基于流感血凝素蛋白的新颖疫苗的制作方法
【专利摘要】提供了引发广泛中和性抗流感抗体的新颖疫苗。一些疫苗包含在其表面上展示来自流感病毒的血凝素三聚体的纳米颗粒。纳米颗粒包含融合蛋白，该融合蛋白包含至少与流感血凝素蛋白的一部分连接的铁蛋白的单体亚基。一些部分包含胞外结构域，而一些部分限于茎区。融合蛋白自身装配以形成血凝素展示性纳米颗粒。一些疫苗仅包含与三聚化域连接的流感血凝素蛋白的茎区。此类疫苗可以用于针对感染对个体接种疫苗，所述感染由异源流感病毒和与获得纳米颗粒血凝素蛋白的病毒在抗原性上趋异的流感病毒引起。还提供了融合蛋白和编码此类蛋白质的核酸分子。
【专利说明】基于流感血凝素蛋白的新颖疫苗
[0001]发明概述
[0002]本发明提供了基于血凝素蛋白的新颖流感疫苗，其是容易制造的，有力的，且引发广泛中和性流感抗体。具体地，本发明提供了可用于诱导中和性抗体生成的流感血凝素蛋白及其部分。它还提供了新颖的HA-铁蛋白纳米颗粒(np)疫苗。此类纳米颗粒包含融合蛋白，每种所述融合蛋白包含与流感血凝素蛋白的免疫原性部分连接的铁蛋白的单体亚基。由于此类纳米颗粒在其表面上展示流感血凝素蛋白，它们可以用于针对流感病毒对个体接种疫苗。
[0003]在一个实施方案中，本发明是包含融合蛋白的纳米颗粒，并且在此实施方案中，融合蛋白包含与第一流感血凝素(HA)蛋白连接的至少25个来自单体铁蛋白亚基蛋白的连续氨基酸，使得所述纳米颗粒在其表面上包含流感病毒HA蛋白三聚体。纳米颗粒可以形成八面体，所述八面体可以由24个具有432对称的亚基组成。此外，单体铁蛋白亚基蛋白可以选自细菌铁蛋白、植物铁蛋 白、藻铁蛋白、昆虫铁蛋白、真菌铁蛋白和哺乳动物铁蛋白，并且在一个优选的实施方案中，是幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)铁蛋白蛋白质。
[0004]在此实施方案中，单体铁蛋白亚基蛋白可以包含选自下组的氨基酸序列的至少25个连续氨基酸:SEQ ID N0:2和SEQ ID NO:5或者可以包含与那些序列至少约80%相同，至少约85 %相同，至少约90 %相同，至少约95 %相同，至少约97 %相同，至少约99 %相同的氨基酸或者可以包含那些序列。在另一个实施方案中，单体亚基包含与SEQ ID N0:2的氨基酸5-167对应的区域。
[0005]在此实施方案中，所述血凝素蛋白可以包含来自选自下组的流感病毒的血凝素蛋白的至少25个连续氨基酸:甲型/新喀里多尼亚/20/1999(1999NC，Hl)、甲型 / 加利福尼 /04/2009 (2009CA, Hl)、甲型 / 新加坡 1/1957 (1957Sing, H2)、甲型 / 香港 /1/1968 (1968HK, H3)、甲型 / 布里斯班 /10/2007 (2007Bris, H3)、甲型 / 印度尼西亚 /05/2005 (2005Indo, H5)、乙型 / 佛罗里达 /4/2006 (2006Flo, B)、甲型 / 珀斯/16/2009 (2009Per, H3)、甲型 / 布里斯班 /59/2007 (2007Bris, HI)、乙型 / 布里斯班/60/2008 (2008Bris，B)。此外，血凝素蛋白可以包含氨基酸序列，该氨基酸序列选自SEQ IDNO:8，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:23，SEQ IDNO: 26，SEQ ID NO: 29，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO: 35和 SEQ ID NO: 38 的氨基酸序列或与其至少80%相同，至少约85%相同，至少约90%相同，至少约95%相同，至少约97%相同，至少约99%相同的氨基酸序列。或者，血凝素蛋白可以包含氨基酸序列，该氨基酸序列选自SEQID NO:71，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:83，SEQ ID NO:86，SEQID NO: 89，SEQ ID NO: 92，SEQ ID NO: 95 和 SEQ ID NO: 98 的氨基酸序列或与其至少 80%相同，至少约85%相同，至少约90%相同，至少约95%相同，至少约97%相同，至少约99%相同的氨基酸序列。
[0006]在此实施方案中，血凝素蛋白能够引发对包含选自下组的氨基酸序列的蛋白质的免疫应答:SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 14，SEQ ID NO: 17，SEQ ID NO:20, SEQID NO:23，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:38，或者它可以包含选自下组的区域:能够容许血凝素三聚体形成的区域、茎区、胞外结构域、和包含从刚好在第二螺旋卷曲螺旋的最后一个氨基酸的远端的氨基酸残基至跨膜域的第一个氨基酸的近端的氨基酸残基的氨基酸序列的区域。
[0007]血凝素蛋白还可以包含血凝素刺突域、与SEQ ID N0:8的氨基酸1-519对应的区域或者选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:8的氨基酸1-519和SEQ ID NOill0
[0008]在此实施方案中，融合蛋白可以包含接头序列。
[0009]在此实施方案中，纳米颗粒可以引发针对下列各项的免疫应答:流感血凝素的茎区、流感血凝素的刺突、与获得血凝素蛋白的流感病毒株异源的流感病毒株或与获得血凝素蛋白的流感病毒在抗原性上趋异的流感病毒。
[0010]在此实施方案中，融合蛋白可以包含与选自下组的序列至少80 %相同，至少约85 %相同，至少约90 %相同，至少约95 %相同，至少约97 %相同，至少约99 %相同的氨基酸序列:SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:53, SEQID NO:56, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:62, SEQ ID N0:65 和 SEQ ID NO:68，其中纳米颗粒引发针对流感病毒的免疫应答或者可以包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:41, SEQ IDNO:44，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:59，SEQ IDNO:62, SEQ ID N0:65和SEQ ID N0:68。融合蛋白还可以包含与选自下组的序列至少80%相同，至少约85%相同，至少约90%相同，至少约95%相同，至少约97%相同，至少约99%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO: 101, SEQ ID N0:104SEQ ID N0:107SEQ ID NO: 110SEQ IDN0:113SEQ ID N0:116SEQ ID N0:119SEQ ID N0:122SEQ ID NO:125 和 SEQ ID NO:128，其中纳米颗粒引发针对流感病毒的免疫应答。 [0011 ] 在此实施方案中，所述纳米颗粒可以包含第二融合蛋白，该第二融合蛋白包含第二流感血凝素蛋白，其中所述第一和第二流感血凝素蛋白来自不同类型、不同亚型或不同毒株的流感病毒。
[0012]本发明的另一个实施方案是包含任何上述纳米颗粒的疫苗组合物。疫苗组合物可以进一步包含至少一种别的纳米颗粒，所述别的纳米颗粒包含至少一种血凝素蛋白，该血凝素蛋白与所述第一血凝素蛋白和所述第二血凝素蛋白来自不同流感毒株。
[0013]本发明的又一个实施方案是生成针对流感病毒的疫苗的方法。该方法包括在一定的条件下表达融合蛋白，使得所述融合蛋白形成在其表面上展示血凝素三聚体的纳米颗粒，所述融合蛋白包含与流感血凝素蛋白连接的单体铁蛋白蛋白质，并回收所述纳米颗粒。
[0014]本发明还包括针对流感对个体接种疫苗的方法，该方法包括对个体施用纳米颗粒，使得所述纳米颗粒引发针对流感病毒的免疫应答。在此实施方案中，所述纳米颗粒包含与流感血凝素蛋白连接的铁蛋白单体亚基，且所述纳米颗粒在其表面上展示流感血凝素三聚体。在此实施方案中，所述纳米颗粒可以引发针对流感病毒株的免疫应答，所述流感病毒株对于获得所述血凝素蛋白的流感病毒的亚型或毒株而言是异源的或者与获得所述血凝素蛋白的流感病毒在抗原性上是趋异的。
[0015]此方法可以进一步包括对个体施用第一疫苗组合物，然后在后来的时间，施用包含纳米颗粒的第二疫苗组合物，所述纳米颗粒包含HA-SS-铁蛋白融合蛋白。HA SS-铁蛋白融合蛋白可以包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO:74, SEQ IDNO:77，SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:83，SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:89，SEQ ID NO:92，SEQ IDN0:95和SEQ ID N0:98或者与其至少80%相同，至少85%相同，至少90%相同，至少95%相同，至少97%相同或至少99%相同的氨基酸序列，其中HA SS-铁蛋白融合蛋白引发针对流感病毒的免疫应答。HA SS-铁蛋白融合蛋白可以包含选自下组的氨基酸序列:SEQ IDNO:101, SEQ ID N0:104SEQ ID N0:107SEQ ID NO:110SEQ ID NO:113SEQ ID NO:116SEQ IDNO:119SEQ ID NO:122SEQ ID NO: 125 和 SEQ ID NO: 128，或与其至少 80%相同，至少 85%相同，至少90%相同，至少95%相同，至少97%相同或至少99%相同的氨基酸序列，其中所述HA SS-铁蛋白融合蛋白弓丨发针对流感病毒的免疫应答。
[0016]在此方法中，第一疫苗组合物可以包含纳米颗粒，其包含来自选自下组的流感病毒的血凝素蛋白的胞外结构域:甲型/新喀里多尼亚/20/1999 (1999NC, Hl)、甲型 / 加利福尼 /04/2009 (2009CA, Hl)、甲型 / 新加坡 1/1957 (1957Sing, H2)、甲型 / 香港 /1/1968 (1968HK, H3)、甲型 / 布里斯班 /10/2007 (2007Bris, H3)、甲型 / 印度尼西亚 /05/2005 (2005Indo, H5)、乙型 / 佛罗里达 /4/2006 (2006Flo, B)、甲型 / 珀斯/16/2009 (2009Per, H3)、甲型 / 布里斯班 /59/2007 (2007Bris, HI)、乙型 / 布里斯班/60/2008 (2008Bris，B)。或者，第一疫苗组合物蛋白质的血凝素可以包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 14，SEQ ID NO: 17，SEQ ID NO:20, SEQ IDNO:23，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:35 和 SEQ ID NO:38 或者与其至少80%相同，至少85%相同，至少90%相同，至少95%相同，至少97%相同或至少99 %相同的氨基酸序列。此外，第一疫苗组合物可以包含HA-铁蛋白融合蛋白，其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:50, SEQ IDNO:53，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:62，SEQ ID NO:65 和 SEQ ID NO:68 或者与其至少80%相同，至少85%相同，至少90%相同，至少95%相同，至少97%相同或至少99 %相同的氨基酸序列，其中纳米颗粒引发针对流感病毒的免疫应答。
[0017]加强性组合物 的施用一般为施用引发性组合物后几周或几个月。
[0018]本发明的又一个实施方案是融合蛋白，其包含与流感血凝素蛋白连接的单体铁蛋白亚基蛋白。单体铁蛋白亚基蛋白可以选自细菌铁蛋白、植物铁蛋白、藻铁蛋白、昆虫铁蛋白、真菌铁蛋白和哺乳动物铁蛋白或者可以是幽门螺杆菌铁蛋白蛋白质的单体亚基。单体铁蛋白亚基蛋白可以包含容许融合蛋白自身装配成纳米颗粒的域。在此实施方案中，单体铁蛋白亚基蛋白可以包含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 5或包含至少25个来自选自SEQ IDNO:2和SEQ I NO:5的序列的连续氨基酸或者与选自SEQ ID NO:2和SEQ I NO:5的序列至少约80%相同，至少约85%相同，至少约90%相同，至少约95%相同，至少约97%相同，至少约99%，并且融合蛋白能够自身装配成纳米颗粒。另外，单体亚基可以包含与SEQ IDNO:2的氨基酸5-167对应的区域。
[0019]在此实施方案中，血凝素蛋白可以包含至少25个来自选自下组的流感病毒的氨基酸:甲型/新喀里多尼亚/20/1999 (1999NC, Hl)、甲型/加利福尼/04/2009 (2009CA, Hl)、甲型 / 新加坡 1/1957 (1957Sing, H2)，甲型 / 香港 /1/1968 (1968HK, H3)、甲型 / 布里斯班 /10/2007 (2007Bris, H3)、甲型 / 印度尼西亚 /05/2005 (2005Indo, H5)、乙型 / 佛罗里达 /4/2006 (2006Flo, B)、甲型 / 珀斯 /16/2009 (2009Per, H3)、甲型 / 布里斯班/59/2007 (2007Bris, HI)、和乙型 / 布里斯班 /60/2008 (2008Bris, B)。或者，血凝素蛋白能够引发针对包含选自下组的氨基酸序列的蛋白质的免疫应答:SEQ ID NO:8, SEQ IDNO:11，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:26, SEQ IDNO:29, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:35 和 SEQ ID NO: 38 或与其至少约 80%相同，至少约 85%相同，至少约90%相同，至少约95%相同，至少约97%相同或至少约99%相同的氨基酸序列。
[0020]在此实施方案中，融合蛋白可以包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID N0:41, SEQID NO:44，SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:59, SEQID NO:62, SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:68或与其至少约80%相同，至少约85%相同，至少约90%相同，至少约95%相同，至少约97%相同或至少约99%相同的氨基酸序列。
[0021]此外，在此实施方案中，血凝素蛋白可以包含选自下组的区域:能够容许所述血凝素蛋白三聚化的区域、茎区、胞外结构域、和包含从刚好在第二螺旋卷曲螺旋的最后一个氨基酸的远端的氨基酸残基至跨膜域的第一个氨基酸的近端的氨基酸残基的氨基酸序列的区域。或者，血凝素蛋白可以包含与SEQ ID N0:8的氨基酸1-519对应的区域，选自下组的氨基酸序列:SEQ ID N0:8的氨基酸1-519和SEQ ID N0:11,或血凝素刺突域。此外，血凝素蛋白可以包含来自选自下组的流感病毒的茎区:甲型 / 新喀里多尼亚 /20/1999 (1999NC, Hl)、甲型 / 加利福尼 /04/2009 (2009CA, Hl)、甲型 / 新加坡 1/1957 (1957Sing, H2)、甲型 / 香港 /1/1968 (1968HK, H3)、甲型 / 布里斯班 /10/2007 (2007Bris，H3)、甲型 / 印度尼西亚 /05/2005 (2005Indo, H5)、乙型 / 佛罗里达 /4/2006 (2006Flo, B)、甲型 / 珀斯 /16/2009 (2009Per, H3)、甲型 / 布里斯班/59/2007 (2007Bris, Hl)、或乙型/布里斯班/60/2008 (2008Bris, B)。血凝素蛋白还可以包含与 SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:83, SEQ IDNO:86，SEQ ID NO:89，SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:95 和 SEQ ID NO:98 至少约 80%相同，至少约85%相同，至少约90%相同，至少约95%相同，至少约97%相同或至少约99%相同的氨基酸序列。
[0022]在此实施方案中，融合蛋白可以包含一个或多个接头序列或选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:101，SEQ ID N0:104SEQ ID N0:107SEQ ID NO:110SEQ ID N0:113SEQ IDN0:116SEQ ID N0:119SEQ ID N0:122SEQ ID NO: 125 和 SEQ ID NO: 128 或与其至少约 80%相同，至少约85 %相同，至少约90 %相同，至少约95 %相同，至少约97 %相同或至少约99 %相同的序列。
[0023]本发明的又一个实施方案是编码上文描述的任何融合蛋白的核酸分子。在此实施方案中，核酸分子可以与启动子在功能上连接。本发明的其它实施方案包括重组细胞和病毒，其包含此类核酸分子。
[0024]本发明的另一个实施方案是包含与选自下组的氨基酸至少80%相同，至少约85 %相同，至少约90 %相同，至少约95 %相同，至少约97 %相同或至少约99 %相同的氨基酸序列的蛋白质:SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:80, SEQ IDNO:83，SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:89，SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:95 和 SEQ ID NO:98，其中蛋白质与一个或多个三聚化域连接。在此实施方案中，蛋白质可以至少与流感血凝素蛋白的头区的一部分连接，包含一个或多个接头区或者引发针对流感病毒的免疫应答。又一个实施方案是编码此类蛋白质的核酸分子。
[0025]发明背景[0026]通过针对流感病毒的疫苗接种诱导的保护性免疫应答主要针对病毒血凝素(HA)蛋白，其是病毒表面上负责病毒与宿主细胞受体相互作用的糖蛋白。病毒表面上的HA蛋白是血凝素蛋白单体的三聚体，其被酶促切割以生成氨基端HAl和羧基端HA2多肽。球状头部仅由HAl多肽的主要部分组成，而将血凝素蛋锚定于病毒脂质包膜中的茎由HA2和HAl的一部分构成。血凝素蛋白的球状头部包含两个域:受体结合域(RBD)(—个包含唾液酸结合位点的约148个氨基酸残基的域)和退化(vestigial)酯酶域(一种刚好在RBD下的约75个氨基酸残基的较小区域)。RBD中与2，6-唾液酸识别位点相邻的顶部包含每个三聚体超过6000 A2的较大区域(氨基酸131-143，170-182，205-215和257-262，1918编号)(本文中称为RBD-A区)，其在甲型/南卡罗来纳/1/1918 (1918SC)和甲型/加利福尼/04/2009 (2009CA)流行病毒株之间是95%保守的。球状头部包含几个抗原性位点，其包括免疫优势表位。例子包括Sa，Sb，Ca1, Ca2和Cb抗原性位点(参见例如Caton AJ等，1982，Cell31, 417-427)。RBD-A区包括Sa抗原性位点和Sb抗原性位点的一部分。
[0027]针对流感的抗体经常靶向HA球状头部中的可变抗原性位点，其围绕保守的唾液酸结合位点，并且因此仅中和抗原上紧密相关的病毒。HA头部的可变性是由于流感病毒的恒定抗原性漂移所致，并且造成流感的季节性地方病。比较而言，病毒基因组的基因区段可以在宿主物种中经历再分类(抗原性转变)，产生能够变得流行性的具有改变的抗原性的新病毒[Salomon, R.等Celll36，402-410 (2009)]。迄今，每年，将流感疫苗更新以反映对即将到来传播病毒预测的HA和神经氨酸酶(NA)。
[0028]目前用于流感的疫苗策略使用化学灭活的或活的减毒的流感病毒。这两种疫苗一般在胚胎蛋中生成，这由于费时的过程和有限的生产能力而呈现主要的制造局限。目前疫苗的另一项更为重要的局限是其高度毒株特异性功效。这些挑战在2009H1N1大流行的出现期间变得尤其明显，因此确认能够克服这些局限的新疫苗平台的必要性。病毒样颗粒代表一种此类备选的方法，并且目前在临床试验中评估[Roldao, A.等Expert RevVaccines9, 1149-1176(2010) ；Sheridan, C.Nat Biotechnol27, 489-491 (2009)]。代替胚胎蛋，经常包含HA、NA和基质蛋白I(Ml)的VLP可以在哺乳动物或昆虫细胞表达系统中大规模生产[Haynes, J.R.Expert Rev Vaccines8, 435-445 (2009)]。此办法的优点是其颗粒的、多价的性质和如实模拟感染性病毒体的正确折叠的三聚体HA刺突的真实展示。比较而言，通过其装配的性质，有包膜的VLP含有较小的但有限的宿主细胞组分，其可以在重复使用此平台后呈现潜在安全性、免疫原性考验[Wu，C.Y.等PLoS 0ne5，e9784(2010)]。此外，由VLP诱导的免疫与目前的疫苗诱导的免疫基本上相同，因此不可能改善疫苗诱导的保护性免疫的效力和宽度两者。在VLP外，重组HA蛋白也已经在人体中进行过评估[Treanor，J.J.等 Vaccinel9, 1732-1737 (2001) ；Treanor, J.J.JAMA297, 1577-1582 (2007)]，尽管诱导保护性中和性抗体效价的能力是有限的。那些试验中使用的重组HA蛋白在昆虫细胞中生成，并且不能优先形成天然三聚体[Stevens, J.Science303, 1866-1870 (2004)]。
[0029]最近，完全新类别的针对流感病毒的广泛中和性抗体得到分离。一类抗体识别高度保守的 HA 茎[Corti，D.等 J Clin Investl20, 1663-1673(2010)；Ekiert,D.C.等 Science324,246-251(2009) ；Kashyap,A.K.等 Proc Natl Acad SciUSA105, 5986-5991 (2008) ；0kuno, Y.等 J Virol67, 2552-2558 (1993) ；Sui, J.等 NatStruct Mol Bioll6 ,265-273 (2009) ；Ekiert, D.C.等 Science333,843-850 (2011);Corti1D.等.Science333，850-856 (2011)]，且另一类抗体精确识别可变HA头部上的RBD的唾液酸结合位点[Whittle, J.R.等 Proc Natl Acad Sci USA108, 14216-14221 (2011)；Krause, J.C.等J Virol85, 10905-10908 (2011) ] ?与毒株特异性抗体不一样，那些抗体能够中和多种抗原上独特的病毒，并且因此诱导此类抗体已经成为下一代通用疫苗的焦点[Nabel,G.J.等Nat Medl6，1389-1391 (2010)]。然而，通过疫苗接种强力引发具有此类异源中和性概况的这些抗体是困难的[Steel, J.等MBiol，e0018(2010) ；ffang, Τ.Τ.等PLoSPathog6, e1000796(2010) ；ffei, C.J.等 Science329, 1060-1064(2010)]。
[0030]尽管常规流感疫苗有几种备选，过去几十年的生物技术进展已经容许工程化改造生物学材料以用于新一代疫苗平台。铁蛋白(一种存在于几乎所有活生物体中的铁贮存蛋白)是一个例子，其已经广泛研究和工程化改造，用于许多潜在的生物化学 / 生物医学目的[Iwahori, K.美国专利 2009/0233377 (2009) ；Meldrum, F.C.等Science257, 522-523(1992) ；Naitou, Μ.等美国专利 2011/0038025 (2011) ；Yamashita, 1.Biochim Biophys Actal800, 846-857 (2010)]，包括用于展示外源表位肽的潜在疫苗平台[Carter, D.C.等美国专利 2006/0251679(2006) ；Li, C.Q.等 IndustrialBiotechnol2, 143-147 (2006)]。其作为疫苗平台的用途由于其自身装配和比单价形式诱导更强的B细胞应答及诱导不依赖于T细胞的抗体应答的抗原多价呈现而是特别令人感兴趣的[Bachmann, M.F.等 Annu Rev Immunol15，235-270(1997) ；Dintzis, H.Μ.等 Proc NatlAcad Sci USA73，3671-3675 (1976)]。此外，铁蛋白(其由24个装配成具有432对称的八面体笼的亚基组成)的分子构造具有在其表面上展示单体抗原的潜力。[0031]仍然需要有效的流感疫苗，其提供针对流感病毒的强力保护。特别地，仍然需要保护个体免于异源流感病毒毒株(包括进化中的季节性和流行性的未来流感病毒株)的流感疫苗。本发明通过提供新颖HA-铁蛋白纳米颗粒(HA-铁蛋白np)流感疫苗来满足此需要，所述新颖HA-铁蛋白纳米颗粒(HA-铁蛋白np)流感疫苗是容易制造的，有力的，并且引发广泛中和性流感抗体。
[0032]附图简述
[0033]图1:展示流感病毒血凝素的铁蛋白颗粒的分子设计和构建。(a)幽门螺杆菌非血红素铁蛋白(PDB:3bve)亚基的带状图(左侧)。氣基端和竣基端分别标记为N和C。在八面体三次轴周围的三个铁蛋白亚基以带状图显示(中间)。标示残基Asp5。铁蛋白颗粒(沿着八面体三次轴以8A分辨率观察)和甲型/所罗门群岛(Solomon Islands)/3/2006 (HlNl)
HA三聚体(PDB:3sm5)(从膜近端侧向下观察)(右侧)的八面体装配体。在八面体三次轴周围的每个铁蛋白亚基中的Asp5残基之间测量的平均距离以三角形显示。对HA三聚体也
画出相同的等边三角形(a = b = c =28 A )(右侧)。(b)用于蛋白质生成的HA-铁蛋白
表达载体的图示。(c)铁蛋白纳米颗粒(np)和HA-np的大小排阻层析的层析谱(左侧)。在曲线上方用垂直线标示校正标准品的分子量(kDa)。对铁蛋白纳米颗粒和HA-np计算的分子量分别是419和2，165kDa，并且在预测的分子量(分别为408和2，040kDa)的10%内。通过动态光散射测定纯化的铁蛋白纳米颗粒和HA-np的颗粒大小分布(半径)(中间)。标示测量的均值直径(d)。纯化的铁蛋白np和HA-np的多分散性指数分别是0.035和0.011。通过SDS-PAGE分析纯化的HA三聚体(凝血酶未切割)>HA-np和铁蛋白纳米颗粒(右侧)。(d)铁蛋白纳米颗粒(左侧)和HA-np(右侧)的负染色透射电子显微术图像。最初，以67，OOOx放大率记录图像。(e)显示了代表HA-铁蛋白np (顶部小图)和实际TEM图像(底部小图)的八面体四次、三次和两次对称的模型。在图像中对可见的HA刺突计数。
[0034]图2:铁蛋白的遗传和结构比较。(a)存在于RSCB PDB中的铁蛋白的系统树分析。22种序列含有16铁蛋白，包括Vc(霍乱弧菌(Vibrio cholerae))、Ec (大肠杆菌(E.coli))、Hp(幽门螺杆菌)、Af (闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus))、Pf (激烈火球菌(Pyrococcus furiosus))、Tm(海栖热袍菌(Thermatoga maritime) )、Pm(多列拟菱形藻(Pseudo-nitzschia multiseries))、Tn (L)(粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)轻链)、大豆(叶绿体)、马(L)(轻链)、人(L)、⑶和(M)(分别为轻链、重链和线粒体)、小鼠(L)(轻链)、和蛙(M)和(L)(分别为中等和低级亚基)，和6种细菌铁蛋白(B)，包括Mt (B)(结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis) )、Pa (B)(铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) )、Rs (B)(球形红细菌(Rhodabacter sphaeroides))、Bm(B)(马尔他布鲁氏菌(Brucella melitensis))、Av (B)(维捏兰德固氮菌(Azobacter vinelandii))和 Ec (B)。使用 Clustal W2 (www.eb1.ac.uk/Tools/msa/clustalw2)用 Gonnet 矩阵比对蛋白质序列，并使用邻接法(neighbor-joining method)用 Phylodendron 程序(http://iubi0.bi0.1ndiana.edu/treeapp/treeprint_form.html)产生系统树。(b)幽门螺杆菌与小鼠(轻链)(左侧)或人(轻链)(中间)，与小鼠和人(轻链)(右侧)之间的表面暴露残基的比较。使用由Clustal W2产生的蛋白质序列比对，表满暴露残基的保守由UCSF嵌合物给予。两种铁蛋白间的保守的和变化的残基分别以明売和黑暗残基显不。PDB文件3bve (幽门螺杆菌)(左侧和中间)和lh96(小鼠轻链)(右侧)用于表面渲染(surface rendering)。
[0035]图3:HA-铁蛋白np的抗原性表征。(a)通过ELISA测量针对HA球状头部和茎的单抗的结合。将等量(每孔20 0ng HA)HA三聚体(▲ )、TIV( 实心 )、HA-铁蛋白(籲)或Ferr (与HA-Ferr等摩尔 量)(〇)在板上包被,并将孔用抗头部单抗(3u_u)和抗莖单抗CR6261探查。对每种抗体计算半最大有效结合浓度(EC5tl),并且以ng ml-1显示。(b)通过使用HA三聚体、HA-Ferr或Ferr作为竞争物抑制抗体介导的1999NC假型病毒中和。将中和抑制以相对于无竞争物对照的百分比抑制绘图。抗茎中和性单抗FlO (左侧)和CR6261(右侧)分别以3.125和25 μ g ml-1使用。将竞争物蛋白质以终浓度20 μ g ml-1添加至反应。
[0036]图4:经HA-np免疫的小鼠中的免疫应答。(a)在具有或没有Ribi佐剂和3周时间间隔的情况中用0.17118011撤的量)1'1￥或撤-即的两次免疫后针对1999% HA的HAI (左侧)，IC9tl中和(中间)、和抗HA抗体终点效价(右侧)。在第二次免疫后2周收集免疫血清。数据以具有均值线(η = 5)的盒须图(从下至上四分位数为框，从最小值至最大值为须)呈现。(b)由HA-三聚体、TIV、或HA-np引发的免疫血清的中和宽度。使用Ribi佐剂和4周时间间隔用20 μ g三聚体HA蛋白将额外的一组小鼠(η = 4)免疫两次。在第二次免疫后2周收集免疫血清。测定针对一组HlNl假型病毒的IC5tl中和效价。(c)针对幽门螺杆菌(顶部)和小鼠(底部)铁蛋白细胞和体液免疫应答。使用Ribi佐剂和3周时间间隔用1.67^如撤的量)1^或撤-即，或0.57yg铁蛋白纳米颗粒(与HA-np等摩尔)将小鼠免疫两次。在第二次免疫后11天收获脾细胞和免疫血清。通过ICS(左侧)测量细胞因子生成性⑶4+和⑶8+T细胞，并且通过ELISA (右侧)检测抗体应答。所有表达IFN- Y、TNFa、或IL-2的细胞鉴定为细胞因子+细胞。将响应用覆盖整个幽门螺杆菌或小鼠铁蛋白(组合的重链和轻链)的特定肽刺激而活化的CD4+和CD8+T细胞中细胞因子+细胞的百分比绘图。使用重组幽门螺杆菌和纯化的小鼠(肝)铁蛋白检测抗铁蛋白抗体应答。数据以具有均值线(η = 5)的盒须图呈现。
[0037]图5:小鼠中HA-纳米颗粒的连续免疫。将小鼠用1.67 μ g(HA的量)2009珀斯(H3) HA-纳米颗粒或0.57 μ g (与HA-纳米颗粒等摩尔)空铁蛋白纳米颗粒在第O周时预免疫，然后用1.67 μ g (HA的量)1999NC (HI) HA-纳米颗粒在第3周时免疫。使用Ribi作为佐剂。在没有用空铁蛋白纳米颗粒或H3HA-纳米颗粒预免疫的情况中用1999NC(H1)HA-纳米颗粒免疫另一组小鼠。(a)对幽门螺杆菌铁蛋白(左侧)和2009珀斯H3HA (右侧)的抗体应答。通过ELISA分析用H3HA-纳米颗粒或空铁蛋白纳米颗粒免疫后2周收集的免疫血清。(b)在1999NC(H1)HA-纳米颗粒免疫后对1999NC(H1)的免疫应答。在第3周时用HlHA-纳米颗粒免疫未免疫的小鼠或对铁蛋白或H3HA具有预先免疫的小鼠，并在免疫后2周测量HAI (左侧)、IC9tl中和(中间)和ELISA(右侧)抗体效价。数据以具有均值线(η=5)的盒须图呈现。
[0038]图6:三价 HA-np 的形成。(a)将由来自 2009CA(H1) ,2009 珀斯(H3)或 2006FL (乙型)的HA组成的HA-np纯化，并通过TEM显现。(b)经免疫小鼠中针对2009CA (HlNl)和2009珀斯(H3N2)病毒的HAI效价。使用Ribi佐剂及3周时间间隔用1.67 μ g(HA的量)单价H1、单价H3、单价乙型、或5.0μ g(HA的总量)三价HA-np或TIV(2011-2012季)将小鼠免疫两次。在第二次免疫后2周收集免疫血清。数据以具有均值线(η = 5)的盒须图呈现。
[0039]图7:用HA-np免疫的白鼬中诱导的保护性免疫。使用Ribi佐剂和4周时间间隔用 PBS(对照)、7.5ug(2.5ug H1HA)TIV 或 2.5ug(HA 的量)1999NC HA-np 将白鼬免疫两次。对照动物接受PBS。(a)测定针对同源1999NC HA的经免疫白鼬中的HAl (左侧)、IC90中和(中间)、和抗HA抗体终点效价(右侧)。分别在第一次(R.Salomon, R.G.Webster, Theinfluenza virus enigma.Cel1136，402-410(2009)和第二次(L.C.Lambert, A.S.Fauci, Influenza vaccines for the future.N Engl J Med363,2036-2044(2010))免疫后3和2周收集免疫血清。数据以具有均值线(η = 6)的盒须图(box-and-whiskers)呈现。(b)保护经免疫的白鼬免于不匹配的2007Bris病毒攻击。在第二次免疫后5周用106 550%鸡胚感染剂量(egg infectious dose) (EID50)的2007Bris病毒攻击白鼬。通过50%组织培养物感染剂量(TCID5tl)测定法(左侧)测定攻击后1、3和5天的鼻清洗中的病毒效价。经TIV免疫组中的6只白鼬中的I只在第5天显示可测量的病毒。在经HA-np免疫的组中第3天时6只白鼬中的4只和第5天时6只白鼬中的6只中的病毒效价在检测限?102)下。将每个时间点时均值病毒载量及标准差(s.d.)绘图(η = 6)。还监测病毒攻击后的体重变化(右侧)。每个数据点代表从预攻击(第O天)起的体重均值百分比变化。将每个时间点时均值体重变化及标准差(s.d.)绘图(η = 6)。
[0040]图8:针对茎和RBS的抗体的改善的中和宽度和检测。(a)白鼬中免疫血清的中和宽度。针对一组HlNl假型病毒(左侧)的IC5tl中和效价和针对1934PR8和2007Bris HlNl病毒(右侧)的HAI效价。HAI效价以具有均值线(η = 6)的盒须图呈现。(b)通过HA_np免疫引发的针对茎和RBS的抗体。将白鼬免疫血清(以1:100稀释)用Λ茎HA表达细胞预吸附，并通过ELISA分析其对WT或Λ茎HA的结合(左侧)。将免疫血清(以1: 1，000稀释)用ARBS HA表达细胞预吸附，并通过ELISA分析其对WT或ARBS HA的结合(中间)。将均值终点稀释效价与s.d.一起绘图(η = 6)。用针对茎的单抗CR6261进行的竞争ELISA(右侧)。在存在同种型对照IgG或CR6261的情况中对用Λ茎预吸附的免疫血清测试对HA的结合。每个符号代表单个白鼬的效价(η = 6)。(c)用WT、Δ茎或Λ RBS HA蛋白的中和竞争(左侧)。在存在无关蛋白(对照)、WT、Δ茎或ARBS HA作为竞争物的情况中测量针对1986Sing、1995北京、1999NC和2007Bris的HA_np免疫血清的中和。将血清稀释 1:200 (1986Sing, 2007Bris) ,1:800 (1995 北京)或 1: 3，200 (1999NC)的百分比中和绘图。每个符号代表单个白鼬血清，并且均值与s.d.—起以红线标示(对于1986Sing，1995北京和1999NC，n = 6 ;对于2007Bris，n = 3)。通过每种竞争物蛋白质的中和抑制测定针对茎和RBS的中和的相对贡献(右侧)。将中和每种病毒中的均值百分比贡献以堆积柱状图绘图(η = 6).[0041]图9:ARBS HA探针的表征。(a)与抗 RBS 单抗 CH65Fab (PDB: 3sm5)的 HA (甲型/所罗门群岛/3/2006)复合物的晶体结构(J.R.Whittle等，Broadly neutralizinghuman antibody that recognizes the receptor-binding pocket of influenza virushemagglutinin.Proc Natl Acad Sci USA108, 14216-14221 (2011))(左侧)。CH65 接触区的特写视图(右侧)。已经突变为在Λ RBS突变体中糖基化的残基HA1190是突出显示的。CH65Fab结合的HAl启动子是变暗的。(b)来自1999NC和2007Bris的WT和Λ RBS HA的可溶性三聚体的表征。将WT和ARBS HA蛋白用抗RBS(CH65)、茎(CR6261)和对照(抗HIV，VRCOI)单抗免疫沉淀。然后，将免疫复合物在Lamini缓冲液中溶解，并通过SDS-PAGE分析。抗体重链和轻链分别标记为HC和LC。
[0042]图10:HA-np的纯化。通过常规的碘克沙醇(iodixanol)梯度超速离心常规纯化ΗΑ-ηρο通过SDS-PAGE和使用针对1999NC HA的单抗的Western印迹确认含有HA_np的级分。HA-np以约1.15g/ml的密度在级分中富集。
[0043]图11:使用泛组 IHA-铁蛋白np免疫小鼠和白鼬的方案。用PBS(对照)或Ribi中的6.8ug(l.7ug每种HA-铁蛋白np)泛组I疫苗将小鼠肌内注射两次(第O周和第4周)。用PBS (对照)或Ribi中的IOug (2.5ug每种HA-铁蛋白np)泛组I疫苗将白鼬肌内注射两次(第O周和第4周)。
[0044]图12:针对组IHA假型病毒的小鼠抗血清的中和活性。针对指定HA假型病毒的来自对照或泛组1ΗΑ-ηρ免疫小鼠的鼠抗血清的中和活性。对所有组显示IC50效价。
[0045]图13:针对组IHA假型病毒的白鼬抗血清的中和活性。针对指定HA假型病毒的来自对照或泛组1ΗΑ-ηρ免疫白融的白融抗血清的中和活性。对所有组显示IC50效价。
[0046]图14:使用获自铁蛋白免疫研究的血清实施HlHAI测定法。使用真实的Hl病毒实施这些研究，并使用HA-铁蛋白np实施H2和H5HAI。
[0047]图15:保护白鼬免于甲型/布里斯班/59/2007Brisbane (HlNl) (2007Bris)流感的病毒攻击。将两组白鼬(对于对照为η = 6且对于泛组I免疫为η = 5)用泛组IHA np疫苗或PBS (对照)免疫，并用异源2007Bris病毒(IO6 5EID5tl)攻击。在攻击后第3天和第5天收集的鼻试样中测量病毒效价。在MDCK细胞中使用终点滴定测定效价。
[0048]图16:保护白鼬免于甲型/墨西哥/2009 (HlNl) (2009Mex)流感的病毒攻击。将两组白鼬(η = 6)用泛组IHA np疫苗或PBS (对照)免疫，并用异源2009Mex病毒(IO6 5EID5tl)攻击。在攻击后第3天和第5天收集的鼻试样中测量病毒效价。在MDCK细胞中使用终点滴定测定效价。
[0049]图17:流感HA茎区的保守性。(左侧，右侧)与组I和组2病毒两者起反应的中和性抗体在图中显示的易损性位点处起作用。(右侧)流感HA蛋白的空间填充模型，其显不了超过800种人HlNl株中的氣基酸序列保守性。明売的残基标不100%保守的残基。黑暗的残基指不变异位点。
[0050]图18:HA稳定化茎蛋白的设计。(A)与HA(顶部)相比HA SS(底部)的示意图。通过将GWG接头插入HAlRBD头部(替换HA2的残基59到93而插入的gp41融合后三聚化基序)的残基42和314之间，将GG接头插入HA2和gp41HR2螺旋之间，并将NGTGGGSG接头插入两个gp41螺旋之间构建HA SS0在补充材料中提供H1NC99SS的基因序列。(B)与HASS模型比较的HA(PDB条目1RU7)的三聚体和单体表示。分别对上述小图着色，单体表示也以黄色显示CR6261表位，并且在稳定化HA茎中省略的HA残基为灰色。(C)根据ELISA，CR6261、FI6v3、和VHl-69Ab70-5B03的种系对HA和SS具有类似的亲和力。HA SS与CR6261竞争(D)对HA的结合和(E)与可溶性HA三聚体类似的HlNl假病毒的中和。
[0051]图19。HA和HA SS探针的大小排阻层析谱。在曲线上以垂直线显示校正标准品。
[0052]图20:对纳米颗粒的电子显微术分析。将纯化的SS-np进行透射电子显微术分析。将样品用钥酸铵负染色，并在Tecnai T12显微镜(FEI)上以80kV用CXD照相机(AMTCorp.)记录图像 。显示了较低(左侧)和较高(右侧)放大率的图像。SS刺突从颗粒核心垂直突出，并且明显可见。
[0053]图21:HA SS-铁蛋白np的抗原性表征。通过ELISA表征纯化的HA SS和HA SS-np结合单克隆抗体CR6261(左侧)和FI6v3(右侧)的能力。HA和HIV gpl20蛋白充当对照。
[0054]图22:用HA-np引发剂和HA SS-np加强剂异源免疫的小鼠的免疫血清对保守的HA茎表位是反应性的。通过疫苗接种引发的抗体靶向保守的HA茎表位，因为单独的小鼠在wt和Λ茎HA变体之间拥有差异结合(终点稀释的最小值2倍差异)。在匹配的wt和Λ茎构建体上方给予展示差异结合的小鼠的百分比。误差棒代表标准误差。
[0055]图23:用HA SS免疫的小鼠的免疫血清中和多种多样的假病毒株。针对Hl同亚型(homosubtypic)毒株和H2、H5和H9组-1异亚型(heterosubtypic)毒株对单独的小鼠显示IC50值。虚线代表测定的最低稀释(50)。误差棒代表标准误差。
[0056]图24:用HA SS-ηρ加强提高白鼬中针对HlNl新喀里多尼亚(New Calendonia)的中和效价。对来自单个小鼠的免疫前、HA FL-np引发的、和HA SS-ηρ加强的血清计算假病毒中和性效价。误差棒代表数值的标准差。
[0057]图25:CMV8x/R-HlNC HA(517)_SGG_egm和相关HA-铁蛋白融合蛋白的图谱和序列。
[0058]图26:CMV8x/R-HlCA HA(518)_SGG_egm和相关HA-铁蛋白融合蛋白的图谱和序列。
[0059]图27:CMV8x/R-H2Sing HA(514)_SGG_egm和相关HA-铁蛋白融合蛋白的图谱和序列。
[0060]图28:CMV8x/R-H3HK HA(519)_SGG_egm和相关HA-铁蛋白融合蛋白的图谱和序列。[0061]图29:CMV8x/R-H3Bris HA(519)_SGG_egm和相关HA-铁蛋白融合蛋白的图谱和序列。
[0062]图30:CMV8x/R-H5Indo HA(520)_SGG_egm和相关HA-铁蛋白融合蛋白的图谱和序列。
[0063]图31:CMV8x/R-B.Florida HA (534)_SGG_egm 和相关 HA-铁蛋白融合蛋白的图谱和序列。
[0064]图32:CMV8x/R-H3珀斯HA (519)_SGG_egm和相关HA-铁蛋白融合蛋白的图谱和序列。
[0065]图33:CMV8x/R-HlBris HA(517)_SGG_egm和相关HA-铁蛋白融合蛋白的图谱和序列。
[0066]图34:CMV8x/R-B.Bris HA(535)_SGG_egm和相关HA-铁蛋白融合蛋白的图谱和序列。
[0067]图35:CMV8x/R-HlNC SS Gen4.55_SGG_egm和相关HA SS-铁蛋白融合蛋白的图谱和序列。
[0068]图36:CMV/R HlCA SS/Gen4.55/铁蛋白的图谱和序列。
[0069]图37:CMV/R HlBris SS/Gen4.55/铁蛋白的图谱和序列。
[0070]图38:CMV/R H2Sing SS/Gen4.55/ 铁蛋白的图谱和序列。
[0071]图39:CMV/R H3Bris SS/Gen4.55/铁蛋白的图谱和序列。
[0072]图40:CMV/R H3珀斯SS/Gen4.55/铁蛋白的图谱和序列。
[0073]图41:CMV/R H3HK68SS/Gen4.55/ 铁蛋白的图谱和序列。
[0074]图42:CMV/R H5Indo SS/Gen4.55/ 铁蛋白的图谱和序列。
[0075]图43:CMV/R B Bris SS/Gen4.55/铁蛋白的图谱和序列。
[0076]图44:CMV/R B FL SS/Gen4.55/铁蛋白的图谱和序列。
[0077]发明详述
[0078]本发明涉及流感病毒的新颖疫苗。更具体地，本发明涉及新颖的、基于流感血凝素蛋白的疫苗，其引发针对一大批流感病毒的免疫应答。它还涉及基于自身装配的铁蛋白的纳米颗粒，该纳米颗粒在其表面上展示流感血凝素蛋白的免疫原性部分。此类纳米颗粒可用于针对流感病毒对个体接种疫苗。因而，本发明还涉及用于生成此类纳米颗粒的融合蛋白和编码此类蛋白质的核酸分子。另外，本发明涉及生成本发明的纳米颗粒的方法，及使用此类纳米颗粒对个体接种疫苗的方法。
[0079]在进一步描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方案，因此当然可以有所变化。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体的实施方案，而并不意图为限制性的，因为本发明的范围仅会以权利要求书为限。
[0080]应当注意到，如本文中及所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数提及物，除非上下文另有明确规定。例如，核酸分子指一种或多种核酸分子。因此，术语“ 一个”、“ 一种”、“ 一个/种或多个/种”和“至少一个/种”可以互换使用。类似地，术语“包含”、“包括”和“具有”可以互换使用。进一步注意到，权利要求书可以撰写为排除任何任选要素。因此，此陈述意图充当与权利要求要素的叙述结合使用排除术语，如“单独”、“仅”等，或者使用“负”限定的前置基础。[0081]在上文外，除非另有明确定义，本文中公开的各个实施方案共同的下列术语和短语如下定义:
[0082]如本文中使用的，术语免疫原性指特定蛋白质或其特定区域引发对特定蛋白质，或包含与特定蛋白质具有高度同一性的氨基酸序列的蛋白质的免疫应答的能力。依照本发明，两种具有高度同一性的蛋白质具有至少80%相同，至少85%相同，至少87%相同，至少90%相同，至少92%相同，至少94%相同，至少96%相同，至少98%相同或至少99%相同的氨基酸序列。
[0083]如本文中使用的，对本发明的疫苗或纳米颗粒的免疫应答是受试者中形成对疫苗中存在的血凝素蛋白的体液和/或细胞免疫应答。出于本发明的目的，“体液免疫应答”指由抗体分子，包括分泌性(IgA)或IgG分子介导的免疫应答，而“细胞免疫应答”指由T-淋巴细胞和/或其它白细胞介导的免疫应答。细胞免疫的一个重要方面牵涉细胞裂解T细胞(“CTL”)的抗原特异性应答。CTL对与由主要组织相容性复合物(MHC)编码的蛋白质结合呈递，并且在细胞表面上表达的肽抗原具有特异性。CTL帮助诱导并促进对胞内微生物的破坏，或者此类微生物感染的细胞的裂解。细胞免疫的另一个方面牵涉辅助T细胞的抗原特异性应答。辅助T细胞作用为帮助刺激功能，并且聚焦非特异性效应细胞针对在其表面上展示与MHC分子结合的肽抗原的细胞的活性。细胞免疫应答还涉及生成由活化的T细胞和/或其它白细胞，包括那些自CD4+和CD8+T细胞衍生的细胞生成的细胞因子、趋化因子和其它此类分子。
[0084]因此，免疫学应答可以是刺激CTLjP /或辅助T细胞生成或活化的应答。也可以刺激趋化因子和/或细胞因子的生成。疫苗也可以引发抗体介导的免疫应答。因此，免疫学应答可以包括下列一种或多种效应:B细胞的抗体(例如IgA或IgG)生成；和/或特异性针对疫苗中存在的血凝素蛋白的抑制、细胞毒性、或辅助T细胞和/或T细胞的活化。这些应答可以用来中和感染性，和/或介导抗体-补体，或抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)以对经免疫个体提供保护。可以使用本领域中公知的标准免疫测定法和中和测定法测定此类应答。
[0085]依照本发明，用于分类流感病毒的所有命名是本领域技术人员通常使用的。因此，流感病毒的类型或组指甲型流感、乙型流感或丙型流感。本领域技术人员应当理解，病毒称为特定类型指相应Ml (基质)蛋白或NP (核蛋白)的序列差异。甲型流感病毒进一步分成组I和组2。这些组进一步分成亚型，其涉及基于其HA蛋白序列的病毒分类。目前公认的亚型的例子是HI, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H8, H10, Hll, H12, H13, H14, H15 或 H16。组 I 流感亚型是 HI, H2, H5, H7 和 H9。组 2 流感亚型是 H4, H4, H6, H8, H10, Hll, H12, H13, H14, H15 和H160最后，术语毒株指亚型内彼此的差异在于它们在其基因组中具有小的遗传变异的病毒。
[0086]如本文中使用的，中和性抗体指阻止流感病毒完成一轮复制的抗体。如本文中定义的，一轮复制指病毒的生命周期，其以病毒附着宿主细胞开始并且以新形成的病毒从宿主细胞中出芽结束。此生命周期包括但不限于附着细胞，进入细胞，HA蛋白的切割和重排，病毒膜与内体膜的融合，病毒核糖核蛋白释放入胞质中，新病毒颗粒的形成和病毒颗粒从宿主细胞膜中出芽的步骤。
[0087]如本文中使 用的，广泛中和性抗体指中和超过一种流感病毒类型、亚型和/或毒株的抗体。例如，针对来自甲型流感病毒的HA蛋白引发的广泛中和性抗体可以中和乙型或丙型病毒。作为别的例子，针对来自组I流感病毒的HA蛋白引发的广泛中和性抗体可以中和组2病毒。作为别的例子，针对来自一种病毒亚型或毒株的HA蛋白引发的广泛中和性抗体可以中和另一种病毒亚型或毒株。例如，针对来自Hl流感病毒的HA蛋白引发的广泛中和性抗体可以中和来自一种或多种选自下组的亚型的病毒:H2，H3, H4, H5, H6, H7, H8, H8, HlO, Hll, H12, H13, H14, H15 或 H16。
[0088]如本文中使用的，流感血凝素蛋白或HA蛋白指全长流感血凝素蛋白或其任何部分，其能够引发免疫应答。优选的HA蛋白是那些能够形成三聚体的。全长流感血凝素蛋白的表位指此类蛋白质中能引发针对同源流感毒株，即衍生HA的毒株的中和性抗体应答的部分。在一些实施方案中，此类表位也能引发针对异源流感毒株，即与免疫原的HA的毒株具有不同HA的毒株的中和性抗体应答。
[0089]就血凝素蛋白而言，本领域技术人员理解的是，来自不同流感病毒的血凝素蛋白由于蛋白质突变(插入、缺失)而可以具有不同长度。因此，提及相应区域指另一种蛋白质中与比较的区域在序列、结构和/或功能上相同或几乎相同(例如至少95%相同，至少98%相同或至少99%相同)的区域。例如，就血凝素蛋白的茎区而言，另一种血凝素蛋白中的相应区域不能具有相同的残基数目，但是会具有几乎相同的序列，且会实施相同的功能。为了更好阐明病毒间的序列比较，本领域技术人员使用编号系统，其相对于参照序列叙述氨基酸位置。因此，来自不同流感毒株的血凝素蛋白中的相应氨基酸残基就其与蛋白质N端氨基酸的距离而言可以没有相同的残基号。例如，使用H3编号系统，提及甲型/新喀里多尼亚/20/1999 (1999NC，Hl)中的残基100不意味着其是距N端氨基酸的第100个残基。取而代之，甲型/新喀里多尼亚/20/1999 (1999NC, Hl)的残基100与流感H3N2毒株的残基100比对。本领域技术人员了解此类编号系统的使用。除非另有记录，使用H3编号系统对本文中的血凝素蛋白中的氨基酸进行提及。
[0090]依照本发明，三聚化域是在与蛋白质或肽连接(又称为融合)时容许融合蛋白与其它含有三聚化域的融合蛋白相互作用，使得形成三聚体结构的一系列氨基酸。任何已知的三聚化域可以用于本发明。三聚化域的例子包括但不限于HIV-lgp41三聚化域、SIVgp41三聚化域、埃博拉(Ebola)病毒gp-2三聚化域、HTLV-lgp-21三聚化域、T4纤维蛋白(fibritin)三聚化域(即折叠子(foldon))、酵母热休克转录因子三聚化域、和人胶原三聚化域。
[0091]如本文中使用的，变体指在序列上与参照序列相似但不相同的蛋白质或核酸分子，其中变体蛋白质(或由变体核酸分子编码的蛋白质)的活性没有显著改变。这些序列变异可以是天然存在的变异或者它们可以经由使用本领域技术人员已知的遗传工程化技术来工程化改造。此类技术的例子可见Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T等,于 Molecular Cloning—A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989, pp.9.31-9.57), 或于 Current Protocols in MolecularBiology, John ffiley&Sons, N.Y.(1989),6.3.1_6.3.6，这两篇的完整内容通过提及并入本文。
[0092]就变体而言，氨基酸或核酸序列的任何类型变化是可允许的，只要所得的变体蛋白质保留引发针对流感病毒的中和性抗体的能力。此类变异的例子包括但不限于缺失、插入、取代及其组合。例如，就蛋白质而言，本领域技术人员公知的是，一个或多个(例如2，3，4，5，6，7，8，9或10)氨基酸经常可以从蛋白质的氨基和/或羧基端末端除去，而不显著影响所述蛋白质的活性。类似地，一个或多个(例如2，3，4，5，6，7，8，9或10)氨基酸经常可以插入蛋白质中，而不显著影响蛋白质的活性。
[0093]如记录的，相对于本文中公开的流感HA蛋白，本发明的变体蛋白质可以含有氨基酸取代。任何氨基酸取代是可允许的，只要蛋白质的活性不受显著影响。在这点上，本领域中应当理解，氨基酸可以基于其物理特性而分成组。此类组的例子包括但不限于带电荷的氨基酸、不带电荷的氨基酸、极性不带电荷的氨基酸、和疏水性氨基酸。含有取代的优选变体是那些其中的氨基酸用来自相同组的氨基酸取代的变体。此类取代称为保守取代。
[0094]天然存在的残基可以基于共同的侧链特性而分成类:
[0095]I)疏水性:Met, Ala, Val, Leu, He ；
[0096]2)中性亲水性:Cys, Ser, Thr ；
[0097]3)酸性:Asp, Glu ；
[0098]4)碱性:Asn, Gin, His, Lys, Arg ；
[0099]5)影响链取向的残基:Gly, Pro ;和
[0100]6)芳香基:Trp, Tyr, Phe。
[0101]例如，非保守取代可以牵涉用这些类别之一的成员替换来自另一类别的成员。
[0102]在进行氨基酸变化中，可以考虑氨基酸的亲水指数。基于每种氨基酸的疏水性和电荷性质，已给每种氨基酸的亲水指数赋值。亲水指数是:异亮氨酸(+4.5);缬氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);甲硫氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘 氨酸(-0.4);苏氨酸(-0.7);丝氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);组氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);赖氨酸(-3.9);和精氨酸(-4.5)。本领域一般了解亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用性生物学功能中的重要性(Kyte等，1982，J.Mol.Biol.157:105-31)。已知可以用某些氨基酸替代其它具有相似亲水指数或分值的氨基酸，而仍然保留相似的生物学活性。在进行基于亲水指数的变化中，亲水指数在±2之内的氨基酸取代是优选的，在± I之内的那些氨基酸取代是特别优选的，且在±0.5之内的那些氨基酸取代是甚至更特别优选的。
[0103]本领域还了解可以基于疏水性有效地进行类似氨基酸的取代，特别是在意图将由此产生的生物功能等同性蛋白质或肽用于结合免疫学发明(本案就是如此)的情况中。蛋白质的最大局部平均亲水性(如由其相邻氨基酸的亲水性所决定的)与其免疫原性和抗原性，即与蛋白质的生物学特性相关联。已将下列亲水性数值(hydrophilicity value)赋予这些氨基酸残基:精氨酸(+3.0);赖氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0±1);谷氨酸(+3.0±1);丝氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(O);苏氨酸(-0.4);脯氨酸(_0.5±1);丙氨酸(-0.5);组氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);缬氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);异亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);和色氨酸(-3.4)。在进行基于相似亲水性数值的变化时，亲水性数值在±2之内的氨基酸取代是优选的，在± I之内的那些氨基酸取代是特别优选的，且在±0.5之内的那些氨基酸取代是甚至更特别优选的。还可以基于亲水性鉴定来自一级氨基酸序列的表位。[0104]在期望此类取代时，本领域技术人员可以确定期望的氨基酸取代(无论是保守的还是非保守的)。例如，可以使用氨基酸取代来鉴定HA蛋白的重要残基，或者提高或降低本文中描述的HA蛋白的免疫原性、溶解度或稳定性。下文在表1中显示了例示性的氨基酸取代。
[0105]表1
【权利要求】
1.一种包含融合蛋白的纳米颗粒，其中所述融合蛋白包含与第一流感血凝素(HA)蛋白连接的至少25个来自单体铁蛋白亚基蛋白的连续氨基酸，使得所述纳米颗粒在其表面上包含流感病毒HA蛋白三聚体。
2.权利要求1的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒形成八面体。
3.权利要求1的纳米颗粒，其中所述八面体由24个具有432对称的亚基组成。
4.权利要求1的纳米颗粒，其中所述单体铁蛋白亚基蛋白选自下组:细菌铁蛋白、植物铁蛋白、藻铁蛋白、昆虫铁蛋白、真菌铁蛋白和哺乳动物铁蛋白。
5.权利要求1的纳米颗粒，其中所述单体铁蛋白亚基蛋白是幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)铁蛋白蛋白质的单体亚基。
6.权利要求1的纳米颗粒，其中所述单体铁蛋白亚基蛋白包含选自下组的氨基酸序列的至少25个连续氨基酸:SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:5。
7.权利要求1的纳米颗粒，其中所述单体铁蛋白亚基蛋白包含与选自下组的氨基酸序列至少约80%相同的氨基酸序列:SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:5。
8.权利要求1的纳米颗粒，其中所述单体亚基包含与SEQID NO:2的氨基酸5-167对应的区域。
9.权利要求1的纳米颗粒，其中所述单体亚基包含选自下组的氨基酸序列:SEQIDNO:2 和 SEQ ID NO:5。
10.权利要求1的纳米颗粒，其中所述血凝素蛋白包含来自选自下组的流感病毒的血凝素蛋白的至少25个连续氨基酸:甲型/新喀里多尼亚(NewCaledonia) /20/1999 (1999NC, HI)、甲型 / 加利福尼(California) /04/2009 (2009CA, HI)、甲型 / 新加坡 1/1957 (1957Sing, H2)、甲型 / 香港 /1/1968 (1968HK, H3)、甲型 / 布里斯班 /10/2007 (2007Bris, H3)、甲型 / 印度尼西亚 /05/2005 (2005Indo, H5)、乙型 / 佛罗里达 /4/2006 (2006Flo, B)、甲型 / 珀斯 /16/2009 (2009Per, H3)、甲型 / 布里斯班/59/2007 (2007Bris, HI)、乙型 / 布里斯班 /60/2008 (2008Bris, B)。
11.权利要求1的纳米颗粒，其中所述血凝素蛋白包含与选自下组的氨基酸序列至少约80%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 14，SEQ ID NO: 17，SEQID NO:20, SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:35和SEQID N0:38。
12.权利要求1的纳米颗粒，其中所述血凝素蛋白包含选自下组的氨基酸序列:SEQIDNO:8，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:23，SEQ IDNO:26，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:35 和 SEQ ID NO:38。
13.权利要求1的纳米颗粒，其中所述血凝素蛋白能够引发对包含选自下组的氨基酸序列的蛋白质的免疫应答:SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 14，SEQ ID NO: 17，SEQID NO:20, SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:35和SEQID N0:38。
14.权利要求1的纳米颗粒，其中所述血凝素蛋白包含选自下组的区域:能够容许血凝素三聚体形成的区域、茎区、胞外结构域(ectodomain)、和包含从刚好在第二螺旋卷曲螺旋的最后一个氨基酸的远端的氨基酸残基至跨膜域的第一个氨基酸的近端的氨基酸残基的氨基酸序列的区域。
15.权利要求1的纳米颗粒，其中所述血凝素蛋白包含与选自下组的氨基酸序列至少约80%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:80, SEQID NO:83，SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:89，SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:95 和 SEQ ID NO:98。
16.权利要求1的纳米颗粒，其中所述血凝素蛋白包含选自下组的氨基酸序列:SEQIDNO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:86, SEQ IDNO:89，SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:95 和 SEQ ID NO:98。
17.权利要求1的纳米颗粒，其中所述血凝素蛋白包含与SEQID NO:8的氨基酸1-519对应的区域。
18.权利要求1的纳米颗粒，其中所述血凝素蛋白包含血凝素刺突域。
19.权利要求1的纳米颗粒，其中所述血凝素蛋白包含选自下组的氨基酸序列:SEQIDNO:8 的氨基酸 1-519 和 SEQ ID NO: 11。
20.权利要求1的纳米颗粒，其中所述融合蛋白包含接头序列。
21.权利要求1的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒引发针对流感血凝素茎区的免疫应答。
22.权利要求1的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒引发针对流感血凝素刺突的免疫应答。
23.权利要求1的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒引发针对流感病毒株的免疫应答，所述流感病毒株对于获得所述血凝素蛋白的流感病毒株而言是异源的。
24.权利要求1的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒引发针对流感病毒的免疫应答，所述流感病毒与获得所述血凝素蛋白的流感病毒在抗原性上是趋异的。
25.权利要求1的纳米颗粒，其中所述融合蛋白包含与选自下组的序列至少80%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:50, SEQ IDNO:53，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:62，SEQ ID NO:65 和 SEQ ID NO:68，其中所述纳米颗粒引发针对流感病毒的免疫应答。
26.权利要求1的纳米颗粒，其中所述融合蛋白包含选自下组的氨基酸序列:SEQIDNO:41, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:56, SEQ IDNO:59，SEQ ID NO:62，SEQ ID NO:65 和 SEQ ID NO:68。
27.权利要求1的纳米颗粒，其中所述融合蛋白包含与选自下组的序列至少80%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO: 101, SEQ ID N0:104SEQ ID N0:107SEQ ID NO: 110SEQ IDNO:113SEQ ID NO:116SEQ ID NO:119SEQ ID NO:122SEQ ID NO:125 和 SEQ ID NO:128，其中所述纳米颗粒引发针对流感病毒的免疫应答。
28.权利要求1的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含第二融合蛋白，该第二融合蛋白包含第二流感血凝素蛋白，其中所述第一和第二流感血凝素蛋白来自不同流感病毒类型。
29.权利要求1的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包含第二流感血凝素蛋白，其中所述第一和第二流感血凝素蛋白来自不同流感病毒亚型。
30.权利要求1的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包含第二流感血凝素蛋白，其中所述第一和第二流感血凝素蛋白来自不同流感病毒株。
31.一种疫苗组合物，其包含权利要求1-30中任一项的纳米颗粒。
32.权利要求31的疫苗组合物，其进一步包含至少一种别的纳米颗粒，其中所述别的纳米颗粒包含至少一种血凝素蛋白，该血凝素蛋白与所述第一血凝素蛋白和所述第二血凝素蛋白来自不同流感毒株。
33.一种生成针对流感病毒的疫苗的方法,该方法包括a)在一定的条件下表达融合蛋白，使得所述融合蛋白形成在其表面上展示血凝素三聚体的纳米颗粒，所述融合蛋白包含与流感血凝素蛋白连接的单体铁蛋白蛋白质，并b)回收所述纳米颗粒。
34.一种针对流感对个体接种疫苗的方法，该方法包括对个体施用纳米颗粒，使得所述纳米颗粒引发针对流感病毒的免疫应答，其中所述纳米颗粒包含与流感血凝素蛋白连接的铁蛋白单体亚基，且其中所述纳米颗粒在其表面上展示流感血凝素三聚体。
35.权利要求34的方法，其中所述纳米颗粒引发针对流感病毒株的免疫应答，所述流感病毒株对于获得所述血凝素蛋白的流感病毒亚型而言是异源的。
36.权利要求34的方法，其中所述纳米颗粒引发针对流感病毒株的免疫应答，所述流感病毒株对于获得血凝素蛋白的流感病毒株而言是异源的。
37.权利要求34的方法，其中所述纳米颗粒引发针对流感病毒的免疫应答，所述流感病毒与获得所述血凝素蛋白的流感病毒在抗原性上是趋异的。
38.权利要求34的方法，其中施用包括对所述个体施用第一疫苗组合物，然后在后来的时间，施用包含纳米颗粒的第二疫苗组合物，所述纳米颗粒包含HA-SS-铁蛋白融合蛋白。
39.权利要求38的方法，其中所述HASS-铁蛋白融合蛋白包含与选自下组的序列至少80%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:80，SEQID NO:83，SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:89，SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:98，其中所述HA SS-铁蛋白融合蛋白弓丨发针对流感病毒的免疫应答。
40.权利要求38的方法，其中所述HASS-铁蛋白融合蛋白包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:83, SEQ IDNO:86，SEQ ID NO:89，SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:95 和 SEQ ID NO:98。
41.权利要求38的方法，其中所述HASS-铁蛋白融合蛋白包含与选自下组的序列至少80%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO: 101, SEQ ID N0:104SEQ ID N0:107SEQ ID NO: 110SEQID NO:113SEQ ID NO:116SEQ ID NO:119SEQ ID NO:122SEQ ID NO: 125和SEQ ID NO: 128，其中所述HA SS-铁蛋白融合蛋白弓丨发针对流感病毒的免疫应答。
42.权利要求38的方法，其中所述HASS-铁蛋白融合蛋白包含选自下组的序列:SEQID NO:101, SEQ ID N0:104SEQ ID N0:107SEQ ID NO:110SEQ ID NO:113SEQ ID NO:116SEQID NO:119SEQ ID NO:122SEQ ID NO:125 和 SEQ ID NO:128。
43.权利要求38的方法，其中所述第一疫苗组合物包含纳米颗粒，该纳米颗粒包含来自选自下组的流感病毒的血凝素蛋白的胞外结构域:甲型/新喀里多尼亚 /20/1999 (1999NC, Hl)、甲型 / 加利福尼 /04/2009 (2009CA, Hl)、甲型 / 新加坡 1/1957 (1957Sing，H2)、甲型 / 香港 /1/1968 (1968HK，H3)、甲型 / 布里斯班/10/2007 (2007Bris，H3)、甲型 / 印度尼西亚 /05/2005 (2005Indo, H5)、乙型 / 佛罗里达 /4/2006 (2006Flo, B)、甲型 / 珀斯 /16/2009 (2009Per, H3)、甲型 / 布里斯班/59/2007 (2007Bris, HI)、乙型 / 布里斯班 /60/2008 (2008Bris, B)。
44.权利要求38的方法，其中所述第一疫苗组合物蛋白质的血凝素包含与选自下组的氨基酸序列至少约80%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQID NO:17，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:32，SEQID NO:35 和 SEQ ID NO:38。
45.权利要求38的方法，其中所述第一疫苗组合物蛋白质的血凝素包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:20, SEQID NO:23，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:35 和 SEQ ID NO:38。
46.权利要求38的方法，其中所述第一疫苗组合物包含HA-铁蛋白融合蛋白，该HA-铁蛋白融合蛋白包含与选自下组的序列至少80%相同的氨基酸序列:SEQ ID N0:41,SEQ IDNO:44，SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:59, SEQ IDNO:62, SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:68，其中所述纳米颗粒引发针对流感病毒的免疫应答。
47.权利要求38的方法，其中所述第一疫苗组合物包含HA-铁蛋白融合蛋白，该HA-铁蛋白融合蛋白包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:44, SEQ IDNO:47，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:62，SEQ IDNO:65 和 SEQ ID NO:68。
48.权利要求38的方法，其中在施用所述第一疫苗组合物后10天-4周施用所述第二疫苗组合物。
49.一种融合蛋白，其包含与流感血凝素蛋白连接的单体铁蛋白亚基蛋白。
50.权利要求49的融合蛋白，其中所述单体铁蛋白亚基蛋白选自下组:细菌铁蛋白、植物铁蛋白、藻铁蛋白、昆虫铁蛋白、真菌铁蛋白和哺乳动物铁蛋白。
51.权利要求49的融合蛋白，其中所述单体亚基是幽门螺杆菌铁蛋白蛋白质的单体亚基。
52.权利要求49的融合蛋白，其中所述单体铁蛋白亚基蛋白包含容许所述融合蛋白自身装配成纳米颗粒的域。
53.权利要求49的融合蛋白，其中所述单体铁蛋白亚基蛋白包含至少25个来自选自下组的序列的连续氨基酸:SEQ ID NO:2和SEQ I NO:5，其中所述融合蛋白能够自身装配成纳米颗粒。
54.权利要求49的融合蛋白，其中所述单体亚基包含与选自下组的序列至少约80%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5，其中所述融合蛋白能够自身装配成纳米颗粒。
55.权利要求49的融合蛋白，其中所述单体亚基包含与SEQID NO:2的氨基酸5-167对应的区域。
56.权利要求49的融合蛋白，其中所述单体亚基包含选自下组的氨基酸序列:SEQIDNO:2 和 SEQ ID NO:5。
57.权利要求49的融合蛋白，其中所述血凝素蛋白包含至少25个来自选自下组的流感病毒的氨基酸:甲型/新喀里多尼亚/20/1999 (1999NC, Hl)、甲型/加利福尼 /04/2009 (2009CA，Hl)、甲型 / 新加坡 1/1957 (1957Sing，H2)、甲型 / 香港 /1/1968 (1968HK, H3)、甲型 / 布里斯班 /10/2007 (2007Bris, H3)、甲型 / 印度尼西亚 /05/2005 (2005Indo, H5)、乙型 / 佛罗里达 /4/2006 (2006Flo, B)、甲型 / 珀斯/16/2009 (2009Per, H3)、甲型 / 布里斯班 /59/2007 (2007Bris, HI)、乙型 / 布里斯班/60/2008(2008Bris, B)。
58.权利要求49的融合蛋白，其中所述血凝素蛋白包含与选自下组的氨基酸序列至少约80%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO:8，SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 14，SEQ ID NO: 17，SEQID NO:20, SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:35和SEQID NO:38。
59.权利要求49的融合蛋白，其中所述血凝素蛋白能够引发针对包含选自下组的氨基酸序列的蛋白质的免疫应答:SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 14，SEQ ID NO: `17，SEQID NO:20, SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:35和SEQID NO:38。
60.权利要求49的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含与选自下组的氨基酸序列至少约80%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:50, SEQID NO:53，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:62，SEQ ID NO:65 和 SEQ ID NO:68。
61.权利要求49的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含选自下组的氨基酸序列:SEQIDNO:41, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:56, SEQ IDNO:59，SEQ I D NO:62，SEQ ID NO:65 和 SEQ ID NO:68。
62.权利要求49的融合蛋白，其中所述血凝素蛋白包含选自下组的区域:能够容许所述血凝素蛋白三聚化的区域、茎区、胞外结构域、和包含从刚好在第二螺旋卷曲螺旋的最后一个氨基酸的远端的氨基酸残基至跨膜域的第一个氨基酸的近端的氨基酸残基的氨基酸序列的区域。
63.权利要求49的融合蛋白，其中所述血凝素蛋白包含与SEQID NO:8的氨基酸1-519对应的区域。
64.权利要求49的融合蛋白，其中所述血凝素蛋白包含血凝素刺突域。
65.权利要求49的融合蛋白，其中所述血凝素蛋白包含选自下组的氨基酸序列:SEQID NO:8 的氨基酸 1-519 和 SEQ ID NO: 11。
66.权利要求49的融合蛋白，其中所述血凝素蛋白包含来自选自下组的流感病毒的茎区:甲型/新喀里多尼亚/20/1999 (1999NC, Hl)、甲型/加利福尼/04/2009 (2009CA, Hl)、甲型 / 新加坡 1/1957 (1957Sing, H2)、甲型 / 香港 /1/1968 (1968HK, H3)、甲型 / 布里斯班 /10/2007 (2007Bris, H3)、甲型 / 印度尼西亚 /05/2005 (2005Indo, H5)、乙型 / 佛罗里达 /4/2006 (2006Flo, B)、甲型 / 珀斯 /16/2009 (2009Per, H3)、甲型 / 布里斯班/59/2007 (2007Bris, HI)、乙型 / 布里斯班 /60/2008 (2008Bris, B)。
67.权利要求49的融合蛋白，其中所述血凝素蛋白包含与SEQID NO:71, SEQ IDNO:74，SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:83，SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:89，SEQ IDNO:92, SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:98至少约80%相同的氨基酸序列。
68.权利要求49的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含一个或多个接头序列。
69.权利要求49的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含与选自下组的序列至少80%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO: 101, SEQ ID N0:104SEQ ID N0:107SEQ ID NO: 110SEQ IDNO:113SEQ ID NO:116SEQ ID NO:119SEQ ID NO:122SEQ ID NO:125 和 SEQ ID NO:128。
70.权利要求49的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含选自下组的序列:SEQIDNO:101, SEQ ID N0:104SEQ ID N0:107SEQ ID NO:110SEQ ID NO:113SEQ ID NO:116SEQ IDNO:119SEQ ID NO:122SEQ ID NO:125 和 SEQ ID NO:128。
71.—种编码权利要求49-70中任一项的融合蛋白的核酸分子。
72.权利要求71的核酸分子，其中所述核酸分子与启动子在功能上连接。
73.—种重组细胞，其包含权利要求71的核酸分子。
74.—种重组病毒,其包含权利要求71的核酸分子。
75.一种蛋白质，其包含与选自下组的序列至少80%相同的氨基酸序列:SEQ IDNO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:86, SEQ IDNO:89，SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:98，其中所述蛋白质与一个或多个三聚化域连接。
76.权利要求75的蛋白质，其中所述蛋白质与流感血凝素蛋白的头区的至少一部分连接。
77.权利要求75的蛋白质，其中所述蛋白质包含一个或多个接头区。
78.权利要求75的蛋白质，其中所述蛋白质引发针对流感病毒的免疫应答。
【文档编号】A61K9/14GK103957891SQ201280057703
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2012年9月24日 优先权日:2011年9月23日
【发明者】G.J.M.D.纳贝尔, M.卡尼基尤, C-J.韦, P.M.麦克塔姆尼, H.M.亚西尼, J.C.博英格顿 申请人:美利坚合众国 由健康及人类服务部部长代表