专利名称：一种抑制人乙型肝炎病毒感染的短肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种能抑制人乙型肝炎病毒感染细胞的短肽，以及该短肽在制备治疗人乙型肝炎病毒感染或乙型肝炎药物中的应用。
背景技术：
中国是人乙型肝炎病毒(简称乙肝病毒)感染的高危区，人口的8%以上为乙肝病毒携带者，由乙肝病毒感染引起的慢性乙型肝炎易发展为肝硬化和肝癌。目前，慢性乙型肝炎的治疗药物仅有干扰素和核苷(酸)类似物。前者治疗应答率仅为30%左右,且 副作用大；后者为乙肝病毒聚合酶抑制剂，患者须接受长期的抗病毒药物治疗，常出现严重的耐药性。由于现有的抗病毒药物作用靶点单一，一旦乙肝病毒对某种药物产生耐药性，极易造成对其他药物的交叉耐药性。因此需要寻找更多的抗乙肝病毒感染的药物靶点并研发相关新药。乙肝病毒入侵肝细胞始于病毒附着于肝细胞表面，起关键作用的是乙肝病毒颗粒包膜上的大表面蛋白的PreSl区。preSl全长108或119氨基酸(D基因型为108氨基酸，其余基因型为119氨基酸)，与乙肝病毒感染性有密切关系的区段主要在preSl的氨基末端，核心位于残基21-47(D基因型为10-36)，针对该位点的抗体能阻断乙肝病毒附着于肝细胞表面，抑制病毒感染。此外，PreSl氨基末端甘氨酸的豆蘧酰化能够显著地提高乙肝病毒的感染性。根据以上研究结果，Urban等利用豆蘧酰化的preSl肽(D基因型preSl的2_48)可以竞争性地阻断乙肝病毒感染人肝细胞。体外研究乙肝病毒感染机制和抗乙肝病毒感染药物需要利用能被乙肝病毒感染的细胞培养体系。目前国际公认的研究乙肝病毒体外感染的细胞培养体系包括人原代培养肝细胞、人肝癌细胞株IfepaRG以及树駒原代培养肝细胞。
发明内容
本发明的目的是提供一种抑制乙肝病毒感染肝细胞的短肽。本发明的另一个目的是提供上述短肽在制备治疗乙肝病毒感染或乙型肝炎的药物中的应用。在本发明中，基于噬菌体肽库筛选得到了结合乙肝病毒大表面蛋白preSl区的短肽，证明该短肽结合于preSl的13-59(D基因型preSl的2_48)，并证明该短肽能有效地阻断乙肝病毒结合人肝癌细胞株IfepG2以及抑制乙肝病毒感染树駒原代培养肝细胞，从而显示了该短肽在治疗乙肝病毒感染或乙型肝炎中的应用前景，完成了本发明。本发明第一方面提供了一种合成或表达的短肽，所述短肽包含以下氨基酸序列之
DN-亮氨酸-精氨酸-天冬酰胺-异亮氨酸-精氨酸-C (Leu-Arg-Asn-Ile-Arg,L-R-N-I-R)。2)1)中所示氨基酸序列中有1-2个氨基酸缺失且能抑制乙肝病毒感染的氨基酸序列。3)1)中所示氨基酸序列中有1-2个氨基酸被替代且能抑制乙肝病毒感染的氨基酸序列。4)1)中所示氨基酸序列中有I个或多个氨基酸插入且能抑制乙肝病毒感染的氨基酸序列。5)1)-4)中所示氨基酸序列重复拼接且能抑制乙肝病毒感染的氨基酸序列。本发明所述的短肽的氨基酸序列可以是I)所示氨基酸序列，或者I)所示氨基酸序列的重复拼接。所述的重复拼接可以采用氨基酸残基GSG衔接各氨基酸序列单位。本发明的实施例中列举了的短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO I、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3或者SEQ ID NO 4所示。
本发明还提供了含有所述的短肽的构建物或者细胞。编码所述的短肽的核酸序列，含有所述的核酸序列的构建物或者细胞。本发明还提供了所述的短肽的制备方法，比如，按照其氨基酸序列人工合成。所述短肽对应的核酸分子也可以利用人工合成的方法，按照其核苷酸编码序列进行制备。另一方面，本发明提供了所述的短肽在制备治疗人乙型肝炎病毒感染或乙型肝炎的药物中的用途。例如制备一种用于治疗人乙型肝炎病毒或乙型肝炎的药物，所述药物包含上述的短肽，以及药学上可接受的载体。利用本发明提供的短肽，能有效地阻断乙肝病毒感染肝细胞，从而为治疗乙肝病毒感染或乙型肝炎提供了一种新的思路和方法。本发明的能够结合preSl的短肽，利用树駒原代培养肝细胞体系对该短肽抑制乙肝病毒感染的活性进行了验证。本发明中，术语“缺失”指的是本发明所述的短肽序列(Leu-Arg-Asn-IIe-Arg)中缺少1-2个氨基酸，且仍能抑制乙肝病毒感染的氨基酸序列。本发明中，术语“插入”指的是本发明所述的短肽序列(Leu-Arg-Asn-Ile-Arg)中插入I个或多个氨基酸，且仍能抑制乙肝病毒感染的氨基酸序列。本发明中，术语“替代”指的是本发明所述的短肽序列(Leu-Arg-Asn-Ile-Arg)中1-2个氨基酸被其它氨基酸取代，且仍能抑制乙肝病毒感染的氨基酸序列。本发明中，术语“重复拼接”指的是两个以上本发明所述的短肽序列的连接，包括直接连接和通过间隔序列连接，且仍能抑制乙肝病毒感染的氨基酸序列。本发明中，术语“合成”指的是本发明所述的短肽可以氨基酸为原料，由多肽合成仪器或人工生成。本发明中，术语“表达”指的是本发明所述的短肽可以通过将编码该短肽氨基酸序列的核苷酸序列置于表达载体中，进而在原核细胞或真核细胞中表达出该短肽。编码短肽氨基酸序列的核苷酸片段通常可以用人工合成的方法获得。一旦获得了有关序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其插入克隆载体或表达载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。上述的“克隆载体”和“表达载体”指本领域熟知的原核或真核质粒。通常包含一个或多个选择性标记基因，以用于选择转化或转染的宿主细胞的表型，如大肠杆菌使用的四环素或氨苄青霉素抗性、真核细胞使用的新霉素抗性等。在本发明中，使用本领域的技术人员熟知的方法将包含本发明的编码短肽氨基酸序列的核苷酸序列插入到载体中。这些方法包括但不限于体外重组DNA技术、体内重组技术等(Sambrook, et al. Molecular Cloning,a Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory. New York, 1989)。上述表达质粒可用于转化或转染适当的原核细胞或真核细胞，以使其能够转录出编码短肽的核苷酸片段。宿主细胞如大肠杆菌DE3、哺乳动物293细胞等。可采用的转化、转染方法包括但并不限于磷酸钙共沉淀法、显微注射、电穿孔、脂质体介导等。如果需要，可利用短肽物理的、化学的和其它特性通过各种方法分离和纯化表达产物。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于分离电泳、层析等。本发明还涉及短肽在制备治疗乙肝病毒感染或乙型肝炎药物中的用途，包括但不限于将其与药学上可接受的物质混合包括糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚 乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween ;润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；磷酸盐缓冲液等。本发明提供了一种具有抑制人乙型肝炎病毒感染细胞功能的短肽，还包括该短肽的氨基酸序列、核苷酸编码序列、构建物和细胞及其应用。所述短肽特异地结合乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白的前表面抗原I区的残基13-59，所述短肽能抑制人乙型肝炎病毒感染细胞。本发明的短肽针对较新的靶点，抑制效率高，特异性好，显示出该短肽在制备治疗人乙型肝炎病毒感染或乙型肝炎的药物和制剂中的良好应用前景。
图I :短肽能够结合preSl13_59。A :含有单个特征序列(Leu-Arg-Asn-Ile-Arg)的短肽STll-I能结合preSl13_59 ;含有三个重复特征序列(Leu-Arg-Asn-His-Arg)的短肽ST27-I与preSl13_59的结合能力为STll-I的近I. 8倍。其中，ST27-I中三个特征序列通过Gly-Ser-Gly序列间隔。图2 :短肽在树駒肝细胞模型中抑制乙肝病毒表面抗原的表达。肽的序列见表1， 1*必113_59含耶￥的受体结合位点，CP为特征序列内2/4/5位氨基酸突变为丙氨酸的突变肽，所用肽的浓度均为O. 05uM。Neg Ctrl和Pos Ctrl分别为HBsAg检测试剂盒(科华公司)中自带的阴性和阳性对照。HBV/DMS0和HBV/wo DMSO分别表示在HBV感染树駒肝细胞体系中加入用于溶解小肽的溶剂二甲基亚砜(DMSO)和不加入DMS0。实验中所使用的HBV颗粒数量均为lxlO6。图3 :短肽在树駒肝细胞模型中能够抑制乙肝病毒e抗原的表达。肽的序列见表l，preSl13_59含HBV的受体结合位点，CP为特征序列内2/4/5位氨基酸突变为丙氨酸的突变肽，所用肽的浓度均为O. 05uM。Neg Ctrl为HBeAg检测试剂盒(科华公司)中自带的阴性对照。HBV/DMS0和HBV/wo DMSO分别表示在HBV感染树駒肝细胞体系中加入用于溶解小肽的溶剂二甲基亚砜(DMSO)和不加入DMS0。实验中所使用的HBV颗粒数量均为lxlO6。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所熟知的。这些技术在下列文献中有完整的描述例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989);《蛋白质纯化原理和实践》第2版(Springer-Verlag，N. Y.)，以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D. C. Weir和C. C.Blackwell编辑1986)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。表I、本发明实施例所涉及的短肽序列
名称__序列(H，今Cf )_
STll-ISGSG LRMIR SI (SM ID NO I)
STl5-1LRMIR LRHIR LRMIR (SEQ ID MO 2) ST20-ILRNIR LRMIR LRNIR LRMR (SEQ ID NO 3)
ST27-I__SGSG LRMR GSG LRHIR GSG LRMIR ST (SEQ ID MO 4)
preSl U-B, Ciriyr) -GIlC SVHiPLGFFPDHQLDP AFGANSiJNPDWDFNP NKDfflPE删3VG (SEQ ID NO 5)
CF (对雜)SGSG LANAA GSG LANAA GSG LAHAA ST (SEQ ID NO 6)
注这些短肽含有的特征氨基酸序列以下划线标示。表2氨基酸的缩写符号
名称I三字符号I单
丙氨酸 Ala A_
M氨酸G~g R
天冬氨酸 Asp_D_
半胱 €1~ Cys~C
谷氨酰胺Gln_Q_
谷氨酸 Glu/Gln E_
组氨酸His ~
异亮氨酸TTeI
甘氨酸 Gly_G_
天冬酰胺 Asn_N_
亮氨酸[eu L~
赖氨酸 LysK_
甲硫氨酸Met_M_
苯丙氨酸 Phe_F_
1甫氨酸P
丝氨酸 SerS_
丽酸Thr ~T
色氨酸 Trp_W_
酪氨酸 Tyr_Y_
缴氨酸|val |v
实施例I :短肽能够结合preSl13_59。Biotin偶联的短肽结合在包被Streptavidin的96孔板上，每孔加入50ug Biotin偶联的短肽，IOOul PBS中4° C结合4小时。轻拍去PBS，PBS润洗一遍。重新加入IOOulPBS,并加入50ug豆蘧酰化的preSl13_59，4° C结合8 — 12小时。轻拍去PBS, PBS润洗一遍。加入200ul含O. 1% BSA的PBS，37° C结合I小时，PBST洗涤一遍，每次5秒。然后加入IOOul抗preSl单抗(I : 1000，含O. 1% BSA的PBS稀释)，4° C结合4小时，之后PBST洗涤三遍，每次5秒。加入IOOul兔抗鼠二抗(I :1000，含O. 1% BSA的PBS稀释)，4度结合2小时，之后PBST洗涤三遍，每次5秒。最后每孔加入IOOul TMB (预混合过氧化氢)，避光显色45分钟，每孔加终止液50ul终止反应，酶标仪0D450读数。如图I所示，含有特征序列三联体的短肽比仅含特征序列单体的短肽有更好的结合preSl13_59的能力。因此，后续的抑制乙肝病毒感染的研究采用含特征序列三联体或四联体的短肽进行。实施例2 :短肽在树駒原代肝细胞模型中能够抑制乙肝病毒的感染 2. I树駒原代肝细胞的培养
树駒购自中国科学院昆明动物研究所实验动物中心。树駒原代肝细胞采用两步灌注法分离。选取成年树駒，体重160-200克。饲养5-7天后，术前12小时禁食。麻醉每只肌肉 注射盐酸氯胺酮5mg/100g体重,加甲苯噻嗪lmg/100g体重。灌注固定树關于支架上,打开腹腔，暴露门静脉，插入导管，开始灌注42° C预热的Hanks ^IhmM EGTA，1%葡萄糖，50 u/ml 氨苄，100 μ g/ml 链霉素，IOOmM L-谷氨酰胺，15mM HEPES, pH7. 4),20 ml/分钟，灌注5分钟。接着灌注Hanks液II (Hanks液I加O. 5 mg/ml II型胶原酶)，消化15分
钟。分离肝细胞将肝脏转移到无菌培养皿中，分散肝细胞，筛网过滤，收集滤过的细胞，用室温Williams培养基洗两遍，离心收集细胞，细胞沉淀用Williams培养基重悬。培养细胞接种到胶原预包被的6孔板(或48孔板)中，每孔约I X IO6细胞，37° C，5% 二氧化碳培养，6小时后换H印ato-SHM培养基，同时添加DMSO至终浓度2% (Glebe & Urban, Viraland cellular determinants involved in hepadnaviral entry. World J Gastroenterol2007，13(1) : 22-38)，之后每24小时换液。2.2制备乙肝病毒
收集AD38细胞(该细胞能够持续产生和分泌乙肝病毒)培养上清，用PEG8000 (配制在25 mM Tris-HCl pH7. 5中，终浓度10%)在4° C下沉淀培养液中的乙肝病毒颗粒，在16，000g下离心30分钟收集病毒颗粒，将病毒颗粒重悬在含有10 mM MgCl2的50 mM Tris-HClpH7. 5中。实时定量PCR定量。2. 3酶联免疫法测定乙肝病毒抗原的表达
树駒肝细胞培养8小时后，在培养基中加入40 mg/ml PEG，同时每孔加入I x IO6乙肝病毒，在实验组细胞每孔中分别加入终浓度为0. 05μΜ的短肽(ST15-I、ST20-I或ST-27-I)，阳性对照组只加乙肝病毒和/或溶剂DMS0，阴性对照组不加乙肝病毒，对照肽组加入0.05μΜ的CP对照肽。37° C，5% 二氧化碳培养。每24小时换液一次，收集每次换液上清用于ELISA检测乙肝病毒e抗原和表面抗原，共收集7天。乙肝病毒e抗原与表面抗原检测使用科华乙型肝炎e抗原诊断试剂盒及乙型肝炎表面抗原诊断试剂盒。测定方法遵照厂商的说明书进行，操作如下酶标版设阴性、阳性对照各两孔，每孔加入阴性对照或阳性对照各50 μ 1，并设空白对照I孔，实验组每孔加入待测标本50μ1。每孔加入酶结合物50μ I (空白对照除外)，充分混匀，封板，置37° C孵育30分钟。弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复5次后拍干。每孔加显色剂A液、B液各50 μ I，充分混匀，封板，置37° C孵育15分钟。每孔加入终止液50 μ I，混匀。用酶标仪读数(波长450nm)。结果(图2、图3)显示，含有特征序列的短肽ST15-I、ST20-I或ST_27_I均能有效降低乙肝病毒e抗原和表面抗原的表达，显示其具有较强的抑制乙肝病毒感染树駒肝细胞的能力。
综合上述，本发明的短肽可以结合乙肝病毒preSl13_59，并有效抑制乙肝病毒感染肝细胞，显示该短肽成为治疗乙肝病毒感染或乙型肝炎的应用前景。
权利要求
1.一种合成或表达的短肽，其特征在于，所述短肽包含以下氨基酸序列中的任意一种 N-亮氨酸-精氨酸-天冬酰胺-异亮氨酸-精氨酸-C ； I)中所示氨基酸序列中有1-2个氨基酸缺失且能抑制人乙型肝炎病毒感染的氨基酸序列； I)中所示氨基酸序列中有1-2个氨基酸被替代且能抑制人乙型肝炎病毒感染的氨基酸序列； I)中所示氨基酸序列中有I个或多个氨基酸插入且能抑制人乙型肝炎病毒感染的氨基酸序列； I) 一 4)中所示氨基酸序列重复拼接且能抑制人乙型肝炎病毒感染的氨基酸序列。
2.如权利要求I所述的短肽，其特征在于，所述的短肽的氨基酸序列是I)所示氨基酸序列，或者I)所示氨基酸序列的重复拼接。
3.如权利要求I或者2所述的短肽，其特征在于，所述的重复拼接采用氨基酸GSG衔接权利要求I中I)的氨基酸序列。
4.如权利要求I所述的短肽，其特征在于，所述的短肽的氨基酸序列如SEQID NO I、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3 或者 SEQ ID NO 4 所示。
5.含有权利要求I所述的短肽的构建物或者细胞。
6.编码权利要求I所述的短肽的核酸序列。
7.含有权利要求6所述的核酸序列的构建物或者细胞。
8.—种权利要求I所述的短肽的制备方法，其特征在于，该短肽是按照其氨基酸序列人工合成的。
9.权利要求I所述的短肽在制备治疗人乙型肝炎病毒感染或乙型肝炎的药物中的用途。
10.一种用于治疗人乙型肝炎病毒或乙型肝炎的药物，其特征在于，所述的药物包含权利要求I所述的短肽，以及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，涉及一种能抑制人乙型肝炎病毒感染细胞的短肽，该短肽包含以下氨基酸序列中的任意一种1)N-亮氨酸-精氨酸-天冬酰胺-异亮氨酸-精氨酸-C；2)1)中所示氨基酸序列中有1-2个氨基酸缺失且能抑制人乙型肝炎病毒感染的氨基酸序列；3)1)中所示氨基酸序列中有1-2个氨基酸被替代且能抑制人乙型肝炎病毒感染的氨基酸序列；4)1)中所示氨基酸序列中有1个或多个氨基酸插入且能抑制人乙型肝炎病毒感染的氨基酸序列；5)1)－4)中所示氨基酸序列重复拼接且能抑制人乙型肝炎病毒感染的氨基酸序列。本发明还提供了包括该短肽的氨基酸序列或者核酸编码序列的构建物和细胞及其应用。
文档编号C12N15/63GK102775470SQ20111012251
公开日2012年11月14日 申请日期2011年5月12日 优先权日2011年5月12日
发明者何永刚, 刘晶, 周佳海, 汪垣, 董琦蕾, 谢幼华, 邓强 申请人:复旦大学