专利名称：基于基因沉默技术的灰飞虱致死基因片段Ribosomal protein L9-B及其dsRNA的制作方法
技术领域：
本发 明属于农业生物技术领域，涉及基于基因沉默技术的灰飞虱致死基因片段 Ribosomal protein L9-B 及其 dsRNA。
背景技术：
在我国，化学药剂连续单一长期使用已导致灰飞虱对多种农药产生了不同程度的抗性，需要不断加大农药使用量才能达到满意的防治效果，造成了更为严重的环境污染，形成恶性循环。另外灰飞虱传播条纹病毒引起的水稻条纹叶枯病，发病后药剂控制效果较差， 只能依靠治虫防病。因此，在农业生产实践中，急需化学农药之外的替代防治手段。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种由双链RNA介导的基因沉默现象，双链RNA最终被加工大小约为22nt的小RNA (siRNA)，通过序列配对的方式与蛋白编码基因结合，根据序列配对的程度降解靶标基因mRNA或抑制基因的蛋白翻译过程。RNAi广泛地存在于真菌、植物和动物中。2006年Andre Fire和Craig Mello因发现RNAi现象被授予诺贝尔医学与生理奖。在生物体中，一些重要的基因对维持生命是必须的。因此，从理论上而言，如果利用RNA干扰技术将农业害虫中重要基因的表达进行干扰，则会引起害虫的致畸或致死，从而达到控制害虫的目的。本专利发明就是利用实验室改进的dsRNA喂食法从灰飞虱中筛选出经干扰后能够导致灰飞虱死亡的重要基因，为建立利用RNA干扰技术控制害虫的新策略提供序列和数据基础。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种灰飞虱致死基因片段 Ribosomal protein L9-B 及其克隆方法。本发明的另一方法是提供该致死基因片段Ribosomal protein L9-B的dsRNA及其合成方法。本发明的又一目的是提供一种用于筛选致死基因的dsRNA喂食法。本发明的目的可通过如下技术方案实现灰飞虱致死基因片段Ribosomal protein L9-B，序列如SEQ ID NO. 1所示。所述的灰飞虱致死基因片段Ribosomal protein L9-B的克隆方法，包括如下步骤(1)取灰飞虱，提取总RNA，以提取的灰飞虱总RNA合成cDNA第一条链；(2)以步骤(1)合成的灰飞虱cDNA第一条链为模板，以序列为SEQ ID N0. 2的上游引物P1、序列为SEQ ID N0. 3的下游引物P2，进行RT-PCR扩增；(3) PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标DNA片段；(4)将回收的目标DNA片段在T3连接酶作用下插入至pEASY_T3载体中，转化到大肠杆菌Tl，涂于含有x-gal、IPTG以及氨苄青霉素的LB培养基，37°C培养，过夜；(5)通过挑选白色单菌落，筛选阳性重组子；(6)用含氨苄青霉素的LB培养液将重组子扩增，提取克隆质粒；(7)全自动序列仪进行测序，得到SEQ ID NO. 1所示的Ribosomal protein L9-B 基因片段。其中，所述的RT-PCR扩增体系为反应缓冲液5μ L，Mg2+4y L，dNTP 4μ L，cDNA模板 2yL，上游引物 Pl lyL，下游引物 P2 1 μ L，R-Tag 酶 0. 5 μ L，ddH20 32. 5 μ L，共 50 μ L。灰飞虱致死基因片段Ribosomal protein L9-B的dsRNA，序列如SEQ ID NO. 4所
不。 所述的灰飞虱致死基因片段Ribosomal protein L9-B的dsRNA的合成方法，是以灰飞虱cDNA第一条链为模板，以序列为SEQ ID N0. 5的上游引物P3、序列为SEQ ID N0. 6 的下游引物P4，PCR扩增得到灰飞虱致死基因片段Ribosomal protein L9-B的dsRNA。所述的灰飞虱致死基因片段Ribosomal protein L9-B的dsRNA的合成方法优选包含如下步骤(1)根据已经验证的Ribosomal protein L9-B基因片段序列，设计并合成序列为SEQ ID N0. 5的引物3和序列为SEQ ID N0. 6的引物4，以灰飞虱cDNA第一条链为模板 PCR扩增得到灰飞虱致死基因片段Ribosomal protein L9-B的dsRNA，PCR体系为反应缓冲液 5 μ L，Mg2+4 μ L，dNTP 4 μ L，cDNA 模板 2 μ L ；上游引物 Ρ3 2 μ L，下游引物 P4 2 μ L， ExTap 酶 0· 25 μ L, ddH20 30. 75 μ L，共 50 μ L ；PCR 反应程序为94°C变性 2min，94°C 30sec, 55-62°C 30sec,72°C 30sec，38 个循环，72°C延伸；(2)PCR产物经浓度为的低熔点琼脂糖凝胶电泳分离；(3)回收目标DNA产物。一种灰飞虱的dsRNA喂食方法，包含如下步骤(1)将玻璃管的一端封好，用吸虫器吸取二龄的灰飞虱加入玻璃管内，用纱布将玻
璃管另一端封好；(2)将虫子拍打至玻璃管封口端，将另一端的纱布取下，将已经准备好的封口膜， 贴纸的一面朝上，盖到玻璃管管口上，将管竖立放置；(3)用移液枪吸取含dsRNA的饲料滴在膜的中央，用一个新的封口膜，贴纸的一面朝下，贴在玻璃管管口上，将饲料和dsRNA封在两层封口膜之间；(4)将加好饲料和dsRNA的玻璃管放回养虫室的养虫架上，房间温度为26°C，利用灰飞虱的趋光习性仅在饲料端给予光照，使其趋食饲料，每24h换一次含dsRNA的饲料。所述的dsRNA为所述的灰飞虱致死基因片段Ribosomal protein L9-B的dsRNA。有益效果利用RNAi技术沉默Ribosomal protein L9-B基因，对灰飞虱具有明显的致死效果，说明该基因可作为利用RNA干扰技术控制害虫的有效靶点。本发明合成的Ribosomal protein L9-B 基因 dsRNA 能有效沉默 Ribosomal protein L9-B基因更好地抵抗RNA酶的降解，同时合成成本较低，便于大量实验使用。本发明采用喂食法进行RNAi干扰实验，相对注射法，减少了虫体的机械损伤，更加便于实验操作。最终通过喂食实验验证了 Ribosomal protein L9-B基因的RNAi对灰飞虱具有致死效果，为建立利用RNA干扰技术控制害虫的新策略提供新的实验手段。
图 IdsRNA 合成电泳图，泳道 IMarker,泳道 2 =Ribosomal protein L9-B 的 dsRNA。 图2dsRNA喂食实验致死率统计图。
具体实施例方式实施例11. Ribosomal protein L9-B 基因片段的克隆方法(1)取灰飞虱10-20头，用TRIzoI法提取总RNA ；(2)合成cDNA第一条链；(3)从灰飞虱转录组中获取基因片段序列，在http://www.ncbi. nlm.nih.gov/进行同源性比对之后，预测为灰飞虱Ribosomal protein L9-B基因，利用Primer premier 5. O软件设计P 1和P 2，以RT-PCR方法进行扩增；上游引物(Pl)5' TTCTAGCGAGTTTCCG 3' (SEQ ID NO. 2)，下游引物(P2)5' GCGATGCCCAGTATGT 3' (SEQ ID NO. 3)；PCR 反应程序为94°C变性 2min，94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 30sec，35 个循环， 72°C延伸。PCR 反应体系(50 μ L)
反应缓冲液
Mg2+4μL
dNTP4μL
cDNA 模板
上游引物PlΙμ
下游引物P 2Ιμ
R- Tag 酶0.5μ
ddH2032.5μ
总体积50μ (4) PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标DNA片段；(5)将回收的目标片段在Τ3连接酶作用下插入至PEASY-T3载体中，转化到大肠杆菌Tl，涂于含x-gal 0. 02g/ml、IPTGO. 2g/ml以及氨苄青霉素50ng/ml的LB培养基，37°C 培养，过夜；(6)通过挑选白色单菌落，筛选阳性重组子；(7)用含氨苄青霉素的LB培养液将重组子扩增，提取克隆质粒；(8)全自动序列仪进行测序(由上海生工生物工程技术服务有限公司完成)，即可得到SEQ IDNO. 1所示的核苷酸序列的Ribosomal protein L9-B基因片段。实施例2. dsRNA合成及回收(1)根据已经验证的Ribosomal protein L9-B基因片段序列，采用 Primer Premier 5.0软件设计P 3和P 4，在上下游引物5’端加入T7启动子序列 TAATACGACTCACTATAGGG ；上游引物(P4) 5 ‘ TAATACGACTCACTATAGGGTTCTAGCGAGTTTCCG 3' (SEQ ID N0. 5)上游引物(P5) 5 ‘ TAATACGACTCACTATAGGGGCGATGCCCAGTATGT 3' (SEQ ID N0. 6)
反应缓冲液
Mg2+4μL
dNTP4μL
cDNA 模板
上游引物P 32μL
下游引物P 42μL
Ex Tap 酶0.25μ
ddH2030.75μ
总体积50μ PCR 反应程序94°C 变性 2min，94°C 30sec，60°C 30sec，72°C 30sec，38 个循环， 72°C延伸。(2) PCR产物经浓度为的低熔点琼脂糖凝胶电泳分离并在紫外灯下进行观察， 结果见图1，其序列见SEQ ID N0. 4。(3)采用 Promega 公司的Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System 试剂盒进行回收①对分离得到的目标片段切胶，并放入称量过重量(a)的1. 5ml微量离心管中，再次称量(b)，b-a算得所切胶重；②根据胶重，每IOmg凝胶加入10 μ L Membrane Binding Solution。凝胶重量不超过350mg ；③将凝胶放入50_65°C水浴锅中水浴IOmin或者直到凝胶完全融化；④将试剂盒中的滤管放置在配套的收集管中，转移融化的凝胶液体至滤管中，室温放置Imin ；⑤16，000 Xg (14，OOOrpm)离心lmin，弃去收集管中的液体；⑥力口入 700 μ 1 Membrane Wash Solution (已力口入 95 % 酒精)， 16, 000 Xg (14, OOOrpm)离心lmin，弃去收集管中的液体；⑦力口入 500 μ 1 Membrane Wash Solution (已力口入 95 % 酒精)， 16, 000 Xg (14, OOOrpm)离心5min，弃去收集管中的液体；
⑧不加液体空转Imin ；⑨转移 滤管到1. 5ml微量离心管中，加入50 μ 1 Nuclease-Free Water，室温放置 Imin, 16，000 Xg (14，OOOrpm)离心 Imin ；⑩收集到的DNA产物保存在4°C或_20°C。
实施例3. dsRNA喂食实验(1)将玻璃管的一端用封口膜封好，用吸虫器吸取二龄的灰飞虱加入玻璃管内，用纱布将另一端封好；(2)将虫子轻轻用手拍打至一端，将另一端的纱布取下，将已经准备好的封口膜贴纸的一面朝上，均勻用力向两侧拉，拉成正方形，然后盖到玻璃管管口上，将管竖立放置在超净台面上；(3)用移液枪吸取饲料100 μ 1滴在封口膜的中央，对照只加饲料(配方见表1)， 处理组在饲料中加入Ribosomal protein L9-B基因的dsRNA，dsRNA的浓度为3875ng/μ 1， 用一个新的封口膜，贴纸的一面朝下，贴在玻璃管管口上，将饲料和dsRNA封在两层封口膜之间；(4)将加好饲料和dsRNA的玻璃管放回养虫室的养虫架上，房间温度为26°C，利用灰飞虱的趋光习性仅在饲料端给予光照，使其趋食饲料，每24h换一次饲料和dsRNA ；(5)连续喂食五天，每24h统计一次死亡率，结果见图2，由图2可见喂食致死基因 Ribosomal protein L9-B的dsRNA能够达到较好的致死效果。表权利要求
1.灰飞虱致死基因片段Ribosomalprotein L9-B，其特征在于序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.权利要求1所述的灰飞虱致死基因片段Ribosomalprotein L9-B的克隆方法，其特征在于包括如下步骤(1)取灰飞虱，提取总RNA，以提取的灰飞虱总RNA合成cDNA第一条链；(2)以步骤(1)合成的灰飞虱cDNA第一条链为模板，以序列为SEQID NO. 2的上游引物Pl、序列为SEQ ID NO. 3的下游引物P2进行RT-PCR扩增；(3)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标DNA片段；(4)将回收的目标DNA片段在T3连接酶作用下插入至PEASY-T3载体中，转化到大肠杆菌Tl，涂于含有X-gal、IPTG以及氨苄青霉素的LB培养基，37°C培养，过夜；(5)通过挑选白色单菌落，筛选阳性重组子；(6)用含氨苄青霉素的LB培养液将重组子扩增，提取克隆质粒；(7)全自动序列仪进行测序，得到SEQID NO. 1所示的Ribosomal protein L9-B基因片段。
3.根据权利要求2所述的灰飞虱致死基因片段Ribosomalprotein L9-B的克隆方法， 其特征在于所述的RT-PCR扩增体系为反应缓冲液5 μ L，Mg2+4 μ L，dNTP 4 μ L，cDNA模板 2 μ L，上游引物 1 μ L，下游引物 IyL, R-Tag 酶 0. 5 μ L，ddH20 32. 5 μ L，共 50 μ L ；PCR 反应程序为94°C变性 2min，94°C 30sec，55_62°C 30sec,72°C 30sec，38 个循环，72°C延伸。
4.权利要求1所述的灰飞虱致死基因片段Ribosomalprotein L9-B的dsRNA，其特征在于序列如SEQ ID NO. 4所示。
5.权利要求4所述的灰飞虱致死基因片段Ribosomalprotein L9-B的dsRNA的合成方法，其特征在于以灰飞虱cDNA第一条链为模板，以序列为SEQ ID NO. 5的上游引物P3、 序列为SEQ ID NO. 6的下游引物P4PCR扩增得到灰飞虱致死基因片段Ribosomal protein L9-B 的 dsRNA。
6.根据权利要求5所述的灰飞虱致死基因片段Ribosomalprotein L9-B的dsRNA的合成方法，其特征在于包含如下步骤(1)根据已经验证的Ribosomalprotein L9-B基因片段序列，设计并合成序列为SEQ ID NO. 5的P3和序列为SEQ ID NO. 6的P4，以灰飞虱cDNA第一条链为模板PCR扩增得到灰飞虱致死基因片段Ribosomal protein L9-B的dsRNA，PCR体系为反应缓冲液5 μ L， Mg2+4 μ L，dNTP 4 μ L，cDNA 模板 2 μ L ；上游引物 2 μ L，下游引物 2 μ L，Ex Tap 酶 0. 25 μ L， ddH20 30. 75 μ L，共 50 μ L ;PCR 反应程序为94°C 变性 2min，94°C 30sec，55-62 °C 30sec, 72°C 30sec，38 个循环，72°C延伸；(2)PCR产物经浓度为的低熔点琼脂糖凝胶电泳分离；(3)回收目标DNA产物。
7.一种灰飞虱的dsRNA喂食方法，其特征在于包含如下步骤(1)将玻璃管的一端封好，用吸虫器吸取二龄的灰飞虱加入玻璃管内，用纱布将玻璃管另一端封好；(2)将虫子拍打至玻璃管封口端，将另一端的纱布取下，将已经准备好的封口膜，贴纸的一面朝上，盖到玻璃管管口上，将管竖立放置；(3)用移液枪吸取含dsRNA的饲料滴在膜的中央，用一个新的封口膜，贴纸的一面朝下，贴在玻璃管管口上，将饲料和dsRNA封在两层封口膜之间；(4)将加好饲料和dsRNA的玻璃管放回养虫室的养虫架上，房间温度为26°C，利用灰飞虱的趋光习性仅在饲料端给予光照，使其趋食饲料，每24h换一次含dsRNA的饲料。
8.根据权利要求7所述的dsRNA喂食方法，其特征在于所述的dsRNA为权利要求4所述的灰飞虱致死基因片段Ribosomal protein L9-B的dsRNA。
全文摘要
本发明属于农业生物技术领域，涉及基于基因沉默技术的灰飞虱致死基因片段Ribosomal protein L9-B及其dsRNA。本专利发明就是利用实验室改进的dsRNA喂食法从灰飞虱中筛选出经干扰后能够导致灰飞虱死亡的序列如SEQ ID NO.1所示的灰飞虱致死基因片段Ribosomal protein L9-B，利用该基因片段的dsRNA喂养灰飞虱，具有很好的致死效果，为建立利用RNA干扰技术控制害虫的新策略提供序列和数据基础。
文档编号C12N15/113GK102220339SQ20111012277
公开日2011年10月19日 申请日期2011年5月12日 优先权日2011年5月12日
发明者姜卫华, 李国清, 李飞, 董双林, 韩召军 申请人:南京农业大学