专利名称：胶原产生促进剂、透明质酸产生促进剂、成纤维细胞增殖促进剂及抗皱剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及胶原产生促进剂、透明质酸产生促进剂、成纤维细胞增殖促进剂及抗皱剂，特别是涉及胶原产生促进效果等优异的植物种子的有机溶剂提取物的处理物。
背景技术：
皮肤自外侧起由角质层、表皮、基底膜和真皮构成。
真皮是其中范围最广的部分，细胞并不像表皮那样紧密堆叠。而且细胞外空间大都被称作“细胞外基质”的巨大分子的网格结构所填充。该细胞外基质在真皮内的成纤维细胞等中产生，由透明质酸、硫酸皮肤素等被称为酸性粘多糖的多糖类以及胶原、弹性蛋白等纤维性蛋白质构成。细胞外基质与皮肤的弹性、张力、水嫩感、新陈代谢等直接相关。成纤维细胞等中的细胞外基质的产生减弱，则会失去皮肤的弹性和水嫩感，容易发生肌肤干燥，成为导致皮肤老化的一大原因。
上述纤维性蛋白质主要由胶原构成，其中，I型胶原占全部的80%。除I型胶原夕卜，还已知II1、V、XII和XIV型胶原的存在。老化皮肤上可见的松弛的成因之一在于皮肤组织随着年龄的增加而变薄。老化的皮肤中，作为真皮的主要基质成分的胶原纤维的减少显著，这很可能成为皮肤厚度减小的主要原因。因此，认为促进胶原的产生、维持胶原量对于松弛的预防和改善是有效的。
另外，除上述以外，胶原的产生促进对于皮肤的创伤治疗的改善、以及骨质疏松症、关节炎、腱鞘炎等的治疗、高血压的防止等也是有效的。
迄今为止，作为胶原产生促进剂，已知包含仅以水作为提取溶剂从柏子仁(侧柏种子干燥得到的产品)中提取的生药提取物的胶原产生促进剂(例如参照专利文献I)。但是，该生药提取物的胶原产生促进效果具有改善的余地。
另一方面，上述多糖类中的透明质酸具有细胞间隙中的水分的保持、以在组织内形成果冻状的基质为基础的细胞的保持、组织的润滑性和柔软性的保持、对机械损伤等外力的抵抗、以及细菌感染的防止等多种功能。最近，关于与癌症转移的关系，也正在进行大量研究。
另外，除皮肤外，透明质酸还分布在关节液、玻璃体、韧带等中，在机体内广泛分布。因此，除了提高保湿效果外，透明质酸的产生促进对于关节疼痛(变形性膝关节病)的治疗、皮肤松弛的改善、以干眼症为主的角结膜上皮损伤的治疗、白内障和角膜移植手术时的前房保持等也是有效的。
迄今为止，作为透明质酸产生促进剂，已知含有属于公牛藻科公牛藻属的海藻的提取物作为有效成分的透明质酸产生促进剂(例如参照专利文献2)。
如上所述，除了肌肤的松弛、肌肤干燥等的改善和防止、皮肤老化的防止外，胶原、透明质酸还可应用于膝关节病的改善剂和眼科手术用制剂等。因此，如果能找到具有胶原、透明质酸这两者的产生促进效果的物质，则具有能广泛应用于上述症状的改善、预防和治疗等的优点。
另一方面，专利文献3中，已知对选自崖柏{Thuja)属植物、悬钩子(Rubus)属植物、越橘(Jaccinimi)属植物、称猴桃(Actinidia)属植物和紫苏(PerilIa)属植物中的植物的种子进行提取，制成植物提取物，然后对该植物提取物实施碱处理而得的植物性美白剂的制造方法。
但是，并不知道侧柏有机溶剂提取物的处理物具有优异的胶原产生促进效果和透明质酸产生促进效果。
现 有技术文献 专利文献 专利文献1:日本特开2010-235482号公报 专利文献2:日本特开平9-176036号公报 专利文献3:日本特开2007-223944号公报。发明内容
发明所要解决的课题 本发明是鉴于上述现有技术而完成的发明，其目的在于提供胶原产生促进效果和透明质酸产生促进效果等优异的植物种子的有机溶剂提取物的处理物。
用于解决课题的手段 为了解决上述课题，本发明人进行了认真研究，结果发现，用有机溶剂提取属于柏科{Cupressaceae)侧柏属ipiatycladus)的植物的种子,得到含有油性成分的提取物,对该提取物进行碱处理和酸处理后，进行水洗，得到的处理物具有优异的胶原产生促进效果等，从而完成了本发明。
S卩，本发明所述的胶原产生促进剂的特征在于，用有机溶剂提取属于柏科{Cupressaceae)侧柏属ipiatycladus)的植物的种子,得到含有油性成分的提取物,将该提取物的溶剂的一部分或全部蒸馏除去后，添加浓度0.5 15N的碱水溶液并混合，接着进行酸处理后，进行水洗而得到。
本发明所述的透明质酸产生促进剂的特征在于，用有机溶剂提取属于柏科{Cupressaceae)侧柏属ipiatycladus)的植物的种子,得到含有油性成分的提取物,将该提取物的溶剂的一部分或全部蒸馏除去后，添加浓度0.5 15N的碱水溶液并混合，接着进行酸处理后，进行水洗而得到。
本发明所述的成纤维细胞增殖促进剂的特征在于，用有机溶剂提取属于柏科{Cupressaceae)侧柏属ipiatycladus)的植物的种子,得到含有油性成分的提取物,将该提取物的溶剂的一部分或全部蒸馏除去后，添加浓度0.5 15N的碱水溶液并混合，接着进行酸处理后，进行水洗而得到。
本发明的抗皱剂的特征在于,用有机溶剂提取属于柏科{Cupressaceae)侧柏属iPlatycladus)的植物的种子，得到含有油性成分的提取物，将该提取物的溶剂的一部分或全部蒸馏除去后，添加浓度0.5 15N的碱水溶液并混合，接着进行酸处理后，进行水洗而得到。
所述促进剂或抗皱剂中，优选添加的纯碱量为100 300g/L提取物。
所述促进剂或所述抗皱剂中，优选属于柏科侧柏属的植物是侧柏iPlatycladusoriental is)。
本发明所述的胶原产生促进方法的特征在于，涂敷所述胶原产生促进剂。
本发明所述的透明质酸产生促进方法的特征在于，涂敷所述透明质酸产生促进剂。
本发明所述的成纤维细胞增殖促进方法的特征在于，涂敷所述成纤维细胞增殖促进剂。
本发明所述的皱纹改善方法的特征在于,涂敷所述抗皱剂。
本发明所述的胶原产生促进方法的特征在于，口服摄取所述胶原产生促进剂。
本发明所述的透明质酸产生促进方法的特征在于，口服摄取所述透明质酸产生促进剂。
本发明所述的成纤维细胞增殖促进方法的特征在于，口服摄取所述成纤维细胞增殖促进剂。
本发明所述的皱纹改善方法的特征在于，口服摄取所述抗皱剂。
发明的效果 根据本发明，可提供作为胶原产生促进剂、透明质酸产生促进剂、成纤维细胞增殖促进剂、抗皱剂有用的植物种子的有机溶剂提取物的处理物。
图1是表示侧柏种子的水提取物和该种子的有机溶剂提取物的处理物之间的胶原产生促进效果的比较的图。
图2是表示侧柏种子的有机溶剂提取物的处理物的皱纹改善效果的图。
具体实施方式
本发明所述的胶原产生促进剂的特征在于，用有机溶剂提取属于柏科{Cupressaceae)侧柏属 iPlatycladus)的植物的种子,得到含有油性成分的提取物,将该提取物的溶剂的一部分或全部蒸馏除去后，添加浓度0.5 15N的碱水溶液并混合，接着进行酸处理后，进行水洗而得到。
本发明中使用的植物的种子是属于柏科侧柏属的植物的种子。其中优选使用侧柏iPlatycladus oriental is)的种子。
侧柏原产于中国、朝鲜半岛，约250年前传到日本，现在在日本各地种植，是树高5 15m的常用灌木或小乔木。
侧柏的种子呈黑褐色的长椭球形，也称“柏子仁”。其在中医学上广泛使用，用于滋养强壮和消炎等。
提取物的具体提取方法、碱处理方法、酸处理方法可采用例如以下方法。
相对于柏科植物的种子的质量，用I 100倍、优选I 30倍左右的质量的有机溶剂进行一定时间的提取。所用的种子也可以根据需要适度地粉碎，过滤时网眼堵塞成为问题时等的情况下，可以在未粉碎状态下直接使用。
此外，也可以用少量的有机溶剂反复提取，可以使用索格利特提取器之类的回流装置。
提取中使用的有机溶剂只要是通常在提取中使用的有机溶剂即可，无特别限定，优选挥发性有机溶剂。
作为有机溶剂，可以单独或两种以上组合使用例如甲醇、乙醇等醇类，含水醇类、丙酮、乙酸乙酯、己烷、乙醚等极性或非极性有机溶剂。其中，从价格低、容易减压浓缩的角度考虑，特别优选丙酮、乙酸乙酯、己烷。除此之外，也可以用超临界二氧化碳气体进行提取，或者压榨种子而使用榨汁。
与之相对，含水的提取溶剂会抑制活性成分的提取，因此不优选。
从如上所述得到的提取物中除去有机溶剂后，进行碱处理。
碱处理的方法无特别限定，可以通过例如下述方法得到:将有机溶剂提取物的溶剂的一部分或全部蒸馏除去后，添加浓度0.5 15Ν、优选1 10N的碱水溶液并混合。
更具体而言，例如相对于溶剂蒸馏除去后的提取物，添加0.2 2倍容量的浓碱水溶液后，充分搅拌混合，进行30分钟 数天左右的熟化。作为浓碱水溶液，可例举包含0.5 15Ν、优选1 10N的浓度的NaOH、KOH等的水溶液。应予说明，优选添加浓碱水溶液，使纯碱量达到100 300g/L提取物。
作为混合时的温度，优选室温 70°C的范围，更优选30 60°C的范围。熟化时，优选进行适当搅拌，以使亲水性成分和亲油性成分不分离。
对如上所述经过碱处理的处理物实施酸处理。
酸处理的方法无特别限定，可例举例如添加浓度0.5 15N的酸溶液，使pH降至0.5 2左右的方法。
如果实施酸处理，则液状(油状)物质分离出来。该液状物质在具有极高的胶原产生促进效果的同时，也对肌肤显示出高安全性。
为了促进液状物质的回收而进行水洗。然后，可以根据需要进行脱色、脱臭、脱盐、蒸馏等操作。
从属于柏科侧柏属的植物的种子中如上所述提取、处理而得的成分除了具有胶原产生促进效果外，还具有促进表皮细胞的透明质酸合成的效果、成纤维细胞增殖促进效果、皱纹改善效果。
因此，本发明所述的胶原产生促进剂也可以用作透明质酸产生促进剂、成纤维细胞增殖促进剂、抗皱剂。
本发明所述的胶原产生促进方法、透明质酸产生促进方法、成纤维细胞增殖促进方法、皱纹改善方法的特征在于，涂敷本发明的胶原产生促进剂、透明质酸产生促进剂、成纤维细胞增殖促进剂、抗皱剂。
上述促进方法或皱纹改善方法也可以涂敷包含本发明的促进剂或抗皱剂的皮肤外用组合物。
皮肤外用组合物的应用范围极广，可应用于各种领域(例如包括准药品在内的化妆品、医药品、利用微针的注入剂等)。其制品形态是任意的，可例举例如软膏、霜、乳液、化妆水、精华素、冻胶、凝胶、面膜(pack)、面膜(mask)、粉底、微针等。
制备皮肤外用组合物时，配合以液状成分计优选为0.0001 20质量％、更优选为0.001 2质量％的作为有效成分的促进剂或抗皱剂。
配合有本发明所述的促进剂或抗皱剂的皮肤外用组合物可以通过常规方法制造。皮肤外用组合物中除了作为必需成分的促进剂或抗皱剂以外，可以在不损害本发明的效果的范围内适当配合皮肤外用组合物中常用的任意成分。
作为皮肤外用组合物中可以配合的任意成分，可例举例如氨基酸、脂质、糖、激素、酶、核酸等生理活性物质等。
此外，也可以适当配合水(纯水、温泉水、深层水等)、油剂、表面活性剂、金属皂、凝胶化剂、粉体、醇类、水溶性高分子、皮膜形成剂、树脂、包合化合物、香料、除臭剂、盐类、PH调整剂、清凉剂、来源于动物或微生物的提取物、血液循环促进剂、收敛剂、抗皮脂溢剂、螯合剂、角质溶解剂、酶、激素类、维生素类、其它植物提取物等。
此外，也可以适当配合依地酸二钠、依地酸三钠、柠檬酸钠、聚磷酸钠、偏磷酸钠、葡糖酸等金属封闭剂，咖啡因、丹宁、维拉帕米、氨甲环酸及其衍生物、甘草提取物、光甘草定、火棘的果实的热水提取物、各种生药、乙酸生育酚、甘草酸及其衍生物或其盐等药剂，葡萄糖、果糖、阿洛酮糖、阿洛糖、塔格糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、木糖醇等糖类，β丙氨酸、甘氨酸、GABA、肌氨酸等离子 通道控制物质，肌肽、类视黄醇等。
此外，通过将本发明所述的促进剂或抗皱剂与一种或两种以上的其它药效剂组合配合，也能配制成各效果更好或者在起到各效果的同时也起到其它药效的皮肤外用组合物。
作为上述药效剂，可例举例如美白剂、紫外线防御剂、抗菌剂、抗炎症剂、血液循环促进剂、各种药效成分、活性氧除去剂、保湿剂、其它促进剂、其它抗皱剂等，但不限定于此。
配合有本发明所述的促进剂或抗皱剂的皮肤外用组合物的剂型只要能发挥本发明的效果即可，无特别限定。皮肤外用组合物的剂型是任意的，可例举例如溶液体系、可溶化体系、乳化体系、粉末分散体系、水-油双层体系、水-油-粉末三层体系、软膏、凝胶、气溶月父等。
此外，本发明所述的胶原产生促进方法、透明质酸产生促进方法、成纤维细胞增殖促进方法、皱纹改善方法也优选口服摄取本发明的胶原产生促进剂、透明质酸产生促进剂、成纤维细胞增殖促进剂、抗皱剂。
上述促进方法或皱纹改善方法也可以口服摄取包含本发明的促进剂或抗皱剂的饮食品。
将本发明的胶原产生促进剂、透明质酸产生促进剂、成纤维细胞增殖促进剂及抗皱剂配合于饮食品时，促进剂或抗皱剂的配合量(干燥质量)可以根据它们的种类、目的、形态、使用方法等来适当决定。例如，配合量在饮食品总量中优选为0.0001 50质量％左右。特别是配合于特定保健用食品时，优选以能充分发挥出效果的量配合本发明的促进剂或抗皱剂。
作为饮食品的形态，可以任意地成形为例如颗粒状、糊状、凝胶状、固体状、液体状坐寸ο
饮食品中可以适当含有已确认能配合于饮食品等中的公知的各种物质，例如粘合齐 、崩解剂、增稠剂、分散剂、重吸收促进剂、矫味剂、缓冲剂、表面活性剂、增溶剂、保存剂、乳化剂、等渗剂、稳定剂和pH调整剂等赋形剂。实施例
下面例举实施例对本发明进行更详细的描述，但本发明不受这些实施例的任何限定。如无特别记载，配合量以质量％表示。
首先，本发明人通过下述制备方法制备了柏科侧柏属植物(侧柏)种子的有机溶剂提取物及其处理物(A)。接着，针对提取物及其处理物的成纤维细胞增殖促进效果以及成纤维细胞的I型胶原产生促进效果，进行了如下所示的试验。
将不添加提取物及其处理物的情况设为100，结果示于表I。
侧柏种子的有机溶剂提取物的制备方法 将侧柏的种子(未粉碎)分别浸溃于5倍量(v/w)的有机溶剂(丙酮)，在室温下进行10天的提取。预先用尼龙网(100目)除去残渣，再用滤纸过滤。用旋转蒸发器从滤液中除去溶剂。由此得到提取物。
侧柏种子的有机溶剂提取物的处理物的制备方法A 一边用搅拌叶片搅拌如上所述得到的提取物，一边向提取物中添加0.5 15N的NaOH溶液，以纯NaOH计在100 300g/L的范围内(温度50°C )。一边以200rpm搅拌，一边进行5小时的处理。然后，缓慢添加5N的H2SO4, —边搅拌一边使pH降至I附近，回收分离出的液状(油状)物质。在回收的液状(油状)物质中添加等容量的水进行水洗，除去杂质、盐和过量的酸。将液状(油状)物质减压干燥，得到液状的处理物(A)。
<细胞活化试验> 将来源于人新生儿的成纤维细胞HFOK接种于含10%胎牛血清(FBS)的达尔伯克改良伊格尔MEM培养基(DMEM、日水公司(二 〃 ^ ^社)制)中，接着接种于24孔板，在37°C、二氧化碳浓度5体积％的气氛中静置。细胞贴壁后，将培养基换成含低浓度血清(0.5%)的培养基，继续培养一昼夜。然后，添加样本配制液并混合，使得提取物及其处理物相对于培养基达到 0、0.5 X 10' I X 10'2 X 10'3 X I(T4 体积 %。在培养第 3 天，用 Hoechst 33342 (同仁化学株式会社制)测定并求出在各样本配制液中生长发育的成纤维细胞的细胞数，以不添加提取物或其处理物的情况作为对照，评价细胞活化程度。
收集细胞培养 上清，评价I型胶原产生量。
〈I型胶原产生的测定> 关于收集的细胞培养上清中的I型胶原，使用I型前胶原C末端肽(Procollagen TypeI C-p印tide (PIP)) EIA试剂盒(宝公司(TAKARA社)制)，按照试剂盒附带的操作手册来测定培养基上清中的I型胶原C末端肽，作为I型胶原产生量的指标。以DNA量计，用Hoechst 33342求出每I个孔的细胞量，以每单位细胞的形式来评价在提取物或其处理物的作用下促进合成的I型胶原量。
[表 I]
权利要求
1.胶原产生促进剂，其特征在于，用有机溶剂提取属于柏科{Cupressaceae)侧柏属(Platycladus)的植物的种子，得到含有油性成分的提取物，将该提取物的溶剂的一部分或全部蒸馏除去后，添加浓度0.5 15N的碱水溶液并混合，接着进行酸处理后，进行水洗而得到。
2.透明质酸产生促进剂，其特征在于，用有机溶剂提取属于柏科iCupressaceae)侧柏属iPlatycladus)的植物的种子，得到含有油性成分的提取物，将该提取物的溶剂的一部分或全部蒸馏除去后，添加浓度0.5 15N的碱水溶液并混合，接着进行酸处理后，进行水洗而得到。
3.成纤维细胞增殖促进剂,其特征在于,用有机溶剂提取属于柏科{Cupressaceae)侧柏属iPlatycladus)的植物的种子，得到含有油性成分的提取物，将该提取物的溶剂的一部分或全部蒸馏除去后，添加浓度0.5 15N的碱水溶液并混合，接着进行酸处理后，进行水洗而得到。
4.抗皱剂，其特征在于，用有机溶剂提取属于柏科{Cupressaceae、侧柏属(Platycladus)的植物的种子，得到含有油性成分的提取物，将该提取物的溶剂的一部分或全部蒸馏除去后，添加浓度0.5 15N的碱水溶液并混合，接着进行酸处理后，进行水洗而得到。
5.权利要求1 4中任一项所述的促进剂或抗皱剂，其特征在于，添加的纯碱量为100 300g/L提取物。
6.权利要求1 5中任一项所述的促进剂或抗皱剂，其特征在于，属于柏科侧柏属的植物是侧柏(Platycladus oriental is)。
7.胶原产生促进方法，其特征在于，涂敷权利要求1所述的胶原产生促进剂。
8.透明质酸产生促进方法，其特征在于，涂敷权利要求2所述的透明质酸产生促进剂。
9.成纤维细胞增殖促进方法，其特征在于，涂敷权利要求3所述的成纤维细胞增殖促进剂。
10.皱纹改善方法，其特征在于，涂敷权利要求4所述的抗皱剂。
全文摘要
本发明提供提供胶原产生促进效果、透明质酸产生促进效果、成纤维细胞增殖促进效果和皱纹改善效果优异的植物种子的有机溶剂提取物的处理物。本发明的胶原产生促进剂的特征在于，用有机溶剂提取柏科(Cupressaceae)侧柏属(Platycladus)植物的种子，得到含有油性成分的提取物，将该提取物的溶剂的一部分或全部蒸馏除去后，添加浓度0.5～15N的碱水溶液并混合，接着进行酸处理后，进行水洗而得到。
文档编号A61P43/00GK103167865SQ201180052029
公开日2013年6月19日 申请日期2011年10月25日 优先权日2010年10月27日
发明者常长诚, 饭野雅人, 草苅健 申请人:株式会社资生堂