专利名称：重组流感病毒血凝素(ha)抗原蛋白和含其的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组流感病毒血凝素蛋白和包含重组血凝素蛋白的疫苗。
背景技术：
甲型流感病毒造成上个世纪流感大流行，并且是引起每年暴发的流感疫情的病原体。据世界卫生组织估计，流感疫情每年影响约5-15%的全球人口，每年造成3-500万重症病人和50万人死亡。世卫组织流感情况表211。世界卫生组织，日内瓦，瑞士(2003年)。甲型流感病毒是正粘病毒家族的成员，具有广泛的寄主范围，包括人，马，狗，鸟和猪。它是一种有包膜的，负链RNA病毒，由一组8个RNA片段(缩写为PB2，PBL, PA，HA, NP，NA，M和NS)组成，编码至少10个病毒蛋白。HA片段编码血凝素蛋白(HA)。NA片段编码神经氨酸酶(NA)。根据血清学分类，迄今已经确定16个HA亚型(标记为H1-HI6)和9个NA亚型(标记为N1-N9)。目前全球在人群中传播的甲型流感的亚型包括H1N1，H1N2，和H3N2病毒；H5N1和H9N2在鸟类如鸡中传播；H1N1和H3N2病毒在猪群中传播。目前流感灭活疫苗是三价的，含15微克来自两个甲型流感(H1N1和H3N2)亚型和一个B型流感毒株的HA。从他们在20世纪40年代引入临床应用，疫苗生产的基本技术和原则仍然是基本相同的。传统的智慧都集中在优化生产过程，以生产含有最大量HA蛋白的常规的病毒制备。另外，流感疫苗的标准化完全基于HA含量。随着同一亚型内的传播病毒和为疫苗选择的病毒之间的抗原关联变得更遥远，疫苗的功效下降。流感病毒经历两种类型的抗原变异，“抗原漂移(antigenic drift)”和“抗原移位(antigenic shift)”。抗原漂移是新的流感病毒株的持续发生的部分原因，通过在HA和NA基因的突变而与他们的祖先不同。变化的量可能是细微或显着的。抗原变异的第二类型是“抗原移位”。当两种不同的流感病毒共感染同一宿主，交换完整基因组片段时，遗传移位可能发生。这可能会导致“重组”病毒，具有一个全新的基因组成，因此具有新特性。在一个病毒亚型直接跨越物种屏障的而没有在中间宿主重组的情况下，遗传变异也可能发生。流感病毒的抗原变异成为每年的流感疫情的发生和不定期的流行病的主要基础，使疫苗成分需要不断的进化。对流感疫苗而言，世卫组织现在每年两次选择三种病毒株，用于包含在季节性流感疫苗。虽然选定的毒株通常与流行株的抗原性接近，但是在一些年，他们却不接近。此外，在近几年H5N1型禽流感病毒和猪HlNl病毒引起了流感大流行的担忧。因此，有需要拥有会产生广谱的保护免疫力的疫苗。
发明内容
本发明的一个方面提供了重组HA抗原蛋白。在一个实施例中，该重组HA抗原蛋白包括含主要抗原性表位的胞外域，和长螺旋(LH);其中所述长螺旋中存在至少一个选自CxxC (SEQ ID NO:3), CxxxC (SEQ ID NO:4)或 CxxxxC (SEQ ID NO:5)的 2-半胱氨酸微域，，其X代表任意氨基酸；由此，当该重组HA抗原蛋白形成三聚体，所述在LH中的两个半胱氨酸形成串联二硫键带，共价地使该三聚体收紧。
在另一个实施例中，所述重组HA抗原蛋白进一步包括近膜螺旋(MPH)，跨膜区(TMD);和胞质区(CPD)，其中所述LH，MPH，或TMD中存在至少一个选自CxxC (SEQ ID NO:3)，CxxxC (SEQ ID NO:4)或 CxxxxC (SEQ ID NO:5)2 的-半胱氨酸微域，，并且如果 CxxxC(SEQ ID N04)在TMD存在，其中CFLLC被排除，由此，当所述重组HA抗原蛋白形成三聚体，在LH，MPH，或TMD中的两个半胱氨酸形成串联二硫键带，共价地使该三聚体收紧。在另一个实施例中，重组HA抗原蛋白中的CPD或TMD来自一个HA蛋白，与提供胞外域和LH的HA蛋白是不一样的。在另一个实施例中，重组HA抗原蛋白的TMD或CPD是人工合成肽或来自在其自然构象时形成三聚体的非HA蛋白。在另一个实施例中，重组HA抗原蛋白是由DNA序列所编码的，该DNA序列被克隆到一个的体内表达载体；使重组HA表达载体被用作针对流感病毒感染的DNA疫苗。在另一个实施例中，重组HA抗原蛋白被用作针对流感病毒感染的疫苗。本发明的另一个方面提供了病毒样颗粒。在一个实施例中，所述病毒样颗粒包括重组HA抗原蛋白，其中所述重组HA抗原蛋白包括含有主要抗原表位的胞外域；长螺旋(LH);近膜螺旋(MPH)，跨膜区(TMD);和胞质区(0 0);其中所述1^，10^，或了1 中存在至少一个选自 CxxC (SEQ ID NO:3), CxxxC (SEQ ID NO:4)或 CxxxxC (SEQ ID N0:5)的 2-半胱氨酸微域，，其X代表任意氨基酸；并且如果CxxxCXSEQ ID N04)在TMD存在，其中CFLLC被排除；由此，当所述重组HA抗原蛋白形成三聚体，在LH，MPH，或TMD中的两个半胱氨酸形成串联二硫键带，共价地使该三聚体收紧。在病毒样颗粒的另一个实施例中，所述CPD或TMD来自一个HA蛋白，与提供胞外域和LH的HA蛋白是不一样的。
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在病毒样颗粒的另一个实施例中，所述TMD或CPD是人工合成肽或来自在其自然构象时形成三聚体的非HA蛋白。在病毒样颗粒的另一个实施例中，所述病毒样颗粒被用作针对流感病毒感染的疫苗。本发明的另一个方面提供了重组流感病毒，在一个实施例中，所述重组流感病毒包括重组HA抗原蛋白，其中所述重组HA抗原蛋白包括含有主要抗原表位的胞外域；长螺旋(LH);近膜螺旋(MPH)，跨膜区(TMD);和胞质区(CPD);其中所述LH，MPH，或TMD中存在至少一个选自 CxxC (SEQ ID NO:3), CxxxC (SEQ ID NO:4)或 CxxxxC (SEQ ID NO:5)的2-半胱氨酸微域，其X代表任意氨基酸；并且如果CxxxC (SEQ ID N04)在TMD存在，其中CFLLC被排除；由此，当所述重组HA抗原蛋白形成三聚体，在LH，MPH，或TMD中的两个半胱氨酸形成串联二硫键带，共价地使该三聚体收紧。在重组流感病毒的另一个实施例中，所述CPD或TMD来自一个HA蛋白，与提供胞外结构域和LH的HA蛋白是不一样的。在重组流感病毒的另一个实施例中，所述TMD或CPD是人工合成肽或来自在其自然构象时形成三聚体的非HA蛋白质。在另一个实施例中，所述重组流感病毒被用作针对流感病毒感染的疫苗。在进一步的实施例中，该疫苗是由减毒的重组流感病毒组成。在又一实施例中，该疫苗是由灭活病毒颗粒组成，来自所述重组流感病毒的病毒制备。
本发明的目标和优点从下面的详细描述的优选实施例与附图中变得显而易见。
根据本发明的优选实施例现在将参照附图加以描述，其中相同的参考标号表示相同的元件。图1是HA蛋白的一个功能域的域框图，其中标记的为有关功能域。
具体实施例方式可以通过引用以下的本发明的某些实施例的详细描述而更容易地理解本发明。在本申请中，为了更充分地描述本发明所涉及领域状态，当出版物被引用，这些出版物的公开内容的全部经引用而并入本申请。除非另有说明，在本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)，微生物学，细胞生物学，生物化学，核酸化学和免疫学的现有技术，这些是在本领域的技能之内。这些技术在文献中已有完全解释，如分子克隆:实验室说明书，第三版(Sambrook和Russel, 2001年)；动物细胞培养(RI Freshmey主编，1987年版);分子生物学当代程序(FM Ausubel等主编，1987年，包括补充至2001年)；免疫学当代程序(JE Coligan等主编，1991年);免疫分析手册“(D.Wild主编，斯托克顿出版社，纽约，1994年)；免疫学分析方法(R.MaSSeyefT，WH Albert 和 NA Staines 等主编，Weinheim:VCH VERLAGS GESELLSCHAFT MBH，1993 年)。流感病毒的表面有两种抗原，血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，其中HA被认为是主要抗原。HA具有16个亚型(H1-HI6)，它们的编码序列和氨基酸序列是多种多样的。在这里，一个示例性的HA (H3)，示于SEQ ID NO:1 (编码序列)和SEQ ID N02 (氨基酸序列)，其中示于SEQ ID N02 的氨基酸序列包含17个氨基酸的信号肽，因此，所有下面的描述所采用的编号系统中，氨基酸18被编号为I。HA最初翻译成一个单分子HAO，然后HO由蛋白酶裂解成HAl区(氨基酸1-328)和HA2 (329-549)，其中HAl和HA2由一个链间二硫键而共价相连。HAl包含了大部分的，如果不是全部的，抗原表位，HA2包含融合肽，长螺旋(LH)(氨基酸405-458)，近膜螺旋(MPH)(氨基酸 492-511)，跨膜区(TMD) (AA512-538)和胞质区(CPD) (AA539-549)。在 HA 分子上的功能域图如图1所示，其中只标注相关结构域包括HA1，LH, MPH, TMD, CPD的标记。虽然它们的DNA序列各不相同，但是其结构有着相似的域。HA具有三聚体结构，像纤突样突出在病毒表面。普遍认为，LH, MPHJP TMD负责HA三聚体结构的形成和稳定。另外，LH参与形成稳定三聚体的三重链盘绕的线圈；它可以解释为什么在被删除跨膜和胞质区后，HA保持其三聚体构象。应当注意的是，尽管裂解对病毒感染是关键的，但是HAl和HA2可以作为一个没有裂解的单一的多肽，被用作疫苗中的抗原或其他功能。以往的研究表明，从自然感染的患者或免疫小鼠得到的单克隆抗体，可以与不同亚型的流感病毒交叉反应；例如，从一个免疫了季节性流感疫苗的人得到的单克隆抗体能与HI，H5和H9交叉反应。大部分的交叉反应的单克隆抗体是针对HA的茎干区的，但在2011年，临时申请提交后，一个单克隆抗体显示结合到HA的受体结合区域。所有这些研究提示，三聚体HA确实包含一些抗原表位，被大部分甚至是所有A型流感病毒所共享；不幸的是，通过用目前季节性疫苗免疫或自然感染所产生的针对共享的抗原表位的交叉反应抗体太低，不能针对抗原变异株提供任何有意义的保护，更遑论大流行毒株。如果流感疫苗能够诱导足够的针对共享抗原表位的交叉反应抗体，它会提供针对亚型间的(inter-subtypic)或亚型内的(intra-subtypic)的变异株的交叉保护(通用疫苗)。然而，面临的挑战是我们如何可以操纵(即HA抗原)来实现这一目标。本发明假设，在免疫或感染的主体中的交叉反应抗体的缺乏可能是在目前的疫苗中或感染过程中，只有较少的共享抗原表位存在；更进一步地，在目前疫苗中存在较少共享抗原表位的原因是，自然HA结构，特别是Hl，H5和H9，没有提供足够的稳定性，来维持共享抗原表位。因此，如果HA结构的稳定性可以提高，合理的期望是共享抗原表位的存在的增加。然而，面临的挑战是如何稳定HA结构。在我们的日常生活中，一束平行的材料如竹子和干草被腰带收紧。现在的问题是HA是否包含任何并行结构束，进一步是如果此结构束是存在的，任何腰带是否可以引入到HA的并行结构束。对于第一个问题，本发明分析如上所述的HA结构。HA2包含至少三个螺旋(S卩，LH，MPH和TMD);多肽螺旋具有圆柱形的构象，因此，在LH，MPH和TMD的每一个螺旋在HA三聚体内形成三个平行螺旋的束；它提供了物理基础，用于引入一个或多个腰带，共价地连接所有三个HA单体。对于第二个问题，本发明记得，两个多肽之间可以形成由两个半胱氨酸形成的二硫键(S-S);例如，HAl和HA2通过二硫键共价连接，IgG是一个由多个肽间的二硫键连接的同型二聚体。然而，一个半胱氨酸出现在HA三聚体中三个单体的每一个单体的对应的位置上，将允许形成一个二硫键，但剩下一个自由的SH基团。更关键的是，没有环形腰带围绕三个HA单体形成。为了形成一个环形腰带，本发明探讨它是否可行的去引入一对半胱氨酸到每一单体，因此在三个单体之间形成串联的三个二硫键。如已知的，在一个螺旋中的每匝包含3.6个氨基酸，其中的间距(每匝前进)是0.54nm，而上升(每个氨基酸残基前进)是0.15nm。对于一个由两个半胱氨酸形成的二硫键，中心之间的距离是0.849nm(2 个 c-c 键(每键 0.154nm)，l 个 c-s 键(每键 0.17nm)，和一个 s_s 键(0.201nm))。0.849nm的距离大约是1.57倍间距或5.66个氨基酸；这意味着，如果两个半胱氨酸没有由4个以上的氨基酸隔开，二硫键可以在两个螺旋之间形成。本发明发现，引入至少一对半胱氨酸到HA的LH，MPH和/或TMD能增加交叉反应的免疫应答；做出的引入是基于这样的假定，半胱氨酸对可能围绕三聚体的HA 结构形成二硫键带，更紧地抓住HA三聚体。尽管由于缺乏手段，稳定性的改变并没有被实际测量，但是增加交叉反应免疫应答的最终结果证明了这个假定的正确性。本发明提供了引入至少一对半胱氨酸到HA的螺旋区域(LH，MPH和TMD)，形成三个 2-半胱氨酸微域之一((CxxC (SEQ ID NO:3) ;CxxxC (SEQ ID NO:4) ;CxxxxC (SEQID NO:5)，使在三个单体之间形成一个串联二硫键带，其中在微域的’X’是任何氨基酸，只要他们不打破螺旋结构，优选地在人工创造的微域中是A，L，M，F，E，Q，H，K和R。说明性地，三种单体之间的三个二硫键(单体I有ICl和1C2，单体2有2C1和2C2，单体3有3C1和3C2)是1C1-2C2，2C1-3C2，和3C1-1C2。此串联二硫键带紧紧地把三个单体抓在一起，形成一个高度稳定的三聚体。此发现是具有重要的意义，因为任何由HA代表的三聚体蛋白质可被改变，以包括至少一个2-半胱氨酸微域，因此三聚体结构通过共价键带被稳定。当此类HA以重组蛋白，VLP或病毒的形式作为抗原被用于疫苗，该疫苗将诱导增强的亚型内的(intra-subtypic)或亚型间的(inter-subtypic)免疫应答。这是令人惊讶地注意至IJ，在NCBI的蛋白数据库中搜索任何2-半胱氨酸微域的存在发现一个2-半胱氨酸微域(CFLLC)，属于 CxxxC (SEQ ID NO:4)，出现在 H3HA 的 TMD。H1-H5 和 H7-H16 不包含任何2-半胱氨酸微域。保守的H1-HI6的TMD的氨基酸序列由SEQ ID N06-21分别代表，并总结在表I中，其中半胱氨酸被突出显示。表I。H1-H16的TM和CP域的示例性序列
权利要求
1.重组血凝素(HA)抗原蛋白，其特征在于:包括: 含有主要抗原表位的胞外域；和 长螺旋(LH);其中在所述LH中存在至少一个选自CxxC (SEQ ID NO:3), CxxxC (SEQID NO:4)或CxxxxC (SEQ ID NO:5)的2-半胱氨酸微域，其中x表示任意氨基酸； 从而当所述重组HA抗原蛋白形成三聚体，在LH中两个半胱氨酸形成一个串联二硫键带，共价键地收紧三聚体。
2.如权利要求1所述重组血凝素(HA)抗原蛋白，其特征在于:进一步包括:近膜螺旋(MPH);跨膜区(TMD);和胞质区(CPD);所述LH，MPH或TMD中存在至少一个选自CxxC(SEQ ID NO:3), CxxxC (SEQ ID NO:4)或 CxxxxC (SEQ ID NO:5)的 2-半胱氨酸微域，并且其中如果CxxxC (SEQ ID NO:4)是呈现在TMD中，CFLLC被排除；从而当重组HA抗原蛋白形成三聚体，在LH，MPH或TMD中的两个半胱氨酸形成一个串联二硫键带，共价键地收紧三聚体。
3.根据权利要求2所述重组血凝素(HA)抗原蛋白，其特征在于:其中所述TMD或CPD是来自和提供胞外域和LH的HA蛋白不一样的HA蛋白。
4.根据权利要求2所述重组血凝素(HA)抗原蛋白，其特征在于:其中所述TMD或CPD是人工合成的肽或来自在其自然构象时形成三聚体的非HA蛋白质。
5.根据权利要求1所述重组血凝素(HA)抗原蛋白，其特征在于:其中所述重组HA抗原蛋白是被DNA序列所编码的，该DNA序列被克隆到一个体内表达载体；因此重组HA表达载体被用作针对流感病毒感染的DNA疫苗。
6.根据权利要求2所述重组血凝素(HA)抗原蛋白，其特征在于:其中所述重组HA抗原蛋白是被DNA序列所编码的，该DNA序列被克隆到一个体内表达载体；因此重组HA表达载体被用作针对流感病毒感染的DNA疫苗。
7.根据权利要求1所述重组血凝素(HA)抗原蛋白，其特征在于:其中所述重组HA抗原蛋白被用于针对流感病毒感染的疫苗。
8.根据权利要求2所述重组血凝集(HA)抗原蛋白，其特征在于:其中所述重组HA抗原蛋白被用于针对流感病毒感染的疫苗。
9.病毒样颗粒，其特征在于:其包括: 重组血凝素(HA)抗原蛋白，其中所述重组HA抗原蛋白包括: 含有主要抗原表位的胞外域；长螺旋(LH); 近膜螺旋(MPH); 跨膜区(TMD);和 胞质区(CPD); 其中在所述LH，MPH或TMD中存在至少一个选自CxxC (SEQ ID NO:3), CxxxC (SEQ IDNO:4)或CxxxxC (SEQ ID NO:5)的2-半胱氨酸微域，其中x表示任意氨基酸；并且其中如果CxxxC (SEQ ID NO:4)是呈现在TMD中，CFLLC被排除; 从而当所述重组HA抗原蛋白形成三聚体，在LH，MPH或TMD中的两个半胱氨酸形成一个串联二硫键带，共价键地收紧三聚体。
10.根据权利要求9所述病毒样颗粒，其特征在于:其中所述TMD或CPD来自和提供胞外域和LH的HA蛋白不一样的HA蛋白。
11.根据权利要求9所述病毒样颗粒，其特征在于:其中所述TMD或(PD是人工合成的肽或来自在其自然构象时形成三聚体的非HA蛋白质。
12.根据权利要求9所述病毒样颗粒，其特征在于:其中所述病毒样颗粒用于针对流感病毒感染的疫苗。
13.重组流感病毒，其特征在于:包括: 重组血凝素(HA)抗原蛋白，其中所述重组HA抗原蛋白包括: 含有主要的抗原表位的胞外域；长螺旋(LH); 近膜螺旋(MPH); 跨膜区(TMD);和 胞质区(CPD); 其中在所述LH，MPH或TMD中存在至少一个选自CxxC (SEQ ID NO:3), CxxxC (SEQ IDNO:4)或CxxxxC (SEQ ID NO:5)的2-半胱氨酸微域，其中x表示任意氨基酸；并且其中如果CxxxC (SEQ ID NO:4)是要呈现在TMD中，CFLLC被排除; 从而当所述重组HA抗原蛋白形成三聚体，在LH，MPH或TMD中的两个半胱氨酸形成一个串联二硫键带，共价键地收紧三聚体。
14.根据权利要求13所述重组流感病毒，其特征在于:其中所述TMD或CPD是人工合成的肽或来自在其自然构象时形成三聚体的非HA蛋白质。
15.根据权利要 求13所述重组流感病毒，其特征在于:其中所述TMD或CPD是人工合成的肽或来自在其自然构象时形成三聚体的非HA蛋白质。
16.根据权利要求13所述重组流感病毒，其特征在于:其中所述重组流感病毒用于针对流感病毒感染的疫苗。
17.根据权利要求16所述重组流感病毒，其特征在于:其中所述疫苗减毒重组流感病毒。
18.根据权利要求16所述重组流感病毒，其特征在于:其中所述疫苗包括来自所述重组流感病毒的病毒制备的灭活病毒颗粒。
全文摘要
本发明提供了重组的血凝素抗原蛋白，病毒样颗粒和重组流感病毒。本发明进一步提供了一种疫苗，它含有重组血凝素抗原蛋白质，病毒样颗粒或重组流感病毒。
文档编号A61P31/16GK103209990SQ201180052182
公开日2013年7月17日 申请日期2011年10月27日 优先权日2010年10月30日
发明者刘大才 申请人:刘大才