buffer用于10 %聚丙稀酰胺凝胶电泳，电 泳后进行硝酸银染色，电泳电压设定为150V，时间为180min ;硝酸银染色的步骤为（100ml 体系）：①用10%乙醇+500 μ L乙酸固定5~8min;②用10%乙醇+500 μ L乙酸再次固定 5~8min ;③用0· 2% AgNO3染色10~15min ;④用蒸馏水冲洗数秒；⑤用L 5% Na0H+500ml 甲醛显色，直到有清晰条带出现为止。以上各步骤在摇床上震荡完成，显色后的凝胶采用成 像仪拍照记录。
[0043] 接着，利用人工方法读带，将电泳图上清晰的条带记为"1"，同一位置无带或不易 分辨的弱带计为"〇"，建立原始数据库，然后再把每对SSR引物中位点的1、0数据转换为字 母条码。编码规则为：①如果有2个位点，则按位点的大小，只有第一个位点的编码为A，只 有第二个位点的编码为B，两个位点都有的编码为C，如果两个位点都没有编码为N，如表3 ; ②如果有3个位点，只有1个位点的按大小依次编码为A、B、C，有2个位点的，按位点组合 依次编码为D、E、F，三个位点都有的编码为G，如果三个位点都没有编码为N，如表4 ;③如 果有4个位点，只有1个位点的按大小依次编码为A、B、C、D，有2个位点则编码字母从E开 始，按位点组合依次编码为E、F、G、H、I、J，有3个位点的按位点组合从K开始依次编码为 K、L，4个都有编码为M，4个位点都没有编码为N，如表5。
[0049] 表5有4个等位位点的条码换规则
[0050] 引物234、685、A58和A142扩增结果的电泳图见图1、图2、图3和图4,样品的顺 序在图中依次：1为槠叶齐，2为湘波绿2号，3为福鼎大白茶，4为玉绿，5为尖波黄13号，M 为IOObp DNA ladder。根据各引物的目的片段大小（表1)，4个引物原始条带数据记录见 表6,其中图1、图2、图3和图4中的①代表位点1的位置大小，②代表位点2的位置大小， ③代表位点3的位置大小，④代表位点4的位置大小。
[0051] 依据前述表3、表4、表5的转换规则转换的字母条码见表7,这4个引物组合所构 成的5个品种的DNA条形码见表8。以表8中的条形码为标准，可以对待鉴定的茶树品种采 用以上4对引物组合进行扩增，并根据提供的条码转化规则将扩增结果转化为条码，如果 待鉴定的茶树品种的条码与标准品种的条码相同，则该品种为标准品种；如果条码不同，则 不是标准品种D
[0058] 表8 5个品种的DNA字母条形码
[0059] 以上对本发明例所提供的技术方案进行了详细介绍，以上实施例的说明只适用于 帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在 【具体实施方式】以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本 发明的限制。
【主权项】
1. 一种利用DNA条形码鉴别茶树品种的方法，包括以下步骤： (1) DNA提取：分别提取数个茶树品种的DNA ; (2) 引物筛选：筛选条带清晰、稳定且重复性好的数对SSR引物； (3) PCR扩增：将上述提取的DNA中的每个DNA分别与每对筛选的SSR引物混合配成 PCR反应试剂进行扩增； (4) SSR标记的PCR产物分析：将每一 PCR反应产物进行凝胶电泳后染色，然后采用凝 胶成像仪拍照记录； (5) 分子条形码的构建：将上述记录的每对SSR引物上每一个品种的电泳图上清晰的 条带记为"1"，同一位置无带或不易分辨的弱带计为"0"，建立原始数据库；然后把每对SSR 引物上每一个品种位点的1、〇数据转换为字母；再将数对SSR引物上对应品种转换的字母 进行组合，形成每一个品种的DNA条形码； (6) 鉴别：以上述DNA条形码为标准鉴别茶树品种的真伪。2. 根据权利要求1所述方法，其特征在于：采用试剂盒法提取DNA。3. 根据权利要求2所述方法，其特征在于：筛选出 F:CTCCGATTACTTTCTTCC R:GCAGGTTAGCGGTGGTTA ； F:TAGGGTTTTAGTTTCAG R:AACATCCTTGCCTCGTC ； F:GTGAAGTTAGTTGTTACTCTTTTTTGG R:AGGGGAAGTGAGGAGGCAT ； F:ATGCTTCAGGGAGTGACCAT R:ATTTATGCCAAACTACCAACAG 四对SSR引物。4. 根据权利要求3所述方法，其特征在于：每一 PCR反应试剂按体积份数6. 65份 ddH20、l. 0份 10ng/yL 的上述提取的一个DNA、1. 0份 10XBuffer、0. 7份25 mM的Mg2+、0. 2 份 10 mM 的 dNTP、各 0? 1 份 10 y M 的 primers 和 0? 25 份 2U/ y L 的 Taq polymerase 混合 配成而成。5. 根据权利要求4所述方法，其特征在于：PCR扩增条件为94°C变性3 min，然后94°C 变性30 s，53°C退火30 s，72°C延伸50 s，共30个循环，完成以上循环以后，72°C延伸10 min，最后将PCR产物冷却到室温或者4°C。6. 根据权利要求5所述方法，其特征在于：上述PCR扩增重复一次，比较两次扩增结 果，如果两次结果不一致，PCR扩增再重复一次，以有两次扩增一致的结果为准。7. 根据权利要求6所述方法，其特征在于：将PCR反应产物与6 X loading buffer混 合，采用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后进行硝酸银染色，直到有清晰条带出现为止。8. 根据权利要求7所述方法，其特征在于：硝酸银染色的步骤为：①用10%乙醇和0. 5% 乙酸固定5~8 min ;②用10%乙醇和0. 5%乙酸再次固定5~8 min ;③用0. 2%AgN03染色 10~15 min ;④用蒸馏水冲洗数秒；⑤用I. 5%NaOH和0. 5%甲醛显色。9. 根据权利要求7或8所述方法，其特征在于：1、0数据转换为字母的规则为：①有 2个位点，按位点的大小只有第一个位点的编码为A ;只有第二个位点的编码为B ;两个位点 都有的编码为C ;两个位点都没的有编码为N ;②有3个位点，只有1个位点的按大小依次编 码为A、B、C ;只有2个位点的，按位点组合依次编码为D、E、F ;三个位点都有的编码为G ;如 果三个位点都没有编码为N ;③有4个位点，只有1个位点的按大小依次编码为A、B、C、D ; 只有2个位点则编码字母从E开始，按位点组合依次编码为E、F、G、H、I、J ;只有3个位点 的按位点组合从K开始依次编码为K、L ;4个位点都有的编码为M，4个位点都没有的编码为 N0
【专利摘要】本发明涉及一茶树品种鉴别方法，具体说是一种利用DNA条形码鉴别茶树品种的方法，包括分别提取数个茶树品种的DNA；筛选SSR引物；将上述提取的数个DNA分别配制成PCR反应试剂，进行反应扩增；将每一PCR反应产物进行凝胶电泳后染色，然后采用凝胶成像仪拍照记录；将SSR引物上对应品种转换的字母进行组合，形成DNA条形码。本发明利用分子标记技术，通过基因组DNA提取、标记筛选、PCR扩增、产物分析、条带数据读取和字母条形码的建立等技术组合，建立了一种DNA条形码鉴别茶树品种的方法，该方法与传统形态学鉴定方法相比，不受环境条件影响，方法简单、快速、准确，可对茶树品种的真实性进行准确鉴定。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104946745
【申请号】CN201510283025
【发明人】刘振, 杨阳, 赵洋, 杨培迪, 成杨, 宁静
【申请人】湖南省茶叶研究所
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年5月28日