专利名称：一种检测热带假丝酵母菌的实时荧光定量pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测热带假丝酵母菌(热带念珠菌)的试剂盒，具体地说，涉及一种以实时荧光定量聚合酶链反应技术检测热带假丝酵母菌的试剂盒。
背景技术：
近年来，随着免疫受损人群(包括恶性肿瘤、血液病、艾滋病、SARS、糖尿病、自身免疫病、严重烧伤和创伤、长期吸毒者等)的不断扩大，广谱抗生素、皮质类固醇激素和免疫抑制剂在临床上广泛应用；器官移植、导管插管、介入治疗等新技术的普遍开展，使机会性真菌感染的发病率急剧上升，已经成为院内感染死亡的主要原因之一。美国国家医院感染监测中心(NNIS)资料显示，20世纪90年代住院患者深部真菌感染率为80年代的1. 9倍，其中念珠菌约占78. 3%。1995-2002年美国49所医院连续7年的监测资料表明，念珠菌败血症在医院感染败血症中居第4位，仅次于凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和肠球菌，病死率则居首位。国内尸检报告中，侵袭性真菌感染(IFI)患病率已由20世纪50年代初的0. 3% 上升至11. 3%，其中支气管、肺部真菌病占50%-60%。我国医院感染监控网1998-1999年的监测资料显示，在确诊为医院感染的患者中，真菌感染已占17. 1%。艾滋病患者病程中发生真菌感染的可能性为90%，是其主要的死亡原因之一。由于深部真菌感染初期症状不明显，临床表现缺乏特征性，早期诊断困难，导致抗真菌治疗的延迟。而真菌感染尤其是深部真菌感染时病情凶险，易贻误治疗时机，快速准确的诊断和鉴定对指导治疗用药十分重要，能显著提高机会性真菌感染患者的生存率。目前真菌感染的临床鉴定主要依赖于显微镜下孢子和菌丝的形态、培养的菌落特征以及生化结果，但这些传统的诊断方法通常周期长、敏感性差、阳性率低。作为金标准的组织病理学和深部组织培养由于其有创性而难于被患者接受。因此，如何提高真菌感染的早期、特异诊断水平是目前临床真菌学领域的研究热点，也是临床检验中要解决的关键问题。测定循环抗原与抗体的血清学方法，由于发生IFI的免疫受损宿主往往缺乏可检测到的抗体，或者抗体的产生变化较大，因此检测抗体对于诊断的意义不大。目前主要检测血液循环中的抗原，如甘露聚糖、(1，；3)-β-葡聚糖及D-/L-阿拉伯糖醇(DA/LA)等，但致病性真菌之间存在交叉抗原，导致血清学检查法难以获得满意结果。分子生物学方法在临床病原性真菌检测中的应用，为提高病原性真菌的检测灵敏度和特异性提供了良好的手段。常用的分子生物学方法有PCR、核酸探针、限制性酶切反应、PCR-RFLP, PCR-SSCP、基因芯片技术等。普通PCR易引起实验室污染，很少用于临床检验，通用引物PCR具有快速敏感的优势，但分离的特异性差，尤其不能对耐药菌株进行鉴定；核酸探针为增加特异性需要大量的探针，价格昂贵且耗时，不能用于常规实验室检查； PCR-SSCP、PCR-RFLP、基因芯片技术等敏感性和特异性都较好，但操作比较复杂、仪器设备要求高，多用于科研，目前均不宜用于临床检测。因此，寻找一种能快速、敏感和特异检测病原真菌的手段成为临床的迫切需求。
实时荧光定量PCR技术在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。避免了传统PCR以终产物检测定量产生的偏差，提高了实验的重复性。与常规PCR相比特异性更强，有效解决PCR产物污染，自动化程度高，敏感性通常达100拷贝/ ml，线性范围宽，重复性好，且检测时间短。 目前，实时荧光PCR已广泛应用，美国食品与药品管理局(FDA)已经批准了一些定量检测病原体的PCR诊断试剂盒，如用于HIV、结核分枝杆菌、沙眼衣原体等的实时荧光PCR检测的试剂盒。同样，中国目前也已批准了乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV和SARS等的实时荧光PCR检测试剂盒的生产和临床应用。在病原性真菌检测中的研究也有报道。在欧盟，基于定量PCR检测融合基因的一些诊断试剂盒已经通过CE认证。因此，开发一种能够检测热带假丝酵母菌的实时荧光定量PCR试剂盒，为临床提供新的快速早期诊断手段，以期发现更多的热带假丝酵母菌感染，采用更有效的治疗药物和方案，救治更多的患者；同时也可监测疗效，帮助临床评价治疗效果，并有效降低医疗成本。对IFI的诊断，治疗和预后具有重要意义。众所周知，在使用已知的实时荧光定量PCR技术检测和定量分析临床样品中某特定靶核酸的实践中，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高定量分析的准确性， 一个关键性的基本技术环节是如何基于已知的靶多核苷酸序列设计并制备适当的引物和寡核苷酸探针。本发明人在以往多年从事PCR技术特别是实时荧光定量PCR技术研究的基础上，开发相应的试剂盒应用于热带假丝酵母菌的检测和定量分析，成功地完成了本发明， 并通过了一定样本量的临床试用和评价。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用多重实时荧光聚合酶链式反应技术进行热带假丝酵母菌检测的试剂盒，利用本试剂盒可以准确鉴别并定量热带假丝酵母菌。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案
根据GENBANK上公布的核酸序列，寻找热带假丝酵母菌核酸序列的特异性保守区，并针对保守区设计靶核苷酸引物和探针。这些引物探针在DNA聚合酶、PCR反应酶以及PCR反应液中，通过荧光PCR仪实现体外核酸的循环扩增。本发明设计的热带假丝酵母菌特异性的正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1 所示。本发明设计的热带假丝酵母菌特异性的反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO 2 所示。本发明设计的热带假丝酵母菌的特异性探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示。 所述探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团ECLIPSE。一种检测热带假丝酵母菌的荧光定量PCR试剂盒，包括如下物质 PCR反应液、引物探针混合液、PCR反应酶、纯H2O和阳性定量标准品。所述PCR 反应液由 Tris-HCl (50mmol/L, ρΗ8· 0)、MgCl2 (8mmol/L)和 KCl (250mmol/L)组成。所述引物探针混合液中引物浓度均为0. 2mmol/L，探针浓度均为0. lmmol/L。
所述PCR反应酶由Hotstart Taq DNA聚合酶和dNTPs组成。Taq酶、dNTPs均可采用市售产品；如TaKaRa公司的产品，其中每人份PCR反应酶系中Hotstart Taq DNA聚合酶的用量为5U，dNTPs用量为lOmmol/L。所述阳性定量标准品为含有序列为SEQ ID N0:4的DNA片段的pMD19-T重组质粒。所述的阳性定量标准品的制备方法由以下步骤组成
(1)以提取的光滑假丝酵母菌DNA为模板，用序列为SEQN0.5和SEQ NO. 6的引物扩增出序列为SEQ NO. 4的DNA片段，扩增程序为95°C 15分钟；94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 30秒，35个循环，最后一步为72°C 7分钟；
(2)回收并纯化扩增所得的DNA片段SEQNO. 4 ；
(3)将DNA片段SEQN0. 4插入到pMD19_T，即可。在上述检测热带假丝酵母菌的荧光定量PCR试剂盒中，还可以添加阴性质控品和阳性质控品。所述阴性质控品为生理盐水，所述阳性质控品为灭活的热带假丝酵母菌菌液， 菌液浓度为5. OX 10，5. OX IO6拷贝/mL。试剂盒中进行待检标本检测可同时进行两种质控品的检测，仅当阳性质控品检测时FAM通道荧光信号呈阳性，阴性质控品检测FAM通道荧光信号均呈阴性时，待检标本的检测结果才有效。上述检测热带假丝酵母菌的荧光定量PCR试剂盒的PCR扩增的条件为95°C 15 分钟；94°C 15秒，58°C 45秒，40个循环(58°C时收集荧光信号)。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果(1)对热带假丝酵母菌核酸扩增水平进行检测，可反映出患者体内热带假丝酵母菌感染的状态，可用于真菌感染的监测和防治，有助于疾病的早期诊断和治疗；(2)实时荧光PCR技术针对热带假丝酵母菌核酸特异性序列设计引物、探针，具有较高通量，操作简便、相对降低成本的优点，更适用于大多数患者检测。(3)本发明的试剂盒扩增待检标本由市售的荧光定量PCR仪自动完成，操作简单，耗时少，且最大限度地减少了污染的发生。检测结果可用于热带假丝酵母菌检测、辅助临床诊断及常规监测等多个领域研究。
图1为试剂盒阴性质控品的扩增曲线。图中没有S型扩增曲线，说明FAM通道荧光信号均呈阴性。图2为试剂盒阳性质控品的扩增曲线。图中FAM通道的扩增曲线为S型，说明该通道的荧光信号呈阳性。图3为阳性定量标准品的荧光定量PCR的标准曲线图。图4为3例阴性样本的扩增曲线。图中没有S型扩增曲线，说明检测样本中无热带假丝酵母菌核酸。图5为3例标本(血液、痰液、肺泡灌洗液)样本的扩增曲线。图中FAM通道的扩增曲线为S型，说明该样本有热带假丝酵母菌核酸的扩增，表示样本中存在热带假丝酵母菌。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1热带假丝酵母菌检测试剂盒及其使用
1、制备包括下列组成成分的试剂盒引物探针混合液(25μ 1/管)1管，PCR反应液 (250 μ 1/管)1管，PCR反应酶系(75 μ 1/管)1管，阳性质控品(200 μ 1/管)1管，阴性质控品(200 μ 1/管)1管，纯H2O (2000μ 1/管)1管。阳性定量标准品4管(IO7拷贝/ml、IO6 拷贝 /ml、IO5 拷贝 /ml、IO4 拷贝 /ml)。2、标本的采集、保存和运输
2.1标本类型血液、痰液、肺泡灌洗液等。2. 2标本采集、保存和运送取200ul的血液、痰液、肺泡灌洗液等置于无菌离心管中，贴好标签，置冰壶内携至实验室或低温(_20°C _70°C)冻存。标本长途运送采用干冰。3、核酸提取
可采用市售的DNA提取试剂盒，建议使用TaKaRaW hast DNAiso Kit提取试剂盒，并按照试剂盒的说明书进行操作，最后收集约50 μ 1 DNA溶液，直接进行检测或保存于-20°C4、实时实时荧光定量PCR扩增及检测
4. 1试剂准备按比例取相应量的引物探针混合液、PCR反应液、PCR反应酶系(引物探针混合液 μ /人份+ PCR反应液 ομ /人份+ PCR酶系3μ1/人份+纯H2O 16μ1/人份)， 充分混勻后按30μ1/管分装成PCR反应管，备用。4.2加样向PCR反应管中，分别加入提取后的阴、阳性质控品、样本DNA溶液 20 μ 1，同时加入4管阳性定量标准品，盖紧管盖，放入仪器样品槽。4. 3 编辑(ABI Prism 7500 荧光定量 PCR 仪)
打开ktup窗口，按对应顺序设置阴、阳性质控品和待测标本，并在Name栏中设置样品名称。选中所有设置样品孔，双击，选择Add Detector，选择Importer为FAM和Quencher 为 ECLIPSE，在 Passive Reference 中选择(none)。打开 instrument 窗口设置循环条件 950C 15分钟；94°C 15秒，58°C 45秒，40个循环。所有设置完成后保存文件，运行。4. 4结果分析及判断
反应结束后保存检测数据文件。在Results下打开Amp plot窗口。选择分析的目的样品所在位置。将Baseline数值改为start :3，stop :10，并打开manual设定Threshold 1.5 士 100000。双击 Rn 坐标上数值打开 Graph settings 窗口，将 Post Run kttings 中 Log 改为 Linear, OK 后打开 Analysis preferences 窗□,在 Analysis 菜单下选择 Analyze 自动分析结果。结果判断C (t)值小于35. 0为阳性；大于35. 0且无典型扩增曲线者为阴性；若 C (t)值小于35.0且有典型扩增曲线者重做，重做结果出现C (t)值和典型扩增曲线者判为阳性，否则为阴性。起始模板拷贝数则根据标准曲线和所得的C (t)值计算。实施例2应用热带假丝酵母菌检测试剂盒检测临床样品
选取3例经过培养方法鉴定为热带假丝酵母菌阴性，3例经过培养方法鉴定为热带假丝酵母菌阳性的标本，标本的核酸提取，PCR扩增及结果分析步骤参照实施例1进行， 同时进行阴、阳性质控品的检测。检测结果阴性质控品的扩增曲线不呈S型(见图1)，阳性质控品的扩增曲线为明
6显S型曲线(见图2)，阴、阳性质控品均符合试剂盒的质控要求；仪器根据阳性定量标准品绘制的标准曲线(见图3)线性关系好，提示扩增效率一致，因此待检标本的检测结果是有效的。由待检标本的检测结果可知本试剂盒能特异地检测到相应热带假丝酵母菌核酸的扩增 (见图5)，无热带假丝酵母菌核酸的标本无扩增曲线(见图4)。 本次试验中6例标本的检测结果与培养鉴定结果完全吻合，说明利用本试剂盒检测及热带假丝酵母菌是可行的。本试剂盒操作简便，检测时间短，可实现高通量检测，加之其价格低廉，有望应用于热带假丝酵母菌的临床检测。
权利要求
1.一种用于检测热带假丝酵母菌特异性的正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示
2.一种用于检测热带假丝酵母菌特异性的反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示
3.一种用于检测热带假丝酵母菌的特异性探针，其核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。
4.如权利要求3所述的特异性探针，其特征在于所述探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团ECLIPSE。
5.一种检测热带假丝酵母菌的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于包括如下物质 PCR反应液、引物探针混合液、PCR反应酶、纯H20、阳性定量标准品。
6.如权利要求5所述的检测热带假丝酵母菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于所述 PCR 反应液由 Tris-HCl (50mmol/L, ρΗ8· 0)、MgCl2 (8mmol/L)和 KCl (250mmol/L)组成。
7.如权利要求5所述的检测热带假丝酵母菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于所述引物探针混合液中引物浓度均为0. 2mmol/L，探针浓度均为0. lmmol/L。
8.如权利要求5所述的检测热带假丝酵母菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于所述 PCR反应酶由Hotstart Taq DNA聚合酶和dNIPs组成，其中每人份PCR反应酶系中Hotstart Taq DNA聚合酶的用量为5U，dNTPs用量为10mmol/L。
9.如权利要求5所述的检测热带假丝酵母菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于还含有阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品为生理盐水，所述阳性质控品为灭活的热带假丝酵母菌菌液，菌液浓度为5. OX 10，5. OX IO6拷贝/mL。
10.如权利要求5所述的检测热带假丝酵母菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于所述阳性定量标准品为含有序列为SEQ ID NO 4的DNA片段的pMD19_T重组质粒。
全文摘要
本发明公开了一种检测热带假丝酵母菌的实时荧光定量PCR试剂盒，包括如下物质PCR反应液、引物探针混合液、PCR反应酶、纯H2O、阳性定量标准品。用于检测热带假丝酵母菌核酸扩增水平，可反映患者体内热带假丝酵母菌感染的状态，可用于真菌感染的监测和防治，有助于疾病的早期诊断和治疗；实时荧光定量PCR技术针对热带假丝酵母菌核酸特异性序列设计引物、探针，特异性强，灵敏度高，且具有较高通量，操作简便、相对降低成本的优点，适用于大多数患者多种标本的检测。本发明的试剂盒扩增待检标本由市售的实时荧光定量PCR仪完成，操作简单，耗时少，且最大限度地减少了污染的发生。
文档编号C12R1/74GK102181566SQ201110122510
公开日2011年9月14日 申请日期2011年5月12日 优先权日2011年5月12日
发明者王前, 郑磊, 龙燕 申请人:南方医科大学