物序列，正体下划双线为正向引物同源序列，正体下划虚线为反 向弓丨物同源序列，整个序列比PSTVd全长序列重复了一个199bp的序列(lbp-199bp，包含了正向引物序列，正向引物前四个碱基ATTA与PSTVd不配对)。为减少RT和PCR弓丨物与模板个别碱基错配造成获得的全基因序列不准确的可能性，去除两端的引物和重复序列，取字符底纹(描灰)标记的序列，全长为359bp，为PSTVd基因组全长序列。
CGAACTGGCAAAAAAGGACGGTGGGGAGTGCCCAGCGGCCGACAGGAGTAATTC CCGCCGAAACAGGGTTTTCACCCTTCCTTTCTTCGGGTGTCCTTCCTCGCGCCCG CAGGACCACCCCTCGCCCCCTTTGCGCTGTCGCTTCGGCTACT 丛XX:匹工匹 M4 弘 TCCCGAGAACCGCTTTTTCTCTAT(:ttacttG(:tt(:gggGCGAGG GTGTTAATCCCTTGGAACCGCAGTTGGTTCCTCGGAAGTTAACTCGTGGTTCCTG TGGTTCACACCTGACCTCCTGAGCAGAAAAGAAAAAAGAAGGCGGCTCGGAGGA ΓμΓΓΜΓΤΤΓΑΓΜΓΜΓ.ΑΤΓΓΧΧ:Γ.Γ,ΓΜΓΜΑΑΑΓΓΤΓ.ΓΜΑΓΜ由于类病毒为环状RNA，通过Blast比对将其序列转换为与GenBank中类病毒序列类似的序列。CGGAAGTTAACTCGTGGTTCCTGTGGTTCACACCTGACCTCCTGAGCAGAAAAGAAAAAA GAAGGCGGCTCGGAGGAGCGCTTCAGGG ATCCCCGGGGAAACCTGGAG CGAACTGGCA AAAAAGGACGGTGGGGAGTGCCCAGCGGCCGACAGGAGTAATTCCCGCCGAAACAGGGTTTTCACCCT TCCTTTCTTCGGGTGTCCTTCCTCGCGCCCGCAGGACCACCCCTCGCCCCCTTTGCGCTGTCGCTTC-GGCTACT ^i^i^O^HSiiAAAO^AdGAAi^lCCCGAGAACCGCTTTTTCTCTATCTTACTTGCTTCG GGGCGAGGGTGTTAATCCCTTGGAACCGCAGTTGGTTCCT
权利要求
1.一种克隆类病毒全基因序列的方法，其特征在于，包括以下步骤1)类病毒基因组RNA的获得；2)以步骤1)得到的类病毒基因组RNA为模板，通过反转录，得到引物之间的目标序列加上至少一个类病毒全基因组序列长度的cDNA ；3)以步骤2)得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，回收、纯化PCR产物，克隆、测序；4)通过比对、分析序列获得类病毒全长基因序列。
2.一种克隆马铃薯纺锤块茎类病毒属类病毒全基因序列的方法，其特征在于，包括以下具体步骤(1)选择感染马铃薯纺锤块茎类病毒属类病毒的植物植株顶部的幼嫩叶片，SDS-LiCL 方法提取植物总RNA和类病毒RNA ；(2)以反向引物5’-AGCTTCAGTTGTTTCCACCGGGT-3’作为RT引物，以步骤(1)提取的基因组RNA为模板，反转录获得cDNA产物；(3)PCR扩增与片段回收以 5，-ATTAATCCCCGGGGAAACCTGGAG-3，为正向引物，5，-AGCTTCAGTTGTTTCCACCGGGT-3， 为反向引物，以步骤⑵得到的cDNA为模板，进行PCR扩增；(4)纯化PCR产物克隆，测序，通过比对、分析序列获得类病毒全长基因序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤⑵所述的 RT 反应体系5XRT buffer :2μ 1，0. IM 的 DTT :1μ Ι,ΙΟΟμ g/L 的 RT 反向引物0. 5μ l，5mM 的 dNTPs :2μ 1，RNasin 酶:10U，M-MLV RT 酶:100U，超纯水补至 7. 5μ 1 ；反应程序0. 2 μ g/ μ 1的RNA 2. 5 μ 1 65°C变性8min，冰浴3min，力Π 7. 5 μ 1的RT反应体系，42 °C水浴至少Ih，95°C温浴2min终止反应，获得cDNA产物。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤⑶所述的PCR反应体系不含Mg2+的IOXbuffer 2. 5 μ 1，100 μ g/L的正、反向引物各 0. 5μ l，5mM 的 dNTPs 1 μ l,25mM 的 MgCl2 :1· 5μ l，Taq 酶 1U, cDNA 2 μ 1，超纯水补至 25μ 1 ；PCR扩增程序92°C 5分钟预变性后，30个PCR循环参数为95°C 30秒，56°C 5个循环 30秒，54°C 5个循环30秒，52°C 10个循环30秒，50°C 10个循环30秒，72°C 60秒，最后 72 0C 10 分钟。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4) PCR扩增产物用0. 8%琼脂糖凝胶电泳，挑取560bp附近的条带，试剂盒回收、 纯化PCR产物。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的马铃薯纺锤块茎类病毒属类病毒包括PSTVd、TCDVd, CEVd, TPMVd, MPVd, CSVd, TASVd 或 IrVd0
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的马铃薯纺锤块茎类病毒属类病毒为 PSTVd。
全文摘要
本发明公开了一种克隆类病毒全基因序列的方法，包括以下步骤1)类病毒基因组RNA的获得；2)以步骤1)得到的类病毒基因组RNA为模板，通过反转录，得到引物之间的目标序列与至少一个类病毒全基因组序列长度的cDNA；3)以步骤2)得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，回收、纯化PCR产物，克隆、测序；4)通过比对、分析序列获得类病毒全长基因序列。本发明是一种高准确率、一次完成类病毒全基因序列克隆的方法，且能用一对引物克隆马铃薯纺锤块茎类病毒属(Pospiviroid)中的大部分类病毒种的全基因序列，为克隆类病毒全基因序列提供了新的途径。
文档编号C12R1/94GK102226195SQ20111012236
公开日2011年10月26日 申请日期2011年5月12日 优先权日2011年5月12日
发明者何长征, 刘明月, 宋勇, 李炎林, 熊兴耀, 秦玉芝, 胡新喜, 黄科 申请人:湖南农业大学