包含来自于四株流感病毒的抗原的疫苗的制作方法

专利名称：包含来自于四株流感病毒的抗原的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于防御流感病毒感染的疫苗流域，特别是包含来自于3株以上病毒 的抗原的疫苗。
发明描述
申请人已经认识到目前所用的三价疫苗所具有的许多缺陷都是因为在其生 产过程中使用鸡蛋造成的。从订货交付时间和产量量方面来说，以鸡蛋为基础的 生产不能很好地适用于提高抗原量，而这是特定季节所需要的。目前以鸡蛋为基 础的生产方法要求病毒能适应在鸡蛋内生长，而这会延长开始生产时的耗时期，
并且会引入选择压力而降低疫苗株与流行株之间的匹配程度。另外，B型流感毒 株不能在鸡蛋内良好生长，高增长的重组子无法获得。2003/04季的H3N2错配 已经很好地证明了目前的方法绝对需要在鸡蛋内生长，这主要是由于相关的Fuji 样毒株最初不是用鸡蛋分离的而引起的。为了克服这些缺陷，可用细胞培养物代 替鸡蛋来培养病毒。因此，在某些实施方式中，本发明的疫苗是用在细胞培养物 而不是在鸡蛋中生长的病毒制备的。
以鸡蛋为基础的技术无法提高特定季节所需要的抗原产量也可以通过降低 疫苗的抗原使用量来解决。减少抗原量的一种途径是使用佐剂。因此，在某些实 施方式中，本发明的疫苗包含佐剂。
在某些实施方式中，疫苗所含各流感毒株的血凝素(HA)的含量基本相同(例 如，约1:1:1:1)。每株的HA的含量约为15pg/剂，或者在某些实施方式中低于15pg/ 剂(例如，低于10ng/剂)或高于15pg/剂(例如，》Opg/剂、〉25(ig/剂等，如约30pg/ 剂)。在某些实施方式中，疫苗内所含的不同毒株HA的含量不同。
在某些实施方式中，疫苗不是裂解或完整病毒体的灭活疫苗，而是活的或纯 化的糖蛋白疫苗。
因此，本发明提供了包含来自于至少四株流感病毒的抗原的疫苗，其中至少 一株病毒是在细胞培养物内生长的。优选的是所有毒株都是在细胞培养物内生长的。
本发明还提供了包含来自于至少四株流感病毒的抗原的疫苗，所述疫苗不含
卵清蛋白(ovalbumin)。该组合物还可以不含其他鸡蛋蛋白(例如卵类粘蛋白 (ovomuoid))和鸡DNA。
本发明还提供了生产疫苗的方法，该方法包括步骤(i)在细胞培养物内培养
四种不同的流感毒株；(ii)从步骤(i)培养的每一毒株制备抗原组合物；以及(iii)将
抗原组合物(例如与药用载体混合)混合以生产疫苗。
本发明还提供了包含来自于至少四株流感病毒的抗原并包含佐剂的疫苗。
本发明还提供了生产疫苗的方法，该方法包括步骤(i)培养四种不同的流感 毒株；(ii)从步骤(i)培养的每一毒株制备抗原组合物；以及(iii)将抗原组合物与佐 剂和药用载体混合以生产疫苗。
本发明还提供了包含来自于至少四株流感病毒的抗原的疫苗，其中的抗原不 是裂解或完整病毒体。抗原可以是活流感病毒或纯化的糖蛋白，g卩，疫苗包含来 自于至少四株流感病毒的纯化血凝素。
本发明还提供了生产疫苗的方法，该方法包括步骤(i)培养四种不同的流感 毒株；(ii)从步骤(i)扩增的每一毒株制备抗原组合物，所述抗原组合物既不是裂解 病毒体也不是完整病毒体；以及(iii)将抗原组合物与佐剂和药用载体混合以生产疫苗。
本发明还提供了包含来自于至少四株流感病毒的抗原的疫苗，其中疫苗所含 各流感毒株的血凝素(HA)的含量基本相同。每一毒株的HA的含量与平均HA含 量/株的差值在所述平均值的10%以内。较好的是，所述含量为15pg/株。
本发明还提供了包含来自于至少四株流感病毒的抗原的疫苗，所述疫苗包含 a )ig来自于第一毒株的血凝素(HA)、 b)ig第二毒株的HA、 cng第三毒株的HA 和dpg第四毒株的HA，其中，a和b基本相同，c和d基本相同，但是a和c显 著不同。a和b的值与a和b的平均值("a/b平均值")的差值在该平均值的10% 以内。c和d的值与c和d的平均值("c/d平均值")的差值在该平均值的10%以 内。a/b平均值与c/d平均值之间的差异为两者中低值的至少25。/。(例如，至少330/0、 至少40%、至少50%)。
本发明还提供了包含来自于至少四株流感病毒的抗原的疫苗，所述疫苗包含 a ng来自于第一毒株的血凝素(HA)、 bpg第二毒株的HA、 cpg第三毒株的HA 和dngHA第四毒株的，其中a、 b和c基本相同，都与d显著不同。a、 b、 c的 值与a、 b、 c的平均值("a/b/c平均值")的差值在该平均值的10%以内。d与a/b/c/平均值之间的差值为a/b/c/平均值的至少25%(例如，至少33%、至少40%、至少 50%)。
本发明还提供了包含来自于至少四株流感病毒的抗原的疫苗，所述疫苗内各 毒株HA的平均含量为xpg，并且，(a)四株病毒中两株的HA的含量比x低至少 10%，另两株的HA的含量比x高至少10%，或者(b)四株病毒中三株的HA的含 量比x低至少100/。，另一毒株的HA的含量比x高至少10%，或者(c)四株病毒中 三株的HA的含量比x高至少10。/Q,另一毒株的HA的含量比x低至少10%。"至 少10%"可以是至少25%、至少33%、至少40%、至少50%等。
本发明还提供了生产疫苗的方法，该方法包括步骤(i)培养四种不同的流感 毒株；(ii)从步骤(i)培养的每一毒株制备抗原组合物，所述抗原组合物包含血凝素 ;以及(iii)按比例将抗原组合物与药用载体混合以生产疫苗，所述比例使得各流 感毒株的血凝素的含量在所述疫苗内基本相同。
在某些实施方式中，所述四株病毒包括两株A型流感病毒和两株B型流感病 毒。在其他实施方式中，四株病毒包括三株A型流感病毒和一株B型流感病毒。
毒株筛选
用于生产疫苗的流感毒株每季不同。在目前所处的流感大流行间期，三价疫 苗包含两株A型流感病毒(H1N1和H3N2)和一株B型流感病毒。本发明的疫苗包 括至少四株流感病毒。不同毒株通常分开培养，收获病毒和制备抗原以后再混合 。因此本发明的方法包括混合来自于一株以上的流感病毒的抗原的步骤。
在某些实施方式中，四株病毒包括两株A型流感病毒和两株B型流感病毒 ('A-A-B-B，)。在其他实施方式中，四株病毒包括三株A型流感病毒和一株B型 流感病毒('A-A-A-B')。
目前发现A型流感病毒有16种HA亚型Hl、 H2、 H3、 H4、 H5、 H6、 H7、 H8、 H9、 HIO、 Hll、 H12、 H13、 H14、 H15和H16。本发明的疫苗可用于防御A 型流感病毒NA亚型N1、 N2、 N3、 N4、 N5、 N6、 N7、 N8或N9中的一种或多 种亚型。在只包含两株A型流感病毒的疫苗中，通常是一株Hl毒株(例如，HAN1 毒株)和一株H3毒株(例如，H3N2毒株)。但是，在某些实施方式中，可以是一个 大流行(pandemic)毒株和一个H1毒株，或者1个大流行毒株和一个H3毒株。一 种四价流感病毒疫苗可包含一株H1N1、 一株H3N2、 一株H5(例如，H5N1毒株) 和一株B型流感病毒。在包含三株A型流感病毒的疫苗中，通常是一株H1(例如，HANI毒株)和两 株H3毒株(例如，两株H3N2)。两株H3的HA蛋白的抗原性是有区别的，例如， 一株H3N2可与A/Moscow/10/99产生交叉反应， 一株H3N2与A/Fujian/411/2002 产生交叉反应。两株H3可来自于不同的进化分枝(H3N2毒株的进化分枝A、 B 和C见参考文献1)。但是，在某些实施方式中，这些毒株中的一株(即，Hl或两 株H3中的一株)可以用大流行毒株替换。
大流行流感毒株的特征如下(a)具有与目前常见人毒株的血凝素相比新的血 凝素，即在过去IO年以上的时间内在人群中未出现过(例如，H2)，或者以前在人 群中从未发现(例如，通常只在鸟类中发现的H5、 H6或H9)，因此，疫苗受体和 普通人群对该毒株的血凝素没有免疫力；(b)能够在人群中水平传播；以及(c)对人 致病。大流行毒株H2、 H5、 H7或H9亚型株如H5N1、 H5N3、 H9N2、 H2N2、 H7N1和H7N7株。在H.5亚型内、病毒可分成HA进化分枝1、 HA进化分枝1，、 HA进化分枝2或HA进化分枝3 [2]，其中，进化分枝1和进化分枝3特别相关
目前未发现B型流感病毒具有不同的HA亚型，但是B型确实可分为两个不 同的谱系。这两谱系是在上世纪80年代末期出现的，含有抗原性和/或遗传性彼 此不同的HA [3]。目前发现的B型流感毒株或者是B/Victoria/2/87-样的或者是 B/Yamagata/16/88-样的。如果本发明的疫苗包含两株B型流感病毒，那么就是一 株B/Victoria/2/87-样毒株和一株B/Yamagata/16/88-样毒株。这些毒株通常具有不 同的抗原性，但是也已经有报道根据氨基酸序列差异来区分这两个谱系，例如， B/Yamagata/16/88-样毒株的HA蛋白通常(但也不总是)在164位氨基酸残基上缺 失，这是以'Lee40'HA序列为基准的编号[4]。
因此，本发明的优选A-A-B-B疫苗包含来自于(i)HlNl毒株；(ii)H3N2毒株 ;(iii)B/Victoria/2/87-样毒株；以及(iv)B/Yamagata/16/88-样毒株的抗原(优选血凝 素)。
在抗原来自两株或两株以上B型流感病毒的本发明的某些实施方式中，其中 至少两株B型流感病毒含有不同的血凝素但是含有相关的神经氨酸酶。例如，两 者可都包含B/Victoria/2/87-样神经氨酸酶 [5]，或者两者都包含 B/Yamagata/16/88-样神经氨酸酶。例如，两株的B/Victoria/2/87-样神经氨酸酶可 以都包含一个或多个如下序列特征(1)27位残基不是丝氨酸，优选代之以亮氨 酸；(2)44位残基不是谷氨酸，优选代之以赖氨酸；(3)46位残基不是苏氨酸，优 选代之以异亮氨酸；(4)51位残基不是脯氨酸，优选代之以丝氨酸；(5)65位残基不是精氨酸，优选代之以组氨酸；(6)70位残基不是甘氨酸，优选代之以谷氨酸 ;(7)73位残基不是亮氨酸，优选代之以苯丙氨酸；禾P/或(8)88位残基不是脯氨酸， 优选代之以谷氨酰胺。同样，在某些实施方式中，神经氨酸酶在43位残基上缺 失，本可是苏氨酸；有报道称，在43位残基上的缺失是NA基因上的三核苷酸 缺失造成的，是B/Victoria/2/87-样毒株的特征，但是最近的毒株又恢复了 Thr-43 [5] 。当然，两种B/Yamagata/16/88-样神经氨酸酶也可共有与以上所述正好相反的特 征，例如，S27、 E44、 T46、 P51、 R65、 G70、 L73和/或P88。这些氨基酸的编 号以'Lee40'神经氨酸酶序列为基准[6]。因此，本发明的A-A-B-B疫苗可使用两 株HA抗原性不同(一个B/Yamagata/16/88-样毒株， 一个B/Victoria/2/87-样毒株) 但NA相关(两种B/Yamagata/16/88-样NA，或两种B/Victoria/2/87-样NA)的B型 流感病毒。
本发明的优选A-A-A-B疫苗包含来自于如下毒株的抗原(优选血凝素)
(i) HlNI毒株；(ii)A/Moscow/10/99-样H3N2毒株;(iii)A/Fujian/411/2002-样H3N2 毒株；以及(iv)B型流感毒株，可以是B/Victoria/2/87-样或B/Yamagata/16/88-样毒株。
本发明并不局限于四价疫苗，还包括五价、六价、七价等疫苗。举例来说， 五价疫苗可包含三株A型流感病毒(例如， 一株H1和两株H3，如上所述)加上两 株B型流感病毒。例如，A-A-A-B-B疫苗可包含来自于以下毒株的抗原(优选血 凝素)(i)HlNl毒株；(ii)A/Moscow/10/99-样H3N2毒株；(iii)A/Fujian/411/2002-样 H3N2毒株；(iv)B/Victoda/2/87-样毒株;以及(v)B/Yamagata/16/88-样毒株。另一 种A-A-A-B-B疫苗可包含来自于如下毒株的抗原(优选血凝素)(i)HlNl毒株；
(ii) H3N2毒株；(iii)H5 A型流感毒株，如H5N1毒株；(iv)B/Victoria/2/87-样毒株 ;以及(v)B/Yamagata/16/88-样毒株。A-A-A-A-B疫苗可包含来自于如下毒株的抗 原(优选血凝素)(i)HlNl毒株；(ii)A/Moscow/10/99-样H3N2毒株；
(iii) A/Fujian/411/2002-样H3N2毒株；(iv)H5 A型流感毒株，如H5N1毒株；以及
(v) B型流感毒株。A-A-A-A-B-B疫苗可包含来自于如下毒株的抗原(优选血凝素) (i)HlNl毒株；(ii)A/Moscow/10/99-样H3N2毒株;(iii)A/Fujian/411/2002-样H3N2 毒株；(iv)H5 A型流感毒株，如H5N1毒株；(v)B/Victoria/2/87-样毒株；以及
(vi) B/Yamagata/16/88-样毒株。
本发明使用的流感病毒可以是重排毒株(reassortant)，可通过反向遗传技术制 备。通过反向遗传技术[例如，7-ll]可在体外(invitro)利用质粒制备具有目标基因 组片段的流感病毒。 一般而言，该技术包括表达(a)编码目标病毒RNA分子的DNA分子，例如釆用polI启动子或噬菌体RNA聚合酶启动子，以及(b)编码病毒蛋白 质的DNA分子，例如，釆用polll启动子，这样，这两类DNA在细胞内表达后， 可组装出有感染性的完整病毒体。优选由DNA提供所有的病毒RNA和蛋白质， 但是也可用辅助病毒提供部分病毒RNA和蛋白质。也可采用利用不同质粒来分 别合成各种病毒RNA的质粒方法[12-14]，这些方法还包括使用质粒来表达所有 或部分病毒蛋白质(例如，仅PB1、 PB2、 PA和NP蛋白)，在某些方法中最多可 使用12个质粒。为了减少质粒的使用数目，最近的一种方法[15]将一组RNA聚 合酶I转录盒(用于病毒RNA合成)组合在同一个质粒上(例如，编码l、 2、 3、 4、 5、 6、 7或所有8个A型流感病毒vRNA片段的序列)，将一组蛋白编码区与RNA 聚合酶II启动子组合在另一个质粒上(例如，编码l、 2、 3、 4、 5、 6、 7或所有8 个A型流感病毒mRNA转录子的序列)。参考文献15所述方法的可取之处包括 (a)PBl、 PB2和PAmRNA编码区位于一个质粒上；以及(b)所有8个vRNA编码 片段位于一个质粒上。将NA和HA片段包含在一个质粒上而将其他6个片段包 含在另一个质粒上也是一种好方法。除了用poll启动子编码病毒RNA片段以外，也可以换用噬菌体聚合酶启动 子[16]。例如，SP6、 T3或T7聚合酶的启动子也很适合。由于poll启动子具有种 特异性，噬菌体聚合酶启动子更便于用于多种类型的细胞(例如，MDCK)，尽管 细胞还必须用编码外源聚合酶的质粒转染。在其他技术中，可以使用poll和polll双启动子同时从一个模板上编码病毒 RNA和可表达的mRNA [17， 18]。因此，A型流感病毒可包含来自于A/PR/8/34病毒的一个或多个RNA片段(通 常是来自于A/PR/8/34的6个片段和来自于疫苗株的HA和N片段，g卩，6:2重 排株)。也可以包含来自于A/WSN/33病毒或来自用于形成重排毒株供疫苗制备之 用的任何其他毒株的一个或多个RNA片段。A型流感病毒可包含少于6个(例如， 0、 1、 2、 3、 4或5个)来自AA/6/60流感病毒(A/Ann Arbor/6/60)的病毒片段。B 型流感病毒可包含少于6个(例如，0、 1、 2、 3、 4或5个)来自AA/1/66流感病 毒(B/AnnArbor/l/66)的病毒片段。 一般来说，本发明可防御能导致人传人的毒株， 因此，毒株的基因组通常包含至少一个源于哺乳动物(例如，人)流感病毒的RNA 片段。它可包含禽流感病毒的NS片段。提供本发明组合物中可用抗原的毒株可能是对病毒治疗有耐受性的(例如，耐 奥司他韦[19]和/或耐扎那米韦)的毒株，包括耐药性大流行毒株[20]。特别有用的菌株是那些从患者体内分离出来到在细胞培养系统中复制之间的任何阶段(包括首尾)都未经过鸡蛋传代的菌株。本发明的一项优选是从分离到 病毒复制之间的所有步骤都只用MDCK细胞进行。因此，在某些实施方式中，用于本发明的毒株包含的具有以下所述寡糖结合倾向性的血凝素，相比带Sia(a2,3)Gal末端二糖的寡糖，所述血凝素优先结合带 Sia(a2,6)Gal末端二糖的寡糖。人流感病毒与带Sia(a2,6)Gal末端二糖(唾液酸以 a-2，6方式结合到半乳糖上)的受体寡糖结合，而鸡蛋和Vero细胞具有带 Sia(a2,3)Gal末端二糖的受体寡糖。人流感病毒在细胞如MDCK之类细胞内的生 长可对血凝素产生选择压力，从而维持天然Sia(a2，6)Gal结合，这与在鸡蛋内传 代不同。为了确定病毒与带Sia(a2,6)Gal末端二糖的寡糖的结合是否优于与带 Sia(a2,3)Gal末端二糖的寡糖的结合，有多种方法可用。例如，参考文献21描述 了一种固相酶联方法用于分析流感病毒的受体结合活性，该方法能对亲和力常数 进行高灵敏度的定量测定。参考文献22采用固相方法测定了病毒与两种不同唾 液酸化糖蛋白(卵类粘蛋白，带有Sia(ct2,3)Gal决定簇；和猪cc2-巨球蛋白，带有 Sia(a2，6)Gal决定簇)的结合活性，该文献还描述了一种方法，其中分析了病毒抗 以下两种受体类似物的结合活性游离唾液酸(Neu5Ac)和3'-唾液酰乳糖 (Neu5Aca2-3Gal(31-4Glc)。参考文献23报道的方法用聚糖矩阵能够清楚地区分受 体对a2,3或a2,6连接的偏好。参考文献24报道了 一种方法，该方法是基于经过 酶催化修饰而包含Sia(a2，6)Gal或Sia(a2,3)Gal的人红细胞的凝集反应。根据测 试方法的类型，可以直接用病毒本身来完成分析，或者用纯化自病毒的血凝素来 间接完成分析。在某些实施方式中，用于本发明的流感毒株包含糖蛋白(其中包括血凝素)， 这些糖蛋白的糖基化模式与鸡蛋衍生的病毒不同。因此，本发明中的糖蛋白具有 鸡蛋中没有的糖形(glycoform)。在某些实施方式中，本发明不采用A/Singapore/6/86(HlNl)、 A/Beijing/353/89(H3N2)、 B/Beijing/1/87和B/Panama/45/90毒株的组合(特别是， 不使用这四株病毒来源的裂解抗原的组合，并且/或者，含量不是15pgHA/株)。 在另一些实施方式中，本发明不采用 A/Taiwan/1/86(H1N1)、 A/Guizhou/54/89(H3N2)、 B/Beijing/1/87和B/Yamagata/16/88毒株的组合(特别是， 不采用来自于这四株病毒来源的完整病毒体)。12疫苗制备目前己有多种形式的疫苗，疫苗一般基于活病毒或灭活病毒制备。灭活疫苗 可以是基于完整病毒体、"裂解"(split)病毒体或纯化的表面抗原。流感病毒抗原 还可以病毒小体(virosome)的形式存在。本发明可采用所有这些类型的疫苗。现有的活疫苗包括米迪缪尼(Medlmmune)的FLUMISTTM产品(三价活病毒)。 疫苗的制备过程包括在合适的基质上培养病毒，然后从含病毒体的液体的纯化病 毒体。例如，可通过离心澄清液体，然后用缓冲液稳定(例如，包含蔗糖、磷酸钾 和谷氨酸一钠的缓冲液)。如果使用灭活病毒，那么疫苗可包含完整病毒体、裂解病毒体活纯化的表面 抗原(其中包括血凝素，通常还包括神经氨酸酶)。灭活病毒的化学方法包括用有 效量的一种或多种下列试剂处理去污剂、甲醛、P-丙内酯、亚甲蓝、补骨脂素、 羧基盲勒烯(C60)、 二乙胺或上述物质的组合。病毒灭活的非化学方法是本领域熟 知的，例如紫外灯或Y射线照射。可用多种方法从含病毒液体中收获病毒体。例如，纯化方法可包括用线性蔗 糖梯度溶液的区带离心法，所述溶液包含能破坏病毒体的去污剂。然后，可通过 透析纯化抗原，此前可以进行稀释也可以不稀释。要得到裂解病毒体可用去污剂(例如，乙醚、聚山梨醇酯(Polysorbate)80、脱 氧胆酸盐、磷酸三正丁酯、曲通X-100(Triton X-100)、曲通N101(Triton N101)、 溴化十六烷基三甲胺、Tergitol NP9等)处理经纯化的病毒体形成亚病毒体 (subvirion)制备物，这包括"吐温-醚"裂解方法。裂解流感病毒的方法是本领域 熟知的，例如，参见参考文献25-30等。病毒的裂解通常用破坏浓度的裂解试剂 来破坏或片段化感染性的或非感染性的全病毒。破坏后会导致病毒蛋白完全或部 分可溶，由此改变病毒的完整性。优选的裂解试剂包括非离子和离子(例如，阳离 子)表面活性剂，例如垸基糖苷、烷基硫代糖苷、酰基糖、磺基甜菜碱、聚氧乙烯 垸基醚、N，N-二烷基-葡糖酰胺、Hecam^g、垸基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季胺类 化合物、十二垸基肌氨酸钠、CTAB(溴化十六垸基三甲胺)、磷酸三正丁酯、溴棕 三甲铵、十四垸基三甲铵盐、阳离子脂质体(lipofectin)、阳离子脂质体胺 (lipofectamine)禾卩DOT-MA、辛烷基或壬基苯氧基-聚氧乙醇(例如，曲通(Tdton) 类表面活性剂如曲通X-100或曲通N101)、聚氧乙烯脱水山梨酯(吐温类表面活性 剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。有用的裂解方法之一利用脱氧胆酸钠和甲醛的 连续效应，裂解可发生在病毒体的初步纯化过程中(例如，在蔗糖密度梯度溶液中) 。因此，裂解过程可包括含病毒体材料的澄清(去除非病毒体材料)、浓缩收获的病毒体(例如，用吸附方法，如CaHP04吸附)、将完整病毒体与非病毒体材料分离、在密度梯度离心步骤中用裂解试剂裂解病毒体(例如，利甩包含如脱氧胆酸钠 之类裂解试剂的蔗糖梯度溶液)、以及过滤(例如，超滤)去除不需要的物质。裂解的病毒体可重悬在磷酸钠缓冲的等渗氯化钠溶液中。BEGRIVAC 、 FLUARIX 、 FLUZONEtm禾口 FLUSHIELD丁m产品是裂解疫苗。纯化的表面抗原疫苗包含流感病毒表面抗原血凝素，通常还包含神经氨酸酶 。制备纯化形式的这些蛋白的方法是本领域熟知的。FLUVIRINtm、 AGRIPPAL 和INFLUVACTM产品是亚单位疫苗。灭活流感病毒抗原的另一种形式是病毒小体[31](不含核酸的病毒样脂质体 颗粒)。病毒小体可通过如下方法制备用去污剂溶解流感病毒，然后去除核衣壳， 重构含病毒糖蛋白的膜。另一种制备病毒小体的方法包括将病毒膜糖蛋白加到过 量的磷脂中，得到膜上带有病毒蛋白的脂质体。本发明还可用于大量储存病毒小 体，例如在INFLEXAL Vtm和INVAVACTM产品中。流感病毒可以是减毒株。流感病毒可以是温度敏感的毒株。流感病毒可以是 冷适应的。这三个特征在以活病毒为抗原时特别有用。在目前所用的灭活流感病毒疫苗中HA是主要的免疫原，通过参照HA的水 平对疫苗剂量进行标准化，一般通过SRID测定。现有的疫苗通常包含约15(igHA/ 株，虽然也可以使用更低的剂量，例如在用于儿童、或大流行或使用佐剂时。有 时剂量为分数，如VK即，7.5pgHA/株)、％和V8 [68,69]，也有更高的剂量(例如， 3x或9x,」量[32，33])。因此，疫苗可包含0.1至l」150pg HA/流感毒株，优选0.1 到50pg，例如，0.1-20(ig、 0.1-15pg、 0.1-10ng、 0.1-7.5fjg、 0.5-5|ig等。特殊的 剂量包括例如，每株约45、约30、约15、约10、约7.5、约5、约3.8、约1.9、 约1.5等。优选的是疫苗中各毒株的HA的含量基本相同，例如，每毒株的HA 的含量与平均HA含量/株的差值在该平均值的10%以内，优选5%以内。对于活疫苗来说，给药剂量是根据组织培养感染剂量半数(TCID5o)而不是HA 含量计量的，TCIDm)通常在106到108/株之间(优选1065-107'5)。本发明所用的毒株可以具有如野生型病毒中所发现的天然HA，或者具有修 饰的HA。例如，已知可修饰HA以去除在禽类中高度致病的决定簇(例如，HA1、 HA2裂解位点周围的高碱性区)。本发明所用的B型流感病毒的HA以含有197 位的天冬酰胺为佳，这可提供一个糖基化位点[34]。细胞系本发明优选用细胞系来支持病毒复制而不是以SPF鸡蛋为基质来培养病毒。 细胞系典型的是哺乳动物细胞。合适的哺乳动物细胞包括而不限于仓鼠、牛、灵 长类(包括人和猴子)和狗的细胞，尽管灵长类细胞不是优选的。各种类型的细胞 都可以使用，例如肾细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、肺细胞等。合适的仓鼠细胞的例子是名为BHK21或名为HKCC的细胞系。合适的猴细胞是例如非洲绿猴 细胞，如Vero细胞系的肾细胞[35-37]。合适的狗细胞是肾细胞，例如CLDK和 MDCK细fe系。因此，合适的细胞系包括而不限于MDCK; CHO; CLDK; HKC.C; 293T ;BHK; Vero; MRC-5; PER.C6 [38]; FRhL2; WI-38等。合适的细胞系来源广 泛，例如，美国典型培养物保藏所(ATCC)[39]、 Coriell细胞库[40]或欧洲细胞培 养物保藏所(ECACC)。例如，ATCC提供各种不同的Vero细胞，目录号分别是 CCL-81、 CCL-81.2、 CRL-1586和CRL-1587，它还提供MDCK细胞，目录号为 CCL-34。 PER.C6可向ECACC获取，收藏编号为96022940。最优选的细胞系是具有哺乳动物型糖基化特征的那些细胞系。作为哺乳动物 细胞系的次优替代，也可以用禽细胞系培养病毒[例如，参考文献41-43],这包括 鸭子细胞系(例如，鸭子的视网膜)或鸡细胞系。禽细胞系的例子包括禽胚胎干细 胞[41, 44]和鸭子视网膜细胞[42]。合适的胚胎干细胞包括来源于鸡胚胎干细胞的 EBx细胞系EB45、 EB14禾B EB14-074 [45]。鸡胚胎成纤维细胞(CEF)也可以使用 。但是，与使用禽细胞不同，使用哺乳动物细胞意味着疫苗将不含禽类DNA和 鸡蛋蛋白的(例如卵清蛋白和卵类粘蛋白)，由此可以降低过敏性。培养流感病毒最优选的细胞系是MDCK细胞系[46-49]，该细胞系源于马-达 二氏(Madin-Dardy)犬肾。原始的MDCK细胞系可从ATCC获得，编号为CCL-34， 但也可以使用这个细胞系的衍生物。例如，参考文献46公开了一种适化后能在 悬浮培养物中生长的MDCK细胞系("MDCK 33016"，保藏编号为DSMACC 2219) 。同样，参考文献50公开了一种能在无血清培养物中悬浮生长的MDCK衍生的 细胞系("B-702"，保藏编号为FERM BP-7449)。参考文献51公开了非致瘤性 MDCK细胞，包括"MDCK-S" (ATCC PTA-6500)、 "MDCK-SF101" (ATCC PTA-6501)、 "MDCK-SF102" (ATCC PTA-6502)和"MDCK-SF103" (PTA-6503) 。参考文献52公开了高易染MDCK细胞系，包括"MDCK.5F1"细胞(ATCC CRL-12042)。这些MDCK细胞系都可以使用。病毒可以贴壁培养或悬浮培养的方式用细胞培养。也可以釆用微载体培养。 在某些实施方式中，细胞由被适应了悬浮生长。优选将细胞系培养在无血清培养基和/或不含蛋白的培养基中。在本发明中称 某培养基为无血清培养基表示，该培养基中不含来源于人或动物血清的添加物。 在这种培养物中生长的细胞天然地包含其自身的蛋白质，但是不含蛋白的培养基 应当被理解为这样的培养基细胞能够在其中繁殖，没有蛋白质、生长因子、其 他蛋白添加物和非血清蛋白，但是可选性地包含如胰蛋白酶或病毒生长所需要的 其他蛋白酶之类蛋白。在病毒复制期间，支持病毒复制的细胞系以在37°C以下培养为佳[53](例如30-36。C，或约30。C、 31°C、 32°C、 33。C、 34°C、 35。C、 36°C)。在培养的细胞内扩增流感病毒的方法通常包括用待扩增毒株种子接种细胞 培养物，将被感染的细胞培养一段时间来扩增病毒，例如根据病毒滴度或抗原表达情况确定培养时间(例如接种后24到168小时)，以及收集扩增的病毒。以1:500 到1:1的病毒(根据PFU或TCID5o):细胞比接种培养的细胞，优选1:100至U 1:5， 更优选1:50到1:10。将病毒加到细胞悬液中或细胞单层上，让病毒吸附到细胞上， 历时至少60分钟，但是一般不超过300分钟，优选90到240分钟，温度为25°C 到40。C，优选28。C到37。C。可通过冻融或通过酶催化作用分离感染的细胞培养 物(例如细胞单层)，以增加收获的培养物上清中的病毒含量。然后收获的液体进 行灭活或冻存。培养细胞按约0.0001到10的感染复数("m.o丄")感染，优选约 0.002到5，更优选0.001到2。更优选的是，细胞按约0.01的m.o.i.感染。可在 感染后30到60小时收获被感染的细胞。优选在感染后34到48小时收获细胞。 更优选在感染后38到40小时收获细胞。通常在细胞培养期间添加蛋白酶(一般是 胰蛋白酶)以使病毒释放。可在培养期间任何合适的阶段添加蛋白酶，例如，在接 种前，在接种的同时或接种后[53]。在优选实施方式中，特别是釆用MDCK细胞的实施方式中，细胞系从主工 作细胞库的传代的细胞群倍加数不超过40。病毒接种物和病毒培养物最好不含(即，病毒污染检测结果呈阴性)单纯疱疹 病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、 SARS冠状病毒、腺病毒、鼻病毒、呼 肠孤病毒、多瘤病毒、双核糖核酸病毒、环状构象病毒和/或细小病毒[54]。特别 好的是不含单纯疱疹病毒。宿主细胞DNA如果用细胞系扩增病毒，那么尽可能减少最后疫苗内残存细胞系DNA就是 标准操作，这是为了尽可能消除DNA致瘤性。因此，根据本发明制备的疫苗组合物优选每个剂量包含0ng以下(优选ng 以下，更优选100pg以下)的残存宿主细胞DNA，虽然仍可能存在痕量的宿主细 胞DNA。优选的是包含〈10ng(例如,lng，〈100pg)宿主细胞DNA/15jig血凝素的疫苗， 以及包含〈10ng(例如，<lng， 〈100pg)宿主细胞DNA/0.25ml体积的疫苗。更好的 是包含〈10ng(例如，<lng， 〈100pg)宿主细胞DNA/50(ig血凝素的疫苗，以及包含 〈10ng(例如，<lng， 〈100pg)宿主细胞DNA/0.5ml体积的疫苗。较好的是，残存宿主细胞DNA的平均长度小于500 bp，例如，小于400 bp、 小于300 bp、小于200 bp、小于100bp等。污染性DNA可在疫苗制备过程中通过标准纯化方法去除，例如，色谱法等 。核酸酶处理，例如DNA酶处理，可提高残存宿主细胞DNA的清除率。降低宿 主细胞DNA污染的合适方法可见参考文献55和56，包括两步处理，第一步使用 DNA酶(例如，Benzonase)，可在病毒生长期使用，然后用阳离子去污剂(例如， CTAB)，可在病毒体裂解过程中使用。也可以釆用(3-丙内酯处理。测定残存宿主细胞DNA现在是生物制品的常规法定要求，也是本领域技术 人员常规技术之一。用于测定DNA的方法通常是经认证可靠的实验[57,58]。 一 项认证可靠的实验其性能特征可以数学和定量术语来描述，其可能的误差原因应 是已知的。这样的实验通常己就诸如精度、准度、特异性等特征经过了测试。待 一项实验经过校准(例如，用已知标准量的宿主细胞DNA校准)并测试后，就可以 用来日常定量测定DNA含量。有三种主要的DNA定量测定技术可以使用杂交 方法，如DNA印迹(Southern Blots)或斑点杂交(Slot Blots)[59];免疫测定方法， 如ThresholdTM系统[60];以及定量PCR [61]。这些方法都是本领域技术人员熟 知的，但每一种方法的精准度可能与待测的宿主细胞有关，例如，杂交探针的选 择、扩增用的引物和/或探针的选择等。Molecular Devices的ThreshokFM系统是 一种可测定pg级总DNA的定量分析方法，已被用于检测生物药物内的污染DNA 水平[60]。典型的实验包括生物素化的ssDNA结合蛋白、尿素酶结合的抗ssDNA 抗体和DNA之间非序列特异性地形成反应复合物。实验需要的所有组分都在厂 家生产的完整总DNA分析试剂盒内。许多制造商都提供用于检测残存宿主细胞 DNA的定量PCR实验，例如AppTecTM实验室服务公司(AppTecTM Laboratory Services)、 BioRelianceTM、阿尔泰技术公司(Althea Technologies)等。参考文献62 对用于测定人病毒疫苗内宿主细胞DNA污染的化学发光杂交分析和总DNA ThresholcFM系统进行了比较。药用组合物本发明的组合物是药学上认可的。本发明组合物通常在抗原以外还包含其他 组分，例如，这些组合物一般包含一种或多种药用载体和/或赋形剂。如下文所述，也可以包含佐剂。有关这种组分的全面讨论可参见参考文献63。 本发明组合物通常是水溶液形式的。本发明组合物可包含防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗应该最好 基本上不含(即，低于5pg/ml)含汞物质，例如不含硫柳汞[29，64]。不含汞的疫苗 是更优选的。不含防腐剂的疫苗是特别优选的。a-生育酚琥珀酸盐可作为汞化合 物的替代物包含在组合物中[29]。为了控制渗透压(tonicity)，优选包含生理盐，如钠盐。优选氯化钠，浓度为 l到20mg/ml。其他可以使用的盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化 镁、氯化钙等。组合物的渗透压通常为200 mOsm/kg到400 mOsm/kg，优选240-360 mOsm/kg，更优选290-310 mOsm/kg。有报道称，渗透压对疫苗引起的疼痛没有 什么影响[65]，但是将渗透压维持在这个范围内是优选的。本发明组合物可包含一种或多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括磷酸盐缓冲剂;Tds缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(特别是与氢氧化 铝佐剂一起)；或者柠檬酸盐缓冲剂。缓冲剂的使用浓度一般为5-20mM。组合物的pH—般在5.0到8.1之间，更常见的是在6.0到8.0之间，例如6.5-7.5 或7.0-7.8。因此本发明的方法包括在分装前调节散装疫苗的pH的步骤。组合物最好是无菌的。组合物最好是无热原的，例如，EU/剂〈1(内毒素单位， 标准计量)，优选EU/剂〈0.1。组合物优选不含谷蛋白。本发明的组合物，特别是裂解疫苗或表面抗原疫苗，可包含去污剂，例如， 聚氧乙烯脱水山梨酯表面活性剂(被称为"吐温")、辛苯昔醇(如辛苯昔醇-9(曲通 X-100)或t-辛基苯氧聚乙氧基乙醇)、溴化十六烷基三甲胺("CTAB")或脱氧胆酸 钠。去污剂可以只以痕量存在。因此，疫苗可包含低于lmg/ml的辛苯昔醇-10和 聚山梨醇酯80。其他痕量存在的残留组分可以是抗生素(例如，新霉素、卡那霉 素、多粘菌素B)。本发明组合物可包含用于单次免疫的材料，或者包含用于多次免疫的材料 (即，"多剂量"试剂盒)。多剂量组合物中优选包含防腐剂。作为多剂量组合物包 含防腐剂的替代手段，或者在包含防腐剂以外，可以或还可以将组合物装在带有 无菌接配器来取用材料的容器内。流感病毒疫苗的给药剂量体积一般约0.5ml，对儿童可减半(即约0.25 ml)。最好将组合物和试剂盒存放在2°C到8°C。不应该冷冻。理想的是避免光线 直接照射。佐剂较好的是，本发明的组合物可包含佐剂，佐剂的功能在于增强接受组合物的 患者体内所激发的免疫反应(体液免疫和/或细胞免疫)。流感疫苗使用佐剂是已知的。参考文献66和67中使用的是氢氧化铝，参考文献68中使用的是氢氧化铝 和磷酸铝的混合物。参考文献69也描述了铝盐佐剂的使用。启龙疫苗(Chiron Vaccines)的FLUADTM产品包含水包油乳剂。 可用于本发明的佐剂包括而不限于 含矿物质的组合物，其中包括钙盐和铝盐(或其混合物)。钙盐包括磷酸钙(例 如，参考文献70所描述的"CAP")。铝盐包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝 等，盐可以是任何合适的形式(例如，凝胶、结晶的、无定形的等)。吸附到 这些盐上是优选的。含矿物质的组合物还可以制成矿物盐颗粒[71]。铝盐佐 剂将在下文详细描述。 水包油乳剂(参见下文的详细描述)。 皂苷类[参考文献97的22章]，这一组包含多种不同的甾醇苷和三萜糖苷， 存在于多种植物的皮、叶、茎、根、甚至花内。对于将皂树(Quillaia saponaria Molina)树皮中的皂苷类物质用作佐剂已进行了广泛的研究。来源于菝葜(洋 菝葜)(Smilax ornate (sarsaparilla》、重瓣丝石竹(Gypsophilla paniculata(brides veil))和石碱花(皂根)(Saponariaofficianalis)的皂苷已经商品化。皂苷佐剂制 剂包括纯化的制剂如QS21，也可以是脂类制剂如ISCOMs。 QS21的商品 名为Stimulon 。皂苷组合物可用HPLC和RP-HPLC纯化。已经鉴定了用 这些技术纯化的具体组分，其中包括QS7、 QS17、 QS18、 QS21、 QH-A、 QH-B和QH-C。优选的皂苷是QS21。参考文献72公开了一种制造QS21 的方法。皂苷制剂还可包含甾醇，如胆固醇[73]。皂苷和胆固醇的组合物可 用于制备成被称为免疫刺激复合物(ISCOMA)的独特颗粒[参考文献97的23 章]。ISCOM通常还包含磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的 皂苷都可用于ISCOM。优选的是，ISCOM包含一种或多种QuilA、 QHA 和QHC。 ISCOM还可参见参考文献73-75的描述。可选的是，ISCOM可 以不含其它佐剂[76]。有关皂苷基佐剂开发的综述可参见参考文献77和78 脂肪类佐剂(参见下文的详细描述)。
细菌ADP核糖基化毒素(例如，大肠杆菌不耐热肠毒素"LT"、霍乱毒素"CT "或百日咳毒素"PT")及其脱毒衍生物，如被称为LT-K63和LT-R72的突 变毒素[79]。参考文献80描述了用作粘膜佐剂的脱毒的ADP-核糖基化毒 素，参考文献81描述了用作胃肠外佐剂的脱毒的ADP-核糖基化毒素。
生物粘附剂和粘膜粘附剂，如酯化的透明质酸微球[82]或壳聚糖及其衍生物 [83]。
细胞因子诱导剂(参见下文的详细描述)。
微粒(即，直径为 100nm至lj 150pm的粒子，更优选的是直径为 200nm到 30|im，或直径为 500nm到 10iim)，用生物可降解材料和非毒性材料制成 (例如，聚(a-羟酸)、聚羟丁酸、聚原酸酯、聚酸酐、聚己酸内酯等)，优选 丙交酯-乙交酯共聚物，可以(但非必须)将它们处理成带负电荷表面(例如， 用SDS)或正电荷表面(例如，用阳离子去污剂如CTAB)。
脂质体(参考文献97的13和14章)。适合用作佐剂的脂质体制剂的例子可 参见参考文献84-86的描述。
聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[87]。这种制剂还包括辛苯昔醇与聚氧乙烯脱水山 梨酯表面活性剂的组合[88]以及聚氧乙烯烷醚或聚氧乙烯垸酯表面活性剂 与至少一种其他非离子表面活性剂如辛苯昔醇的组合[89]。优选的聚氧乙烯 醚选自聚氧乙烯-9-月桂醚(聚乙二醇单十二醚9(laureth9))、聚氧乙烯-9-硬脂醚、聚氧乙烯-8-硬脂酸醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚 以及聚氧乙烯-23月桂醚。
胞壁酰肽，如N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰("thr-MDP" )、 N-乙酰 -非胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰(nor-MDP)、 N-乙酰葡糖氨酰-N-乙酰胞壁 酰-L-Al-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-dipalmitoxy propylamide( " DTP-DPP "或 TheramideTM)、 N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(l'-2'二棕 榈酰-sn-甘油-3-hydroxyphosphoryloxy)-乙胺("MTP-PE")。
由第一革兰氏阴性菌制备的外膜蛋白蛋白体制剂与自第二革兰氏阴性菌制 备的脂糖制剂的组合物，其中，外膜蛋白蛋白体与脂糖制剂形成稳定的非 共价连接佐剂复合物。这种复合物包括"IVX-908"，这是一种由脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)外膜和脂多糖组成的复合物。已被用作流感 病毒疫苗的佐剂[90;]。
5'-单磷酸次黄苷("MIMP" )[91]。
多羟化吡咯双烷化合物[92]，如具有以下结构式的化合物
其中R选自由氢，直链或支链非取代或取代的饱和或不饱和酰基、烷基(例 如，环垸基)、烯基、炔基和芳基，或其药学上认可的盐或衍生物。例子包 括而不限于木麻黄、木麻黄-6-a-D-吡喃葡萄糖、3-表-木麻黄、7-表-木麻黄、 3,7-二表-木麻黄等。
Y菊糖[93]或其衍生物，如Algammulin。
这些物质以及其他具有佐剂活性的物质在参考文献97和98中有更详细的描述。
组合物可包含两种或两种以上的所述佐剂。例如，优选既含水包油乳剂又含 细胞因子诱导剂，因为这种组合可增强流感疫苗激发的细胞因子反应，如Y-干扰 素反应，这种增强的反应大大强于所述乳剂或诱导剂单用时观察到的反应。
组合物中的抗原和佐剂通常混合在一起。
水包油乳剂佐剂
研究发现，水包油乳剂特别适于用作流感病毒疫苗的佐剂。许多这类佐剂是 本领域熟知的， 一般包含至少一种油和至少一种表面活性剂，油和表面活性剂都 是生物可降解的(可代谢的)和生物相容性的。乳剂中油滴的直径通常小于5pm， 甚至可以是亚微米级的，可用微射流机来获得这样的微粒并形成稳定的乳剂。油 滴的大小优选低于220 nm，因为这样适合过滤灭菌。
本发明可以使用的油例如动物油(如鱼油)或植物油。植物油的来源包括坚果、 种子和谷物。坚果油最常见的有花生油、大豆油、椰子油和橄榄油。希蒙得木油 (jojoba)也可以使用，例如得自希蒙得木豆的油。种子油包括红花油、棉籽油、葵 花油、芝麻油等。在谷物油中，玉米油是最易得的，但是也可以使用其他谷物油， 如小麦、燕麦、黑麦、稻米、画眉草、黑小麦等。甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂 肪酸酯虽然不是种子油内天然存在的，但是可以坚果油和种子油为起始材料通过 水解、分离、酯化来制备。哺乳动物奶来源的脂肪和油是可代谢的，因此也可用于本发明。从动物性来源获得纯油的分离、纯化、皂化及其他方法是本领域熟知 的。大多数鱼含有可代谢的油，这些很容易得到。例如，可用于本发明的鱼油的 例子有鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油(如鲸蜡.)。还有许多以5碳异戊二烯为单位通 过生化方法合成的支链油，通常被称为蹈类化合物。鲨鱼肝油包含被称为角鲨烯
的不饱和支链萜类化合物，2，6,10，15,19,23-六甲基-2，6,10,14,18,22-二十四碳己烯， 尤为本发明所优选。角鲨垸是角鲨烯的饱和类似物，也是优选的油。鱼油，包括 角鲨烯和角鲨烷都很容易买到，或者用本领域熟知的方法制备。其他优选的油是 生育酚类(见下文)。也可以使用油的混合物。
表面活性剂可根据其"HLB"(亲水/亲脂平衡常数)来分类。本发明优选表面 活性剂的HLB至少为10，优选至少15，更优选至少16。可用于本发明的表面活 性剂包括而不限于聚氧乙烯脱水山梨酯表面活性剂(通常被称作吐温)，特别是 聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80;环氧乙烷(EO)、环氧丙垸(PO)和/或环氧丁烷(BO) 的共聚物，商品名为DOWFAX ,如线性EO/PO嵌段共聚物；辛苯昔醇类 (oct叩henol)，可具有不同的乙氧基(氧-l，2-乙二基)重复数，辛苯昔醇-9(曲通X-100 或t-辛基苯氧聚乙氧基乙醇)是特别优选的；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40);磷脂如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；乙氧基壬基酚，如Tergitol NP系 列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(被称为布里杰(Briji) 表面活性剂)，如三甘醇单月桂醚(布里杰30);以及脱水山梨酯(通常被称作司盘 (Span))，如三油酸脱水山梨酯(司盘85)和单月桂酸脱水山梨酯。优选非离子表面 活性剂。乳剂中优选的表面活性剂有吐温80(—油酸聚氧乙烯脱水山梨酯)、司盘 85(三油酸脱水山梨酯)、卵磷脂和曲通X-100。
可以使用表面活性剂混合物，例如吐温80/司盘85的混合物。聚氧乙烯脱水 山梨酯如一油酸聚氧乙烯脱水山梨酯(吐温80)和辛苯昔醇(如t-辛基苯氧聚乙氧 基乙醇(曲通X-100))的混合物也是合适的。其他可用的组合包括聚乙二醇单十二 醚9加聚氧乙烯脱水山梨酯和/或辛苯昔醇。
表面活性剂的优选量(重量百分比)是聚氧乙烯脱水山梨酯(如吐温80), 0.01 到1%，优选约0.1 Q/。；辛基苯氧基聚氧乙醇或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通X-100， 或曲通系列的其他去污剂)，0.001至lj 0.1 %，优选0.005-0.02%;聚氧乙烯醚(如聚 乙二醇单十二醚9)， 0.1-20%，优选0.1-10%，特别优选0.1-1 %或约0.5%。
可用于本发明的水包油乳剂佐剂包括而不限于
，含角鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳剂。所述乳剂按体积计包含约5% 的角鲨烯、约0.5%聚山梨醇酯80和约0.5%的司盘85。如果以重量计，其 比例分别为4.3%的角鲨烯、0.5%聚山梨醇酯80和0.48%的司盘85。这个佐 剂被称为"MF59" [94-96]，在参考文献97的10章和参考文献98的12章有更详细的描述。MF59优选含有梓檬酸根离子，'例如lOmM柠檬酸钠缓冲剂。
*含角鲨烯、生育酚和吐温80的乳剂。所述乳剂可包含磷酸盐缓冲剂。它还可 以包含司盘85(例如，1%)和/或卵磷脂。此类乳剂可包含2-10%的角鲨烯、 2-10%的生育酚和0.3-3%的吐温80，角鲨烯:生育酚的重量比优选51，因为 这样可以形成更稳定的乳剂。角鲨烯和吐温80的体积比可以约为5:2。这样 的乳剂可通过如下过程制备将吐温80溶解在PBS中形成2。/。的溶液，然后 将90 ml该溶液与混合物(5g DL-a-生育酚和5ml角鲨烯)混合，再对该混合物 进行微射流化处理。得到的乳剂包含亚微米油滴，例如，平均直径在100到 250 nm之间，优选约180nm。
，含角鲨烯、生育酚和曲通去污剂(例如曲通X-100)的乳剂。所述乳剂还可包含 3d-MPL(见后文)。所述乳剂可包含磷酸盐缓冲剂。
包含聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯80)、曲通去污剂(例如曲通X-100)和生育酚 (例如a-生育酚琥珀酸酯)的乳剂。所述乳剂所中，所述三种组分的质量比可 以约为75:11:10(例如，750pg/ml聚山梨醇酯80， 110pg/ml曲通X-100和 100pg/ml a-生育酚琥珀酸酯)，上述浓度应当包括可能随抗原带入的上述组 分。乳剂还可包含角鲨烯。乳剂还可包含3d-MPL(见下文)。水相可包含磷酸 盐缓冲剂。
含角鲨烯、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆(poloxamer)401( "Pluronic L121 ")的 乳剂。所述乳剂可用pH7.4的磷酸盐缓冲液配制。该乳剂可作为胞壁酰二肽 的运输载体，并已与苏氨酰-MDP组合用于"SAF-1"佐剂中[99](0.05-1% Thr-MDP， 5%角鲨烯，2.5%聚丙二醇环氧乙垸醚和0.2%聚山梨醇酯80)。也 可以不含Thr-MDP，如"AF"佐齐'」[100](5%角鲨烯，1.25%聚丙二醇环氧 乙垸醚和0.2%聚山梨醇酯80)。优选进行微射流化处理。
，包含角鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(例如， 聚氧乙烯(12)十八十六烷基醚)和疏水性非离子型表面活性剂(例如，脱水山 梨酯或二縮甘露醇酯，如一油酸脱水山梨酯或"司盘80")的乳剂。所述乳 剂优选是热可逆的，并且/或者，至少90%(体积比)的油滴直径小于200 nm[101]。所述乳剂还可包含如下物质中的一种或多种糖醇；冷冻保护剂(例 如，糖，如十二烷基麦芽糖苷和/或蔗糖)；和/或垸基多聚糖苷。此类乳剂可 以是冻干品。 含角鲨烯、泊洛沙姆105和Abil-Care的乳剂[102]的乳剂。在含佐剂的疫苗中， 这些组分的最终浓度(重量)为5%角鲨烯，4%泊洛沙姆105(复合多元醇)和2% Abil-Care 85(Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 二甲硅油；辛酸/癸酸甘油三酯)。
包含0.5-50%油、0.1-10%磷脂和0.05-5%非离子型表面活性剂的乳剂。如参考 文献103所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨 酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米大小 的油滴。
包含不可代谢油(如轻质液体石蜡)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80 或司盘80)的亚微米水包油乳剂。乳剂还可以包含其他物质，如QuilA皂苷、 胆固醇、皂苷亲脂性缀合物(如GPI-OIOO，参见参考文献104的描述，通过 葡萄醛酸的羧基将脂肪族胺添加到去酰基皂苷上而合成)、二甲基二(十八烷 基)溴化铵和/或N,N-二(十八烷基)-N，N-二(2-羟乙基)丙二铵。
，所含皂苷(例如，QuilA或QS21)与甾醇(例如，胆固醇)相互作用形成螺旋状微 粒的乳剂[105]。
包含矿物油、非离子型亲水性乙氧基化脂肪醇和非离子型亲水性表面活性剂 (例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳剂[106]。
包含矿物油、非离子型亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子型亲脂性表面活性剂 (例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳剂[106]。
乳剂可以在给药时与抗原即时混合。因此，在包装好并发售的疫苗中，可将 佐剂和抗原分开，在使用时才完成最终的配制。抗原通常是水溶液的形式，因此， 最后就是通过混合两种液体制成最终的疫苗。两种液体的体积比是不定的(例如， 5:1到1:5之间)，但是通常为1:1。
抗原和佐剂混合以后，血凝素抗原通常仍保留在水溶液中，但也会分布到油 /水界面周围。总的来说，血凝素几乎不进入到乳剂的油相内。
如果组合物中包含生育酚，那么a、 p、 Y、 S、 e或g生育酚都可以使用，但是 优选a-生育酚。生育酚可呈多种形式，例如，不同的盐和/或异构体。所述盐包 括有机盐，如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等。D-a-生育酚和DL-a-生育酚都可以 使用。高龄(例如，60或60岁以上)患者使用的疫苗内优选包含生育酚，因为有 报道称，维生素E有利于这个年龄组患者的免疫反应[107]。生育酚还具有抗氧化 特性，这有助于稳定乳剂[108]。优选的(x-生育酚是DL-a-生育酚，这种生育酚的优选盐是琥珀酸盐。研究发现，所述琥珀酸盐在体内与TNF-相关配基有协同作 用。另外，已知Ct-生育酚琥珀酸盐与流感病毒疫苗是相容的，.可代替汞化合物用
作防腐剂[29]。
细胞因子诱导剂
可用于添加到本发明组合物中的细胞因子诱导剂能够在给予患者后激发免 疫系统释放细胞因子，其中包括干扰素和白细胞介素。已知细胞因子反应参与宿
主抗流感病毒感染防御的早期决定性阶段[109]。优选的诱导剂能够刺激下列细胞 因子的一种或多种释放干扰素-Y;白介素-l;白介素-2;白介素-12; TNF-a; TNF-卩和GM-CSF。优选的诱导剂能激发Thl型免疫反应相关细胞因子的释放， 例如干扰素，、TNF-a、白介素-2。优选既能激发干扰素，又能激发白介素-2的
诱导剂。
因此，在接受本发明的组合物以后，患者体内的T细胞在受到流感病毒抗原 的刺激后会以抗原特异性方式释放所需细胞因子。例如，从患者血液中纯化的T 细胞在体外(in vitro)与流感病毒血凝素接触时释放Y-干扰素。测定外周血单个核 细胞(PBMC)内这种反应的方法是本领域熟知的，其中包括ELISA、 ELISPOT、 流式细胞术和实时PCR。例如，参考文献IIO报道了一项研究，该研究监测抗原 特异性的T细胞介导的抗破伤风毒素免疫反应，特别是Y-干扰素反应，结果发现 ELISPOT是将抗原特异性TT-诱导的反应与自发反应区分开来的最灵敏的方法， 但是通过流式细胞术检测胞质内的细胞因子是检测再刺激效应的最有效方法。
合适的细胞因子诱导剂包括而不限于
免疫刺激性寡核苷酸，如包含CpG基序的寡核苷酸(这是一种二核苷酸序 歹ij，其中未甲基化的胞嘧啶通过磷酸键与鸟嘌呤相连)，或双链RNA，或包 含回文序列的寡核苷酸，或包含poly(dG)序列的寡核苷酸。
3-0-去酰化单磷酰脂质A( "3dMPL"，也被称为"MPLtm" )[111_114]。
咪唑并喹啉化合物，如咪喹莫特(Imiquimod)( "R-837" )[115，116]、瑞喹莫 德(Resiquimod)( "R-848" )[117]及其类似物；及其盐(例如，盐酸盐)。有关 免疫刺激性咪唑并喹啉化合物的其他细节可参见参考文献118到122。
氨硫脲化合物，如参考文献123所述的那些。合成、制造和筛选活性化合 物的方法在参考文献123中也有描述。氨硫脲可以特别有效地刺激人外周 血单个核细胞分泌细胞因子，如TNF-a。色胺酮化合物，如参考文献124所述的那些。合成、制造和筛选活性化合 物的方法在参考文献124中也有描述。氨硫脲可以特别有效地刺激人外周
血单个核细胞分泌细胞因子，如TNF-a。
核苷类似物，如(a)Isatorabine(ANA-245; 7-硫代-8-氧代鸟苷)
<formula>formula see original document page 26</formula>o o
及其前药;(b)ANA975; (c)ANA-025-l; (d)ANA380; (e)参考文献125到127 公开的化合物；(f)具有下列结构式的化合物
<formula>formula see original document page 26</formula>其中
R,和R2彼此独立，各自为H、卤素、-NRaRb、 -OH、 C,.6垸氧基、
取代C,.6垸氧基、杂环、取代杂环、C6.k)芳基、取代C6.,o芳基、Q.6 烷基或取代cl6烷基；
R3缺乏或者是H、 C,V烷基、取代Cl6焼基、C6.,o芳基、取代C6.10 芳基、杂环或取代杂环；
R4和Rs彼此独立，各自为H、卤素、杂环、取代杂环、-C(0)-Rd、
C,-6烷基、取代C,.6垸基，或结合在一起形成的五元环，如R4.5中那 样<formula>formula see original document page 26</formula>在^所示键处结合Xi和X2是彼此独立的N、 C、 O或S;
R8是H、卤族元素、-OH、 d-6垸基、C2-6烯基、C2-6炔基、-OH、 -NRaRb -(CH2)n-0-Re、 -0-(<:|.6垸基)、-S(O)pRe或-C(O)隱Rd;
R9是H、 Q.6烷基、取代C"6烷基、杂环、取代杂环或Rw其中R, 是
在^所示键处结合
R,o和Rn彼此独立，各自是H、卤素、C,.6垸氧基、取代d，6烷氧 基、-NRaRb或-OH;
各Ra和Rb彼此独立，各自为H、 C,-6垸基、取代Cl6院基、-C(0)Rd、 C6-i。方基；
各Re彼此独立，各自为H、磷酸基、二磷酸基、三磷酸基、Cw垸 基或取代C,.6垸基；
各Rd彼此独立，各自是H、卤素、Cw烷基、取代d.6垸基、
烷氧基、取代CL6垸氧基、-NH2、 -NH(d.6垸基)、-1^1(取代<:1.6烷
基)、^((3|.6垸基)2、 -N(取代C,.6烷基)2、 Cwo芳基或杂环；
各Re彼此独立，各自为H、 Cl6院基、取代Cl6院基、Cwo芳基、 取代C6.k)芳基、杂环或取代杂环；
各Rf彼此独立，各自为H、 Cl6院基、取代Cl6院基、-C(0)Rd、 磷酸基、二磷酸基或三磷酸基；
各n彼此独立，各自为0、 1、 2或3;
各p彼此独立，各自为O、 l或2;或者
或(g)(a)到(f)中任一化合物的药学上认可的盐，a)到(f)中任一化合物的互变
异构体，或所述互变异构体的药学上认可的盐。
洛索立宾(Loxoribine)(7-烯丙基-8-氧代鸟苷)[128]。 参考文献129公开的化合物，其中包括酰基哌嗪化合物、吲哚二酮化合 物、四羟异喹啉(THIQ)化合物、苯并环二酮化合物、氨基氮杂乙烯基化合
物、氨基苯并咪唑喹啉酮(ABIQ)化合物[130,131]、 Hydrapthalamide化合物、 二苯甲酮化合物、异恶唑化合物、甾醇化合物、2,4-喹唑啉二酮(Quinazilinone) 化合物、吡咯化合物[132]、蒽醌类化合物、喹喔啉化合物、三嗪化合物、 吡唑并嘧啶(Pyrazalopyrimidine)化合物、苯并唑类化合物[133]。
Polyoxidonium聚合物[134， 135]或其他N-氧化的聚乙烯-哌嗪衍生物。
参考文献136所公开的化合物。
氨基垸基氨基葡萄糖苷磷酸盐衍生物，如RC-529 [137,138]。
磷腈，如聚[二(羧酸苯氧基)磷腈]("PCPP")，见参考文献139和140。
CDld配基，如a-糖基神经酰胺[141-148](例如，a-半乳糖基神经酰胺)、含 植物壳氨醇的a-糖基神经酰胺、OCH、 KRN7000 [(2S,3S,4R)-l-0-(a-D-乳 糖吡喃基)-2-(N-十六烷酰基氨基)-l，3，4-十八垸三醇]、CRONY-101、 3"陽0-
硫代-半乳糖基神经酰胺等。
小分子免疫增强剂(SMIP)，如
N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2,4-二氨
N2,N2-二甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二氨
N2-乙基-N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二氨
N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2，4-二氨
l-(2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2,4-二氨
N2-丁基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二氨
N2-丁基-N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二氨
N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N2-戊基-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二氨
N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N2-丙-2-烯基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二氨
l-(2-甲基丙基)-2-[(苯基甲基)硫]-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺
1- (2-甲基丙基)-2-(丙基硫)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺
2- [[4-氨基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙醇 乙酸2-[[4-氨基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基] 乙酯
4-氨基-l-(2-甲基丙基)-l,3-二氢-2H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮 N2-丁基-l-(2-甲基丙基)-N4，N4-二(苯基甲基HH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2,4-二胺
N2-丁基-N2-甲基，l-(2-甲基丙基)-N4,N4-二(苯基甲基)-lH-咪唑并[4,5-c] 喹啉-2,4-二胺
N2-甲基-1 -(2-甲基丙基)-N4,N4-二(苯基甲基)-1 H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-
二胺
N2，N2-二甲基-l-(2-甲基丙基)-N4,N4-二(苯基甲基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹 啉-2,4-二胺
l-(4-氨基-2-[甲基(丙基)氨基]-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-l-yU-2-甲基异丙醇 -2-醇
l-[4-氨基-2-(丙基氨基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-l-yl]-2-甲基异丙醇-2-醇
N4，N4-二苯基-l-(2-甲氧基-2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉
-2,4-二胺。
可用于本发明的细胞因子诱导剂可以是Toll样受体(TLR)的调节剂和/或激动 剂。例如，可以是一种或多种人TLR1、 TLR2、 TLR3、 TLR4、 TLR7、 TLR8和/ 或TLR9蛋白的激动剂。优选的诱导剂是TLR7的激动剂(例如，咪唑并喹啉)和TLR9 的激动剂(例如，CpG寡核苷酸)。这些诱导剂可用于激活先天性免疫路径。
细胞因子诱导剂可在组合物制备过程的多个不同阶段加入到组合物中。例 如，可以将其包含在抗原组合物内，然后将该混合物加入水包油乳剂中。或者， 可将其包含在水包油乳剂中，在这种情况下，诱导剂可以在乳化前加入乳剂组分， 也可以在乳化后加入乳剂。同样，可将诱导剂通过凝聚作用(coacervation)包含在 乳剂液滴中。细胞因子诱导剂在最终组合物中的位置和分布取决于其亲水/亲脂特 性，例如，所述诱导剂可位于水相中、位于油相中和/或位于油-水界面上。
可将细胞因子诱导剂与另一物质(例如抗原，例如CRM197)缀合。有关小分 子缀合技术可参见参考文献149。或者，佐剂也可以与其他物质非共价连接，例 如通过疏水相互作用或离子间相互作用连接。
两种优选的细胞因子诱导剂是(a)免疫刺激性寡核苷酸和(b)3dMPL。
免疫刺激性寡核苷酸包括核苷酸修饰物/类似物，如磷硫酰修饰，可以是双链 或者(RNA除外)单链。参考文献150、 151和152公开了可能的同类性取代，例 如，用2，-脱氧-7-去氮鸟苷取代尿苷。CpG寡核苷酸的佐剂效应在参考文献 153-158中有进一步的讨论。CpG序列可以指LTR9，如基序GTCGTT或TTCGTT [159]。 CpG序列可以是特异性诱导Thl免疫反应的，如CpG-AODN(寡脱氧核苷 酸)，或者更具有诱导B细胞反应的特异性，如CpG-B ODN。CpG-A和CpG-B ODN 见于参考文献160-162的描述。CpG优选CpG-A ODN。优选的是，CpG寡核苷 酸的构造使其5'末端能被受体识别到。可选的是，两种CpG寡核苷酸序列可以在3'末端互连成"免疫聚合物(immunomer)"。参见，例如，参考文献159和163-165 。有用的CpG佐剂之一是CpG7909，也被称为ProMuneTM(考利制药基团公司 (Coley Pharmaceutical Group, Inc.))。
可用TpG序列[166]替代CpG序列，或者与CpG序列联用。这类寡核苷酸可 不包含非甲基化的CpG基序。
免疫刺激性寡核苷酸可以是富含嘧啶的。例如，它可以包含一个以上连续嘧 啶核苷酸(例如，TTTT，如参考文献166所述)，并且/或者，它的核苷酸组成可以 是胸腺嘧啶>25%(例如，>35%、 >40%、 >50%、 >60%、 >80%等)。例如，它可以 包含一个以上的连续胞嘧啶核苷酸(例如，CCCC，如参考文献166所述)，并且/ 或者，核苷酸组成中胞嘧啶〉25°/。(例如，>35%、 >40%、 >50%、 >60%、 >80%等) 。此类寡核苷酸可以不含非甲基化CpG基序。
免疫刺激性寡核苷酸一般包含至少20个核苷酸。可以包含少于100个核苷酸。
以免疫刺激性寡核苷酸为基础的一种特别有用的佐剂是IC31TMn67]。因此，
可用于本发明的佐剂之一可包含以下物质的混合物(i)至少包含一个(优选多 个)CpI基序的寡核苷酸和(ii)多聚阳离子聚合物，如包含至少一个(优选多 个)Lys-Arg-Lys三肽序列的寡肽(例如，5-20个氨基酸)。寡核苷酸可以是包含26-碱基序列5'-(IC)13-3'(SEQ ID NO: l)的脱氧核苷酸。多聚阳离子聚合物可使是包含 11-残基氨基酸序列KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO: 2)的肽。
3dMPL(亦称3脱-O-酰基化单磷酰脂质A或3-0-去酰基-4'-单磷酰脂质A)是 一种佐剂，其中单磷酰脂质A内还原性末端葡糖胺的3位被去酰化。已经从明尼 苏达沙门氏菌(Salmonellaminnesota)的无庚糖突变株中制备出了 3dMPL，在化学 结构上与脂质A类似，但是没有对酸敏感的磷酰基和对碱敏感的酰基。它能够活 化单核细胞/巨噬细胞系的细胞，刺激细胞释放多种细胞因子，其中包括IL-1、 IL-12、 TNF-a和GM-CSF(也可参见参考文献168)。 3dMPL的制备方法最早可见 参考文献169。
3dMPL的形式可以是相关分子的混合物，所述相关分子的酰化程度各不相同 (例如，具有3、 4、 5或6个酰基链，且链长不同)。两个葡糖胺(也被称为2-脱氧 -2-氨基-葡萄糖)单糖在其2位碳原子上(即2位和2'位上)发生N-酰化，在3'位上 还有O-酰化。连接在2位碳原子上的基团的化学式为-NH-CO-CH2-CR1111、连接 在2'位碳原子上的基团的化学式为-NH-CO-CH2-CR21^。连接在3'位碳原子上的 基团具有化学式-0-CO-CH2-CR3113、典型的结构是R1
基团r1、 112和r3彼此独立，是一(CH2)n—CH3。 n的值优选8-16，更优选9-12， 最优选的是10。
基团r，'、 r"和r3'彼此独立，是(a)-h; (b)-oh或(c)一o-co-r4，其中r4 是-H或-(CH2)m-CH3，其中m的值优选8-16，更优选10、 12或14。在2位上， m优选14。在2'位上，m优选10。在3'位上，m优选12。因此，基团R，'、 R2' 和W优选源自正十二垸酸、十四垸酸或十六烷酸的-o-酰基基团。
当R"、 R"和W都是-H时，3dMPL只有3个酰基链(2、 2，和3'位上各有一个) 。当R"'、 R2、 R3'中两个是-H时，3dMPL可具有4个酰基链。当Rr、 R"和R3' 中只有一个是-H时，3dMPL可具有5个酰基链。当R"、 R"和W都不是-H时， 3dMPL可具有6个酰基链。可用于本发明的3dMPL佐剂可以是上述3至6酰基 链形式的混合物，但优选的是，混合物中包含带6个酰基链的3dMPL，特别是确 保带6个酰基链的形式占3dMPL总重量的至少10%，例如^20%、 ^30%、 ^40%、 250%或更高。目前认为带6个酰基链的3dMPL是佐剂活性最高的形式。
因此，本发明的组合物中所包含的最优选形式的3dMPL具有结构式(IV):当使用3dMPL多种形式的混合物时，组合物中3dMPL含量或浓度指混合物 内各种3dMPL的总和。
在水性条件下，3dMPL可形成不同大小的凝集物胶束或颗粒，例如，直径 〈150nm或〉500nm。本发明可使用这两种直径颗粒中的任一种或两种，可以通过 常规实验筛选较好的颗粒。本发明优选较小的颗粒(例如，小到足以使3dMPL的 水性悬液透明)，因为它们具有超高的活性[170]。优选的颗粒平均直径小于220 nm，更优选的小于200 nm或150 nm或120 nm，甚至小于100 nm。但是在大多 数情况下，平均直径不小于50nm。就过滤灭菌而言，这些颗粒足够小，因而是 适宜的。可用常规的动态光散射技术来测定颗粒直径，测得的将是平均粒径。称 颗粒直径为xnm时，通常是指存在有位于这个平均值周围的粒径分布，至少有 50%(例如，^60%、 ^70%、 ^80%、三90%或更高)的颗粒其直径为x±25%。
较好的是将3dMPL与水包油乳剂混合使用。基本上所有的3dMPL都位于乳 剂的水相内。
3dMPL可单独使用，也可以和一种或多种其他化合物组合使用。例如，已知 可以和3dMPL组合使用的有QS21皂苷[171](包含在水包油乳剂中[172])、免疫刺 激性寡核苷酸、QS21加免疫刺激性寡核苷酸、磷酸铝[173]、氢氧化铝[174]或磷酸铝加氢氧化铝。
脂肪类佐剂
可用于本发明的脂肪类佐剂包括上述水包油乳剂，另外还包括，例如
具有结构式i、 ii或m的化合物或其盐
<formula>formula see original document page 33</formula>如参考文献175所定义，如"ER 803058"、 "ER 803732"、 "ER 804053"、 "ER 804058"、 "ER 804059"、 "ER 804442"、 "ER 804680"、 "ER 804764 "、"ER 803022"或"ER 804057"。例如<formula>formula see original document page 33</formula> 大肠杆菌如OM-174来源的脂质A的衍生物(描述于参考文献176和177)
阳离子脂质和(通常是中性的)共脂质(co-lipid)的制剂，如氨基丙基-二甲基-.肉豆蔻脑酰氧基四丙基溴化铵-二植垸酸磷酯酰基-乙醇胺("VaxfectinTM") 或氨基丙基-二甲基-二-十二烷酰氧基-四丙基溴化铵-二油酰基磷酯酰基-乙 醇胺)"GAP-DLRIE:DOPE")。包含(土)-N-(3-氨基丙基)-N，N-二甲基-2,3-二 (顺-9-十四烯基氧基)-1-四丙基铵盐的制剂是优选的[178]。
3-0-去酰化的单磷酰脂质A(见上)。
含有连在含磷酸非环状骨架上的脂质的化合物，如TLR4拮抗剂E5564 [179,180]:
铝盐佐剂
可以使用被称为氢氧化铝和磷酸铝的佐剂。这些名称是方便起见的通用名， 并非是对实际化合物的精确描述(参见参考文献97181的9章)。本发明可以采用 佐剂常用的各种"氢氧化物"或"磷酸盐"佐剂。
被称为"氢氧化铝"的佐剂一般是羟基氧化铝盐，通常至少部分结晶。羟基 氧化铝可用化学式A10(OH)表示，通过红外(IR)光谱可以将其与其他铝化合物如 氢氧化铝Al(OH)3区分开来，特别是根据化合物在1070cm—1处的吸收带，在3090-3100cnT1处的肩峰[参考文献97的9章]。半高衍射带宽度(WHH)可反映氢 氧化铝佐剂的结晶度，结晶度低的颗粒由于晶体较小因而显示出更大的谱线增宽 。表面积随WHH的增大而增大，具有高WHH的佐剂具有更高的抗原吸附容量 。纤维状是氢氧化铝佐剂的典型形态(例如，如透射电镜显微照片所示)。氢氧化 铝佐剂的pl通常约为11，即，在生理pH条件下佐剂自身带正电荷。有报道称氢 氧化铝佐剂在pH7.4的的吸附容量为1.8-2.6 mg蛋白/mg Al+++。
被称为"磷酸铝"的佐剂通常是羟基磷酸铝，常常还包含少量的硫酸盐(即， 羟基磷酸铝硫酸铝)。可通过沉淀来获得此类盐，沉淀期间的反应条件和浓度会影 响盐中磷酸根取代羟基的程度。羟基磷酸盐内的P04/A1摩尔比通常在0.3到1.2 之间。可根据羟基基团的存在将羟基磷酸盐与严格的A1P04区分开来。例如， 3164cm"处的红外光谱(例如，加热到200°C时)可显示结构中羟基的存在[参考文 献97的9章]。
磷酸铝佐剂内的P04/A1"摩尔比通常在0.3到1.2之间，优选0.8-1.2，更优 选0.95土0.1。磷酸铝通常是无定形的，特别是羟基磷酸盐。典型的佐剂之一是 P04/A1摩尔比在0.84到0.92之间的无定形羟基磷酸铝，内含0.6mg Al3+/ml。磷 酸铝通常是颗粒(例如，透射电镜显微照片中显示的盘状)。吸附抗原后的颗粒直 径一般在0.5-20pm范围内(例如，约5-10nm)。据报道，当pH为7.4时，磷酸铝 佐剂的吸附容量为0.7-1.5 mg蛋白/mg A1+++ 。
磷酸铝的零电荷点(PZC)与磷酸根取代羟基的程度成负相关关系，这种取代 的程度随沉淀制备该盐时使用的反应条件和反应物浓度的不同而不同。改变溶液 中游离磷酸根离子的浓度(磷酸根越多PZC越偏酸性)或者添加缓冲剂如组氨酸 缓冲剂(可以使PZC变得更碱性)也可以改变PZC。用于本发明的磷酸铝的PZC 一般在4.0到7.0之间，更优选5.0到6.5之间，例如约5.7。
用于制备本发明的组合物的铝盐悬液可包含缓冲剂(例如，磷酸盐或组氨酸或 Tris缓冲剂)，但这并不总是必需的。本发明悬液优选无菌无热原。悬液可包含游 离水性磷酸根离子，浓度例如1.0-20 mM，优选5-15mM，以及更优选约10 mM 。悬液还可包含氯化钠。
本发明可使用氢氧化铝和磷酸铝的混合物[68]。此时，磷酸铝的含量可超过 氢氧化铝，例如两者的重量百分比至少为2:1，如^5:1、 ^6:1、 ^7:1、 ^8:1、 ^9:1 等。
用于患者给药的组合物中的八1+++浓度优选低于10mg/ml，例如，55mg/ml、 S4mg/ml、 53mg/ml、 ￡2 mg/ml、 Slmg/ml等。优选范围是0.3-1 mg/ml。优选最 大值0.85mg/剂。
包含一种或多种铝盐佐剂之外，佐剂组分还可包括一种或多种其他佐剂或免疫刺激因子。这种其他组分包括而不限于3-0-去酰化的单磷酰脂质A佐剂
("3dMPL");禾口/或水包油乳剂。3d-MPL也被称为3去-O-酰化的单磷酰脂质A 或3-0-去酰-4'-单磷酰脂质A。该名称意味着单磷酰脂质A上的还原性末端葡糖 胺的3位去酰化。已经从明尼苏达沙门氏菌的无庚糖突变株中制备出了 3dMPL， 在化学结构上与脂质A类似，但是没有对酸敏感的磷酰基和对碱敏感的酰基。它 可以活化单核细胞/巨噬细胞系的细胞，刺激细胞释放数种细胞因子，其中包括 IL-1、 IL-12、 TNF-a和GM-CSF。参考文献169最先描述了 3d-MPL的制备方法， 考利萨公司(Codxa Corporation)生产和销售该产品，名称为MPLTM。其他细节可 见于参考文献111到114的描述。
本发明的试剂盒
本发明的组合物可以在给药时即时制备，特别是在使用佐剂时。因此，本发 明提供了包含有待混合的各组分的试剂盒。试剂盒将佐剂和抗原分开，直到使用 时再混合。这种安排在使用水包油乳剂型佐剂时是有用的。
组分在试剂盒内在物理意义上彼此分开，可通过各种方式实现这种分开。例 如，将两种组分装在两个容器(如瓶子)内。然后将两个瓶子的内容物混合，例如， 从一个瓶子中取出其内容物加到另一个瓶子内，或者分别从两个瓶子中取出内容 物，然后在第三个容器内混合。
在一个优选的实施方式中，试剂盒的组分之一装在注射器内，另一组分装在 瓶子之类的容器内。用注射器(例如带针头的注射器)将其内容物注入第二容器内 混合，然后将混合物抽吸到注射器内。然后可将注射器内混合好的内容物注射给 患者，为此通常需使用一个新的无菌针头。将组分之一装在注射器内就无需另用 一个注射器来给患者给药。
在另一个优选实施方式中，试剂盒的这两个组分装在同一个注射器内但彼此 隔开，例如，采用双腔注射器，如参考文献182-189等所述的那些。当注射器启 用时(例如，在给患者注射时)两个腔室的内容物混合在一起。这种安排可省略使 用时独立的混合步骤。
试剂盒的组分通常是水溶液。在某些安排中，组分之一(一般是抗原组分而不 是佐剂组分)是干燥物形式的(例如，冻干形式)，而其他组分则是水溶液。可将两 种组分混合从而重新活化干燥物组分，得到用于给患者注射的水性组合物。冻干 组分通常装在瓶子中而不是注射器内。干燥的组分可包含稳定剂如乳糖、蔗糖或 甘露醇及其混合物，例如乳糖/蔗糖混合物等。 一种可行的安排是预装在注射器内 的水性佐剂和装在瓶子内的冻干抗原组分。组合物或试剂盒组分的包装
适于盛装本发明的组合物(或试剂盒组分)的容器包括瓶子'、注射器(例如，一 次性注射器)、鼻腔喷雾器等。这些容器应该是无菌的。
如果组合物/组分位于瓶子(vial)内，那么瓶子优选用玻璃或塑料材料制成。 优选在装入组合物前将瓶子消毒灭菌。由于某些患者对乳胶过敏，瓶子最好用不 含乳胶的塞子封闭，并且，最好所有的包装材料都不含乳胶。瓶子内可装入单次 剂量的疫苗，也可以装入多次剂量("多剂量"瓶子)。瓶子优选用无色玻璃制造
瓶子可带有这样的瓶盖(例如，卢尔锁(Luer Lock))，该瓶盖的构造允许载药 注射器插入盖内，注射器的内容物推射到瓶内(例如，由此令冻干材料重生)，然 后，瓶内物质可吸回注射器内。将注射器从瓶子上拔下后，安装上针头，就可将 组合物注射给患者。优选将瓶盖包封或覆盖，.这样在取下盖子前必须先去掉封膜 或覆盖物。瓶子，尤其是多剂量瓶子，可带有能够在取用内容物时保持无菌的瓶
盖o
当用注射器盛装组分时，注射器可带针头。如果不带针头，应该为注射器另 外配备针头以便安装和使用。此时，可以给针头加上护套。优选安全针头。通常
使用l英寸23号、 一英寸25号和5/8英寸25号针头。注射器上可贴上剥离型标 签，将批号、流感季节和内容物有效期印刷在上面以保存记录。注射器的柱塞最 好带有一个挡块以免在抽吸时柱塞意外抽出。注射器可带有乳胶橡胶帽和/或柱塞 。 一次性注射器装有一次剂量的疫苗。注射器通常带有一个尖头帽，用于在安装 针头前封住注射器尖头，尖头帽优选用丁基橡胶制成。如果注射器和针头分开包 装，那么针头套优选用丁基橡胶套。可用的注射器和针头有市售的"Tip-Lok"TM系列。
容器上可标明半剂量体积，这样便于儿童使用。例如，含0.5ml剂量的注射 器可标明0.25 ml所在的刻度。
如果使用玻璃容器(例如，注射器或瓶子)，那么优选用硼硅玻璃而不是钠钙 玻璃制成的容器。
与试剂盒或组合物包装在一起的可以有插页(例如，包在同一个盒子里)，插 页上包含疫苗的详细信息，例如，使用说明、疫苗内抗原的详细信息等。说明书 可包括注意事项，例如，在免疫后有可能发生过敏反应的情况下应准备好肾上腺 素溶液等。
治疗方法和疫苗的给药途径
37本发明的组合物适用于人患者，本发明提供了在患者体内诱导免疫反应的方 法，该方法包括给予患者本发明的组合物。
本发明还提供了可作为药品使用的试剂盒或组合物。
本发明还提供了来自于四种不同流感毒株的抗原在生产用于在患者体内诱 导免疫反应的药物中的用途。在某些实施方式中，利用在细胞培养物中培养的病 毒制备抗原。在某些实施方式中还用到佐剂。在某些实施方式中，抗原不是裂解 或完整病毒体抗原，而是活病毒或纯化的表面糖蛋白。在某些实施方式中，所述 制药用途提供的疫苗中，各流感毒株血凝素的含量基本相同。
这些方法和用途通常用于诱导抗体反应，优选保护性抗体反应。分析流感病 毒疫苗免疫后的抗体反应、中和能力和保护作用的方法是本领域熟知的。人体实 验结果表明，抗人流感病毒血凝素的抗体滴度与保护作用呈正相关关系(血清样本 内血凝素抑制滴度达到约30-40时所产生的保护作用可抑制约50%的同源病毒感
染)[190]。抗体反应一般用血凝素抑制、微量中和法、单辐射免疫扩散(SRID)和/ 或单辐射溶血分析(SRH)来测得。这些分析就是都是本领域熟知的。
本发明的组合物可以多种途径给药。最优选的免疫途径是肌肉注射(例如，注 射到胳膊或大腿内)，但是其他可用的途径还有皮下注射、鼻内给药[191一193]、 经口给药[194]、真皮内注射[195，196]、经皮注射、透皮注射[197]等。
按照本发明的方法制备的疫苗可用于治疗儿童和成人。目前推荐将流感疫苗 用于儿科和成人免疫接种，从6个月大开始。因此，患者可以是l岁以下、1-5 岁、5-15岁、15-55岁或55岁以上。优选的流感疫苗接种者有高龄的(例如250 岁、^60岁，优选^65岁)、低龄的(例如，￡5岁)、住院患者、医疗保健人员、军 人、孕妇、慢性病患者、免疫缺陷患者、接种疫苗前7天内服用过抗病毒药物(例 如，奥司他韦或扎那米韦；见下文)的患者、对鸡蛋过敏的人以及到国外旅行的人 。疫苗不仅适用于这些人群，还可推广到更多其他人群。
包含来源于多株B型流感病毒的抗原的疫苗特别适合用于治疗0-15岁的患 者群。
本发明的优选组合物可满足疗效CPMP标准的1、 2或3条。对于成人来说 (18-60岁)，这些标准是(1)^70%的血清保护；(2)^40%的血清转化；禾卩/或(3)GMT 升高^2.5倍。对于高龄患者来说(>60岁)，这些标准是(1)^60%的血清保护； (2)230%的血清转化；和/或(3)GMT升高^2倍。这些标准是根据至少包括50个患 者的开放性研究(Open Label Study)制定的。
治疗可釆用单剂量方案或多剂量方案。多剂量方案可用于初次免疫和/或加强 免疫。在多剂量方案中，不同的剂量可通过相同的或不同的途径给药，例如，胃 肠外途径初次免疫加粘膜途径加强免疫，粘膜途径初次免疫加胃肠外途径加强免疫等。多剂量给药(一般两次)特别适用于初免患者，例如，以前从未接种过流感 疫苗的人群或未接种过新HA亚型疫苗的人群。多剂量通常至少间隔1周给药(例
如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约12周、约16周等)。
根据本发明的方法生产的疫苗可与其他疫苗一起基本同时(例如，在同一次医 疗咨询或看医生或访问疫苗接种中心期间)给药，所述其它疫苗例如麻疹疫苗、腮 腺炎疫苗、风疹疫苗、麻风腮疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风 疫苗、百日咳疫苗、百白破疫苗、结合的流感b型疫苗、灭活脊髓灰质炎疫苗、 乙肝疫苗、脑膜炎球菌结合疫苗(如三价A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞病毒疫 苗、肺炎球菌结合疫苗等。对于高龄患者来说优选与肺炎球菌疫苗和/或脑膜炎球 菌疫苗基本上同时给药。
同样，本发明的疫苗可与抗病毒化合物基本上同时给药(例如，在同一次医疗 咨询或看医生期间)，特别是具有抗流感病毒活性的抗病毒化合物(例如，奥司他 韦和/或扎那米韦)。这些抗病毒化合物包括神经氨酸酶抑制剂，如(3R，4R,5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(l-乙基丙氧基)-l-环己烯-l-羧酸或5-(乙酰基氨基)-4-[(氨基 亚胺甲基)-氨基]-2,6-无水-3，4,5-三脱氧-D-甘油-D-半乳糖酮-2-烯酸 (galactonon-2-enonicacid)，包括其酯(例如，乙基酯)和其盐(例如，磷酸盐)。优选 的抗病毒化合物是(311,411,58)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸、乙基酯、磷酸盐(l:l)，也被称为磷酸奥司他韦(oseltamivirphosphate)(达菲 (TAMIFLU丁m))。
B型流感毒株的季节性交变
本发明内容之一是提供挑选用于连续流感病毒季的B型流感病毒的方法(南 半球或北半球)，所述连续流感病毒季中，B/Victoria/2/87-样毒株和 B/Yamagata/16/88-样毒株在前一季和后一季中交替，不论用何种流行病学分析。 这些疫苗可以是三价疫苗或三价以上的疫苗，但是它们都仅仅包含 B/Victoria/2/87-样抗原或B/Yamagata/16/88-样抗原作为B型流感病毒，不同时包 含这两种抗原。
因此，本发明提供制备三个连续流感季节的流感疫苗的方法(北半球流感季节 或南半球流感季节)，其中每一季节的疫苗都包含一株B型流感病毒来源的抗原， 其中第一季节的疫苗包含B/Victoria/2/87-样毒株来源的抗原，第二季节的疫苗包 含B/Yamagata/16/88-样毒株来源的抗原，第三季节的疫苗包含B/Victoria/2/87-样
毒株来源的抗原。
同样，本发明提供了制备三个连续流感季节的流感疫苗的方法(北半球流感季 节或南半球流感季节)，其中每一季节的疫苗都包含一株B型流感病毒来源的抗原，其中第一季节的疫苗包含B/Yamagata/16/88-样毒株来源的抗原，第二季节的 疫苗包含B/Victoria/2/87-样毒株来源的抗原，第三季的疫苗包含 B/Yamagata/16/88-样毒株来源的抗原。
更进一步说，本发明提供至少三个连续流感季节的流感疫苗的方法(北半球流 感季节或南半球流感季节)，其中(a)每一季节的疫苗都包含一株B型流感病毒来 源的抗原，(b)其中第一季节的疫苗包含B/Yamagata/16/88-样毒株或 B/Victoria/2/87-样毒株来源的抗原，以及(b)，如果上一季节的疫苗包含 B/Vktoria/2/87-样毒株来源的抗原，那么下一季节的疫苗包含 B/Yamagata/16/88-样毒株来源的抗原，或者，如果上一季节的疫苗包含 B/Yamagata/16/88-样毒株来源的抗原，那么下一季节的疫苗包含 B/Victoria/2/87-样毒株来源的抗原。因此，第一季的抗原选自B/Yamagata/16/88-样 毒株或者B/Victoria/2/87-样毒株，此后的每一季都在二者之间交替。 这种交替循 环可持续3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20或更多个连续季。第一季优选2007/08或更晚。
包含H5毒株的多价疫苗
本发明提供了三价或三价以上流感疫苗，其中包含来自于至少一株A型流感 病毒大流行株的抗原、至少一株A型流感病毒非大流行株(例如，HI禾B/或H3) 的抗原和至少一株B型流感病毒的抗原。据目前预计，大流行株将是H5毒株， 因此疫苗包含H5抗原、非H5 A型流感病毒抗原和B型流感病毒抗原。疫苗的 其他特征在本文的其他地方有描述。
因此，本发明提供了一种三价流感病毒疫苗，其中包含来自于H5 A型流感 毒株、H3N2A型流感毒株和B型流感毒株的抗原。
本发明还提供了一种三价流感病毒疫苗，其中包含来自于H1N1 A型流感毒 株、H5A型流感毒株和B型流感毒株的抗原。
目前的季节性疫苗优选调配成包含来自于大流行或潜在大流行流感毒株的 抗原。从公共健康的角度考虑，通过疫苗接种防御大流行株的保障难度要远低于 分别分发季节性疫苗和大流行性疫苗。另外，患者接种既能预防季节性毒株又能 预防大流行毒株的一种疫苗会更安全，且有助于提高患者的依从性。这种疫苗可 通过生产一种普通三价季节性疫苗和另一种单价大流行疫苗然后在使用时混合 成一种组合物来完成。另外，也可制备四批抗原，在包装和分发前混合在一起。
因此，本发明还提供四价流感病毒疫苗，其中包含来自于H1N1 A型流感毒 株、H3N2A型流感毒株、大流行A型流感毒株和B型流感毒株的抗原。
这些疫苗优选包含佐剂，如水包油乳剂(如本文其他地方所述)。佐剂可用于增强大流行毒株所激发的免疫反应，患者对大流行株无免疫力。
在这些四价疫苗中，A-H1N1、 A-H3N2和B的抗原剂量可基本一致，例如 15貼/剂。大流行株的抗原剂量可以低于该剂量，例如，低于10吗/剂。如果 A-H1N1、 A-H3N2和B的平均HA剂量是d )ag/剂，那么大流行株的HA剂量将 低于0.75x d jLig/剂，例如0.7x、 0.6x、 0.5x、 0.4x、 0.3x、 0.25x、 0.2x或O.lx。 A-H1N1、 A-H3N2和B各自HA的剂量优选在赴10%以内。在一个实施方式中， 三个季节性毒株HA的含量/剂在15-20pg之间，大流行株HA的含量/剂约为 7.5-10jag，例如，季节性毒株为约15pg/株，而大流行株为约7.5pg。
本发明还提供了用于制备这种疫苗的试剂盒。因此，本发明提供了包含如下 材料的试剂盒(i)包含流感疫苗的第一容器，其中的流感疫苗包含来自于H1N1 A 型流感毒株、H3N2A型流感毒株和B型流感毒株的抗原；以及(ii)包含流感疫苗 的第二容器，其中的流感疫苗包含来自于大流行株如H5毒株的抗原，例如，H5N1 。第一和第二容器的内容物在使用时混合成组合疫苗，然后将此组合疫苗给予患 者。可将类似的试剂盒用于B型流感病毒疫苗和普通季节性疫苗的共同给药。
在这种试剂盒的某些实施方式中，第一容器不含疫苗佐剂，但是第二容器包 含疫苗佐剂，例如，水包油乳剂。因而混合后得到的疫苗包含佐剂。
本发明还提供了制备组合流感疫苗的方法，该方法包括步骤(i)批量制备 H1N1 A型流感病毒抗原；(ii)批量制备H3N21 A型流感病毒抗原；(iii)批量制 备大流行A型流感病毒如H5N1 A型流感病毒抗原；(iv)批量制备B型流感病毒 抗原；以及(v)将各批量抗原混合并稀释，得到组合疫苗，其中每一种抗原都为适 宜的浓度。这种抗原可装在容器内提供给患者使用，如本文其他地方所述。
一般事宜
术语"包含"的意思包括"包括"以及"由...组成"，例如，"包含"X的组 合物可以只由X组成，也可以包含其他物质，例如X + Y。
术语"基本上"不排除"完全"的意思，例如，组合物"基本不含"Y可以 是完全不含Y。如有必要，单词"基本上"可从本发明的定义中省略。 "约"为数值x意味着例如x土10。/。。
除非特别指明，包含混合两种或多种组分的步骤不要求特定的混合顺序。因 此，组分可以任何顺序混合。如果有三种组分，那么可以先混合两种组分，然后 再与第三种组分混合，等等。
如果在培养细胞时使用了动物(特别是牛)来源的材料，那么应该是来自于未 患传染性海绵状脑病(TSE)的动物，尤其是未患牛海绵状脑病(BSE)。总之，培养 细胞时优选不添加任何动物来源的材料。
41如果将化合物作为组合物的一部分给药，那么化合物可用合适的前药代替。 如果以细胞为支持物进行重排或反向遗传学方法，或者扩增病毒，那么优选 用已经批准可用于人疫苗生产的细胞，例如，如欧洲药典总则5.2.3章所述。


图1到3显示的是疫苗储存在(1)2-8。C、 (2)23-27°C或(3)35-39。C期间的稳定 性。图1中图的X轴代表月数，图2中图的X轴代表天数。Y轴代表HA水平， 水平线分别代表季节性抗原(上线)和大流行抗原(下线)的稳定性阈值。在图1和3 中，三组柱从左到右分别代表FLUAD ;四价疫苗和AFLUNOV 。在图2中， 两组柱分别是FLUADtm和四价疫苗。在每一个时间点上，显示的数据分别是 H1N1(水平条)、H3N2(浅阴影)、B(空白)和H5N1(交叉阴影)的数据。
本发明的实施方式 A-A-B-B疫苗
在最近几年，B型流感病毒的Victoria/2/87-样毒株和Yamagata/16/88-样毒株 ("V"系和"Y"系)同时流行，逐年交替地分别对整个季节性流行病防控造成负 担。过去几年所用的疫苗或者包含V系或者包含Y系。从2001/02季开始，全美 流感病例总数中0到29.9%本可以通过在疫苗中包含其他毒株系而避免，从 2001/02开始的5年中有4年，因B型病毒不匹配造成的流感病例其比例实际上 超过了 A/H1N1病毒造成的病例
年NH3N2H1N1B 总体B Y系B V系未覆盖
2005 2006101955%13.2%31.5%5.8% (18.7%)25.6% (81.3%)25.6%
2004 2005107565.9%1%33%24.5% (74.4%)8.5% (25.6%)8.5%
2003 2004102492.6%0.3%6.9%6.4% (92.9%)0.4% (7%)6.4%
2002 200369920.5%41.1%38.5%0.01% (0.1%)38.5% (99.9%)-
2001 200269054.0%4.3%38.7%8.8% (22.8%)29.9% (77.1%)29.9%
N是流感病例数；百分数显示的是造成那些病例的病毒类型B型流感病毒 中有下划线的数字代表的是该季节疫苗中包含的系；"未覆盖"是指由该季
42节疫苗中未包含的B型流感病毒导致的流感病例所占的比例。
因此，增加"遗漏的"B型病毒形成四价疫苗本可以在过去5年中每个流感 季节预防住高达30%的流感病例，但是基于鸡蛋的生产技术无法生产出这种疫苗 。细胞培养技术可克服这一难题。
A-A-A-B疫苗
通过分析1999-2004年间采集的H3N2 A型流感毒株的基因组发现，尽管2002 年以后分离的大多数毒株都属于一个系统发生组(进化分枝A)，但是在某些特定 的时间点存在多个病毒系同时流行[l]。在2003-04流感季，北半球和南半球都出 现了重要的漂移突变株，即A/Fujian/411/2002-样突变株。2001/02年在美国发生 的流感主要是由H3N2引起的，分离株的所有抗原性特征都与A/Moscow/10/1999 疫苗株相符。在后一个流感季节，疾病主要是由H1型B型流感病毒引起的，少 量H3N2分离株的抗原性特征与Moscow/10/1999-样疫苗株不同，可能与同时出 现了Fujian株有关。2003/04流感季在北半球主要以Fujian株为主，但是所使用 的疫苗株包含的是来自于上一年的H3N2(A/Panama/2007/1999)。这个毒株的抗原 性与Fujian株匹配率很低，这降低了疫苗的效果。FDA曾不允许使用Fujian毒株， 因为它最初不是从鸡蛋中分离出来的[198，199]，并且没有抗原性与之相似的鸡蛋 分离株可用。无需用鸡蛋进行分离和/传代可避免这种状况，细胞培养技术解决了 这一问题。另外，同一流感病毒疫苗包含'两株H3N2就能够避免因 A/Moscow/10/99-样毒株和A/Fujian/411/2002-样毒株之间缺少交叉反应而导致的 各种问题。
包含季节性毒株和大流行性毒株的疫苗
目前所用的季节性流感疫苗包含来自于一株H1N1 A型流感病毒、一株H3N2 A型流感病毒和一株B型流感病毒来源的血凝素抗原。这种季节性抗原组合还被 添加了来自于H5N1流感毒株的抗原，即可能导致流感大流行的毒株。
季节性疫苗的制备包括分别从A/New Caledonia H1N1毒株、A/Wisconsin H3N2毒株和B/Malaysia毒株纯化表面糖蛋白。抗原剂量为30jxg/ml， 15pg/株/ 剂，有15%的余量。用2x强度(strength)的批量抗原进行混合，用MF59水包油 乳剂以1:1的体积比稀释，得到最终的三价疫苗，以FLUADTM的商品名销售。
大流行前(pre-pandemic)疫苗的制备是基于从H5Nl A型流感病毒纯化的表面 糖蛋白。抗原剂量为15pg/ml， 15ng/株/剂，有15%的余量。用2x强度的批量抗原混合，用MF59水包油乳剂以1:1的体积比稀释得，到最终的三价疫苗 (AFLUNOV顶)。
四价疫苗仍以这四种病毒抗原制备。季节性抗原的含量与FLUADtm内的HA 浓度相同，但是H5N1抗原的含量为7.5pg/剂，无余量。用2x强度的抗原混合， 用MF59水包油乳剂以1:1的体积比稀释得到最终的四价疫苗。这种疫苗与 FLUADtm和AFLUNOVTM的简单混合物不同，因为该疫苗在0.5 ml的体积内包含 了全剂量的抗原，而简单混合物需1 ml体积才能提供全剂量。
为了进行稳定性研究，将疫苗储存在(1)2-8。C冷藏至少3个月；(2)23-27°C 的室温下保存至少14天；(3)35-39°C的升高温度下保存至少7天。在储存期间的 不同时间点分析抗原水平以确定稳定性。如果实验期间抗原水平对比目标抗原水 平降低20%以上则组合物被判定为不稳定。图1到3显示的是实验结果。
图1的结果说明，FLUADTM制剂的冷藏稳定期可达6个月，，在3个月的研究 期间，H5N1毒株的加入没有导致任何季节性抗原的稳定性降低到阈值以下。类 似的，AFLUNOVTM制剂可保持稳定达9个月，在3个月的研究期间，季节性抗 原的加入没有导致H5N1抗原的稳定性降低到阈值以下。
图2的结果说明FLUADTM制剂内的抗原在室温下保存7天是稳定的，但是B
型流感病毒抗原在14天时降低到稳定性阈值以下。在存在H5N1毒株时抗原的 稳定性也能保持7天。H5N1抗原在四价疫苗组合物内可以保持至少14天的稳定性。
图3的结果说明FLUADTM制剂内的抗原在升高的温度下储存i天是稳定的， 但是B型流感病毒抗原在3天时降低到稳定性阈值以下。AFLUNOVTM的稳定性 也能保持7天。H5N1抗原在四价疫苗组合物内可以保持至少7天的稳定性，并 且，它不会导致季节性抗原的稳定性比FLUADTM制剂内的季节性抗原更快地降 低到阈值以下。
因此，H5N1抗原可在佐剂存在的情况下与季节性抗原组合使用，不会导致 四种抗原中任一抗原的稳定性降低。
在分别进行的效力实验中，AGRIPPALTM季节性疫苗和AFLUNOV H5N1 含佐剂疫苗分别、联合(concomitantly)或混合后作为组合疫苗给予患者。患者分 为8组，每组50例。第1至l」3组在0时间点给予联用(concomitant)疫苗。第4到 6组在0时间点给予组合(combination)疫苗。第7组在0时间点接种AFLUNOVTM， 第8组在0时间点接种AGRIPPALtm。
第21天时，第1和4组不再接种其他疫苗，但是其他组则进行第二次接种 。第2和5组接种组合疫苗。第3、 6和8组接种AFLUNOV 。第7组接种 AGRIPPALTM。第365天时，所有组都接种AFLUNOVtm，评估免疫反应。
应当理解的是，本发明只是以实施例的方式进行了描述，只要不超出本发明 的范围和精神，就可以对本发明作出修改。
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50
权利要求
1.一种包含来自于至少四株流感病毒的抗原的疫苗，其特征在于，所述疫苗不含卵清蛋白。
2. —种包含来自于至少四株流感病毒的抗原的疫苗，其特征在于，其中至少一种毒株是用细胞培养物培养的。
3. 如权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于，其中包含佐剂。
4. 如上述任一权利要求所述的疫苗，其特征在于，其中的抗原既不是裂解病 毒体也不是完整病毒体。
5. 如上述任一权利要求所述的疫苗，其特征在于，其中四株流感病毒的血凝 素(HA)的含量基本相同。
6. 如上述任一权利要求所述的疫苗，其特征在于，其中四株流感病毒分别是 两株A型流感病毒和两株B型流感病毒。
7. 如权利要求6所述的疫苗，其特征在于，其中包含来自于以下毒株的抗原 (i)Hl A型流感毒株，如H1N1毒株；(ii)H3 A型流感毒株，如H3N2毒株； (iii)B/Victoria/2/87-样B型流感毒株；以及(iv)B/Yamagata/16/88-样B型流感毒株。
8. 如权利要求1到5中任一项所述的疫苗，其特征在于，其中四株病毒包括 三株A型流感病毒和一株B型流感病毒。
9. 如权利要求8所述的疫苗，其特征在于，其中包含来自于以下毒株的抗原 (i)Hl A型流感毒株，如H1N1毒株；(ii)带有与A/Moscow/I0/99交叉反应的血凝 素的H3 A型流感毒株；(iii)带有与A/Fujian/411/2002交叉反应的血凝素的H3 A 型流感毒株；以及(iv)来自于B/Victoria/2/87-样B型流感毒株或 B/Yamagata/16/88-样B型流感毒株的B型流感毒株。
10. 如权利要求8所述的疫苗，其特征在于，其中包含来自于以下毒株的抗 原(i)Hl A型流感毒株，如H1N1毒株；(ii)H3 A型流感毒株，如H3N2毒株；(iii)H5 A型流感毒株，如H5N1毒株；以及(iv)来自于B/Victoria/2/87-样B型流感毒株或 B/Yamagata/16/88-样B型流感毒株的B型流感毒株。
11. 如权利要求1到6中任一项所述的疫苗，其特征在于，其中包含来自于 至少5株流感病毒的抗原。
12. 如权利要求11所述的疫苗，其特征在于，其中包含来自于以下毒株的 抗原(i)Hl A型流感毒株，如H1N1毒株；(ii)带有与A/Moscow/10/99交叉反应 的血凝素的H3 A型流感毒株；(iii)带有与A/Fujian/411/2002交叉反应的血凝素的H3 A型流感毒株；(iv)来自于B/Victoria/2/87-样B型流感毒株的B型流感毒株； 以及(v)B/Yamagata/16/88-样B型流感毒株。
13. 如权利要求11所述的疫苗，其特征在于，其中包含来自于以下毒株的 抗原(i)Hl A型流感毒株，如H1N1毒株；(ii)带有与A/Moscow/10/99或 A/Fujian/411/2002交叉反应的血凝素的H3 A型流感毒株；(iii)H5 A型流感毒株；(iv) 来自于B/Victoria/2/87-样B型流感毒株的B型流感毒株；以及(v) B/Yamagata/16/88-样B型流感毒株。
14. 如权利要求1到6中任一项所述的疫苗，其特征在于，其中包含来自于 以下毒株的抗原(i)HlNl A型流感毒株；(ii)A/Moscow/10/99-样H3N2 A型流感 毒株；(iii)A/Fujian/411/2002样H3N2 A型流感毒株；(iv)H5 A型流感毒株，如H5N1 毒株；(v)来自于B/Victoria/2/87-样B型流感毒株的B型流感毒株；以及(vi) B/Yamagata/16/88-样B型流感毒株。
15. 如权利要求1到5中任一项所述的疫苗，其特征在于，其中包含来自于 以下毒株的抗原(i)HlNl A型流感毒株；(ii)A/Moscow/10/99-样H3N2 A型流感 毒株；(iii)A/Fujian/411/2002样H3N2 A型流感毒株；(iv)H5 A型流感毒株，如H5N1 毒株；以及(v)来自于B/Victoria/2/87-样B型流感毒株或B/Yamagata/16/88-样B型 流感毒株的B型流感毒株。
16. 如上述任一权利要求所述的疫苗，其特征在于，其中各A型流感毒株都 包含A/PR/8/34病毒的一个或多个RNA片段。
17. 如上述任一权利要求所述的疫苗，其特征在于，其中每一种血凝素与带 Sia(a2，6)Gal末端二糖的寡糖的结合都优先于与带Sia(a2，3)Gal末端二糖的寡糖的^士 A ^口 口 o
18. 如上述任一权利要求所述的疫苗，其特征在于，其中每一种血凝素都具 有鸡蛋中没有的糖形。
19. 如上述任一权利要求所述的疫苗，其特征在于，其中，毒株是在MDCK 细胞内培养的。
20. 如权利要求10所述的疫苗，其特征在于，其中(i)Hl、 H3和B毒株的 血凝素的剂量与这三种毒株血凝素平均剂量的差值都在该平均值的10%以内；以 及(ii)H5毒株血凝素的剂量低于Hl、 H3和B毒株血凝素平均剂量的75%。
21. —种包含来自于至少四株流感病毒的抗原并且包含佐剂的疫苗。
22. 如权利要求3到21中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂包含 水包油乳剂，所述水包油乳剂含有亚微米液滴。
23. 如权利要求22所述的疫苗，其特征在于，所述的油包含角鲨烯。
24. 如权利要求3到21中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂包含 (i)至少含一种Gpl基序的寡核苷酸和(ii)多聚阳离子寡肽的混合物。
25. 用于制备权利要求22所述疫苗的试剂盒，其特征在于，其中包含(i)装 在第一容器内的包含流感病毒抗原的第一组分，以及(ii)装在第二容器内的包含水包油乳剂的第二组分。
26. 如权利要求21所述的疫苗，其特征在于，其中至少一种毒株是用细胞 培养物培养的。
27. 如权利要求21或26所述的疫苗，其特征在于，所述抗原既不是裂解病 毒体也不是完整病毒体。
28. 如权利要求21或26或27所述的疫苗，其特征在于，其中四株流感病 毒的血凝素(HA)的含量基本相同。
29. —种包含来自于至少四株流感病毒的抗原的疫苗，其特征在于，所述抗 原既不是裂解病毒体也不是完整病毒体。
30. 如权利要求29所述的疫苗，其特征在于，所述抗原是活流感病毒或纯 化的糖蛋白。
31. 如权利要求29或30所述的疫苗，其特征在于，其中至少一种毒株是用 细胞培养物培养的。
32. 如权利要求29或30或31所述的疫苗，其特征在于，其中包含佐剂。
33. 如权利要求29到32中任一项所述的疫苗，其特征在于，其中四株流感 病毒的血凝素(HA)的含量基本相同。
34. —种在患者体内诱导免疫反应的方法，该方法包括用上述任一权利要求 所述的疫苗给患者接种的步骤。
35. —种试剂盒，该试剂盒包含(i)装有流感疫苗的第一容器，其中的流感疫 苗包含来自于H1N1 A型流感毒株、H3N2 A型流感毒株和第一 B型流感毒株的抗 原；以及(ii)装有流感疫苗的第二容器，其中的流感疫苗包含来自于第二B型流感 毒株的抗原，所述第一和第二 B型流感毒株之一是B/Victoria/2/87-样毒株，另一 株是B/Yamagata/16/88-样毒株。
36. 来自于四种不同流感毒株的抗原在制造用于在患者体内诱导免疫反应 的药物中的用途。
37. 如权利要求36所述的用途，其特征在于，所述抗原制备自用细胞培养 物扩增的病毒。
38. 如权利要求36或37所述的用途，其特征在于，其中的药物是如权利要 求1到33中任一项所述的疫苗。
39. —种免疫患者以防御流感病毒的方法，该方法包括联合给予患者(i)含流 感疫苗的第一疫苗，其中的流感疫苗包含来自于H1N1 A型流感毒株、H3N2A型 流感毒株和第一 B型流感毒株的抗原；以及(ii)包含来自于第二 B型流感毒株的抗 原的第二疫苗，所述第一和第二B型流感毒株之一是B/Victoria/2/87-样毒株，另一 株是B/Yamagata/16/88-样毒株。
全文摘要
本发明的疫苗包含至少四种流感毒株。在某些实施方式中，疫苗是在细胞培养物内而不是在鸡蛋内制备的。在某些实施方式中，疫苗包含佐剂。在某些实施方式中，疫苗不是裂解病毒体疫苗也不是完整病毒体疫苗，而是活病毒疫苗或纯化糖蛋白疫苗。在某些实施方式中，疫苗所包含的流感毒株的血凝素(HA)的含量基本相同。在某些实施方式中，四株病毒包括两种A型流感毒株和两种B型流感毒株(“A-A-B-B”)。在其他实施方式中，四株病毒包括三种A型流感毒株和一种B型流感毒株(“A-A-A-B”)。
文档编号A61P31/16GK101553252SQ200780045226
公开日2009年10月7日 申请日期2007年12月5日 优先权日2006年12月6日
发明者T·F·蔡 申请人:诺华有限公司