具有功能失调的t3ss蛋白的抗菌性转基因植物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种核酸表达载体，所述核酸表达载体包含编码显性负性T3SS蛋白的核酸序列。所述核酸表达载体还包括能够驱动所述核酸序列在植物细胞中转录的顺式作用调控元件。此外，所述显性负性T3SS蛋白介导功能失调的针状复合物的组装。
【专利说明】具有功能失调的T3SS蛋白的抗菌性转基因植物
【技术领域】
[0001 ] 本发明，在其些实施方式中，涉及抗菌性植物及制备所述植物的方法。
[0002]发明背景
[0003]青枯雷尔氏菌(Rs)，是一种分布广泛的革兰氏阴性的土壤传播性病原体，它属于β -亚门的蛋白菌,能导致超过200种植物的致死性萎蔫疾病，这些植物包括重要的经济作物，例如番茄，马铃薯和香蕉。细菌通过伤口进入植物根部，侵入木质部并通过脉管系统迅速蔓延至植物的气生部位。茎上很快可以发现超过IOltl每厘米的细胞群。Rs的主要毒力因子是表多糖(EPS)，一种长的(超过106Da)糖聚合物。表多糖能堵塞木质部并导致萎蔫症状，并最终导致植物死亡。
[0004]RS具有突出的蛋白分泌能力，其能分泌超过100种蛋白质。例如，II型分泌系统(T2SS)分泌因子，包括植物细胞壁降解果胶酶，内切葡聚糖酶，以及最近发现的，毒力EPS(图1A-C)。III型分泌系统(T3SS)分泌促感染效应蛋白(T3E)进入宿主细胞，以优化宿主环境，并抑制入侵后的植物防御反应(图1A-C)。
[0005]III型分泌系统(T3SS)是革兰氏阴性菌的一个复杂的分子机器，其能将细菌蛋白(效应器)“注入”(转移入)真核细胞。为此，T3SS必须组装成一个多蛋白复合物，它由不同的部分组成:跨越两个细菌细胞膜与细胞质茎相连接的基体；连接在基体上的类似于分子注射器(注射体(iniectisome)/菌毛)的针状结构；和能够重组成易位子的远端针尖结构。易位子是一种蛋白质复合物结构，其能插入宿主细胞的膜。菌毛仅由一种蛋白亚基组成。多个亚基寡聚成菌毛结构。所述针状结构，使细菌蛋白能通过所述针的内部通道(导管)被输送至宿主细胞(图1A-C)。
[0006]因此，T3SS的主要胞外成分是从所述装置的外膜部分延伸的针，并且通过该针形成25 A的通道以形成分泌导管(所述针的螺旋参数为每转5.5亚基；每亚基轴向上升46A)。所述针是由单种小蛋白(9kDa)的多个副本(大约100-150)的螺旋组件形成。虽然大多数革兰氏阴性菌的菌毛结构单元的一级序列之间几乎没有同源性，但据信它们大多数具有某些结构同源性。在植物病原细菌中，T3SS由hrp (过敏性反应和致病性)基因编码，这样命名是因为它们都是细菌在易感植物中引起疾病，并在抗性植物中诱导过敏性反应所必须的。几乎在所有主要的革兰氏阴性细菌植物病原体中(如丁香假单胞菌，黄单胞菌，青枯雷尔氏菌，和欧文氏菌)已发现hrp基因，这也说明T3SS在调节不同的植物与细菌间相互作用中的核心作用。因此，通常情况下，T3SS外菌毛的组装是通过主要组分(例如青枯雷尔氏菌的HrpY，丁香假单胞菌和解淀粉欧文氏菌的HrpA，野油菜黄单胞菌的HrpE，志贺氏菌的MxiH，沙门氏菌的PrgI和耶尔森氏菌的YscF)的逐步聚合而成。
[0007]如前所述，虽然III型效应器的主要功能是促进植物的易感性，一些效应器被能触发防御反应的植物抗性蛋白所识别，防御反应包括过敏性反应。所提供的一种克服革兰氏阴性菌所导致的植物致死性感染的方法，包括增强植物对此类病原体的免疫力。
[0008]美国专利申请号20090258825 (He等)公开了用于增强植物抵御病原体(如细菌病原体)的组合物和方法。根据其教导，通过增加ATMIN相关的植物保护蛋白，如ATMIN7的活性，可有效增强植物针对丁香假单胞菌毒力蛋白HopMl的免疫力。
[0009]美国专利申请号20090044296 (Beer等)公开了增加植物生长或赋予植物抗病性的方法，所述方法通过使用适于增加或减少核酸分子表达的核酸分子，所述核酸分子编码HrpN相互作用蛋白(例如HIPM)。其中所公开的缺失分析显示了解淀粉欧文氏菌HrpN(Harpin)的198个氨基酸的N-末端区为与HIPM相互作用所必需。这一 HrpN的N —末端区为首次发现的无细胞过敏性反应激发剂，其在所述病原体的毒性中起着关键作用。
[0010]此外，由于其病原体所具有土壤传播的性质，细菌性萎蔫病较难控制。在Rs感染的植物中，疾病的发展取决于II型和III型蛋白质分泌系统的作用，并且这些系统中的一个突变将产生非致病性细菌[Poueymiro 等，Curr.0pin.Microbiol.(2009) 12:44-52]。
[0011]Roine 等[Roine 等，FEBS Letters (1997) 417 (2):168-172]表明，一旦纯化,HrpA,即丁香假单胞菌蕃爺致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomota)DC3000菌毛的结构蛋白，其本身就足以通过自组装形成丝结构。
[0012]Taira 等[Taira 等，Mo 1 Microbiol.(1999)34(4):737-44]在 HrpA 基因处产生插入突变(例如，插入五肽)，并产生相应表达的突变细菌。根据其教导，HrpA的羧基末端区对于菌毛组装以及细菌与受影响的植物间相互作用是至关重要的。此外，Wei等[Wei等，PNAS (2000) 97 (5) =2247-2252]鉴定了在HrpA羧基端影响HrpA蛋白分泌或调节功能的三个单氨基酸突变。这些结果证明了 Hrp菌毛结构基因在蛋白分泌和丁香假单胞菌的III型分泌系统的协同调节中的关键作用。此外，Lee等[Lee等，J.Bi0.Chem.(2005) =21409-17]公开了一些五肽诱导的非功能HrpA蛋白，当其在细菌中表达时，对野生型HrpA蛋白的功能产生强大的显性负性作用，从而阻断丁香假单胞菌诱导宿主反应并导致体内疾病的能力。显性负性HrpA突变体也能干扰野生型HrpA在体外自组装成菌毛。
[0013]Weber 等[Weber 和 Koebnik, J.Bacteriology (2005) 187 (17):6175-6186]描述了若干Hrp菌毛蛋白的疏水性绘图分析，所述Hrp菌毛蛋白例如野油菜黄单胞菌疮痂病菌的HrpE和HrpA,以及青枯雷尔氏菌的HrpY,并发现了一个共同的结构域组织。这些结果表明，植物致病细菌，为了克服植物细胞壁的障碍，独立地进化出结构上类似的蛋白。Weber等进一步公开了 HrpEC-端区域的五肽插入突变体能抑制Hrp菌毛在野油菜黄单胞菌疮痂病菌中的组装。形态学研究揭示了这些插入突变体具有缩短的Hrp菌毛。此显性负性作用表明，该突变体可能干扰了 Hrp菌毛的组装。美国专利申请号20100249234(Yang等)公开了降低细菌毒力的方法，如HrpX/HrpY型系统或T3SS型系统。该方法包括将细菌与有效量的苯丙烷型抑制化合物相接触。
[0014]美国专利申请号20100099674 (Elofsson等)公开了在植物中降低细菌毒力的方法，其通过N-取代的7-喹啉基甲基胺抑制III型分泌系统，特别地，其中一个是喹啉环上5-和8-位进一步被取代。
[0015]其它【背景技术】包括美国专利申请号20050076406。
[0016]发明概述
[0017]本发明实施方式的一方面，提供了一种核酸表达载体，所述核酸表达载体包含核酸序列和顺式作用调控元件，所述核酸序列编码显性负性T3SS蛋白，所述顺式作用调控元件能够驱动所述核酸序列在植物细胞中转录，所述显性负性T3SS蛋白介导功能失调的针状复合物的组装。[0018]本发明实施方式的一方面，提供了包含核酸序列的分离的多核苷酸，所述核酸序列编码如SEQ ID NO:2，4，6，8，10或12所示的序列。
[0019]本发明实施方式的一方面，提供了包含分离的多核苷酸的核酸表达载体，所述多核苷酸包含核酸序列，所述核酸序列编码如SEQ ID N0:2，4，6，8，10或12所示的序列。
[0020]本发明实施方式的一方面，提供了包含所述核酸表达载体的宿主细胞。
[0021]本发明实施方式的一方面，提供了包含所述核酸表达载体的基因修饰植物。
[0022]本发明实施方式的一方面，提供了表达外源多核苷酸的基因修饰植物，所述外源多核苷酸编码如SEQ ID NO:2，4，6，8，10或12所示的显性负性T3SS蛋白。
[0023]本发明实施方式的一方面，提供了生成植物的方法，所述植物与未修饰的植物相t匕，包含针对细菌病原体的增强的抗性，所述方法包括将所述核酸表达载体引入植物或植物细胞，由此生成的植物与未修饰的植物相比，包含针对细菌病原体的增强的抗性。
[0024]评价植物针对细菌病原体的抗性的方法，所述方法包括:(a)在植物中表达外源核酸序列和顺式作用调控元件，所述外源核酸序列编码显性负性T3SS蛋白，所述顺式作用调控元件能够驱动所述核酸序列在植物细胞中转录；(b)使细菌病原体作用于所述植物；和(c)比较所述植物和野生型植物的疾病，所述野生型植物被培养于相同条件下并被所述细菌病原体感染，由此评价所述植物针对所述细菌病原体的抗性。
[0025]根据本发明的一些实施方式， 所述核酸序列包含SEQ ID NO: 1，3，5，7，9或11。
[0026]根据本发明的一些实施方式，所述核酸序列包含SEQ ID NO:20_65。
[0027]根据本发明的一些实施方式，所述核酸序列编码如SEQ ID NO:2，4，6，8，10或12所示的多肽。
[0028]根据本发明的一些实施方式，所述核酸表达载体还包含附加核酸序列，所述附加核酸序列编码位于所述核酸序列上游的内质网信号肽。
[0029]根据本发明的一些实施方式，所述顺式作用调控元件包含启动子序列。
[0030]根据本发明的一些实施方式，所述启动子序列是组成型启动子。
[0031]根据本发明的一些实施方式，所述组成型启动子是CaMV 35S启动子。
[0032]根据本发明的一些实施方式，所述显性负性T3SS蛋白通过引入突变而产生，所述突变选自插入突变、缺失突变和取代突变。
[0033]根据本发明的一些实施方式，所述插入突变包含嵌入闭锁元件。
[0034]根据本发明的一些实施方式，所述T3SS蛋白是T3SS结构蛋白。
[0035]根据本发明的一些实施方式，所述T3SS结构蛋白是HRP蛋白。
[0036]根据本发明的一些实施方式，所述T3SS蛋白选自青枯雷尔氏菌HrpY蛋白，丁香假单胞菌HrpA蛋白，解淀粉欧文氏菌HrpA蛋白，野油菜黄单胞菌HrpE蛋白，亚洲梨火欧文氏菌HrpA蛋白和白叶枯黄单胞菌HrpE蛋白。
[0037]根据本发明的一些实施方式，所述T3SS蛋白是青枯雷尔氏菌易位子蛋白。
[0038]根据本发明的一些实施方式,所述青枯雷尔氏菌易位子蛋白选自PopFl和PopF2。
[0039]根据本发明的一些实施方式,所述宿主细胞是植物细胞。
[0040]根据本发明的一些实施方式，所述植物与未修饰的植物相比，包含针对细菌病原体的增强的抗性。
[0041 ] 根据本发明的一些实施方式，所述细菌病原体是革兰氏阴性菌。[0042]根据本发明的一些实施方式，所述革兰氏阴性菌选自青枯雷尔氏菌，丁香假单胞菌，解淀粉欧文氏菌，野油菜黄单胞菌和白叶枯黄单胞菌。
[0043]根据本发明的一些实施方式，所述革兰氏阴性菌是变形菌种。
[0044]根据本发明的一些实施方式，所述变形菌是青枯雷尔氏菌。
[0045]根据本发明的一些实施方式，所述植物选自作物植物，装饰植物和树。
[0046]根据本发明的一些实施方式，所述植物选自番爺植物，马铃薯植物，爺植物，香蕉植物，甜椒植物，橄榄植物，苹果植物，梨植物，火棘植物，海棠植物，山楂植物，枸子植物，榲梓植物，花楸植物，拟南芥植物，天竺葵，姜植物，烟草植物及桉树植物。
[0047]根据本发明的一些实施方式，所述植物是番茄植物。
[0048]除非特别定义，本文所使用的所有技术和/或科学术语的含义与本发明所属领域内普通技术人员通常理解的含义相同。下文描述了实施本发明的示例性的方法和/或材料，但是在实施或测试本发明的实施方式时，可以使用与本文所述相似或等同的方法和材料。万一有冲突时，以本发明的说明书，包括定义，为准。此外，所述材料、方法和实施例仅用于举例说明，并不一定为了限制。
[0049]附图简述
[0050]仅通过举例，并且参考所附附图，本文描述了本发明的一些实施方式。在具体参考附图时，需要特别注意的是，通过例子显示的细节仅仅是为了举例讨论本发明的实施方式。在这方面，说明书和附图一起向本领域技术人员清楚地展示了可以怎样实施本发明的实施方式。
[0051]附图中:
[0052]图1A说明了革兰氏阴性菌的II型分泌系统(T2SS)、111型分泌系统(T3SS)和IV型菌毛。该图摘自 Donnenberg M.S.，Nature (2000) 406:768_774。
[0053]图1B-C 摘自 Buttner 和 He，Plant Physiology (2009) 150:1656_64，说明了植物病原菌(图1B)和动物病原菌(图1C)的T3SS复合物。分泌装置跨越细菌细胞膜并与细胞质ATP酶相联。植物病原菌具有理论上能跨越植物细胞壁的菌毛。动物病原菌具有短的针状结构，其通过所谓尖端复合物(在植物病原体中则缺失)与易位子相连接。易位子在宿主质膜中形成通道，并允许效应器蛋白转运进所述宿主细胞的胞液中。
[0054]图2A-F的图显示了青枯雷尔氏菌(Rs)HrpY蛋白(SEQ ID NO:14)与志贺氏菌T3SS针状单体MxiH(SEQ ID NO:15，图2A)，志贺氏菌MxiH的结构模型(图2B-E)和整体针状结构(图2F)的比对。MxiH和针状结构的图摘自Deane等，PNAS 2006 103:12529-33。
[0055]图3A-E的图片显示了显性负性蛋白T3SS嵌入闭锁元件I (T3SS IBE1)(图3A，SEQID NO:2)和 2(T3SS IBE2)(图 3C, SEQ ID NO:4)，T3SS IBEl 和 2 的结构的预测模型(分别为图3B和3D)，针和针状导管相互作用的模型(图3E)和来自sp | Q56YT0 | LAC3_At漆酶或tr I Q6TDS6 | Q6TDS6_G0SAR分泌漆酶棉属arboreum的植物分泌信号(分别为SEQ ID NO:16 和 17)。图 3B，3D 和 3E 摘自 Deane 等，PNAS 2006 103:12529-33。
[0056]图4A-C的图片显示了显性负性蛋白T3SS嵌入闭锁元件3(图4A，SEQ ID NO:6)，T3SS IBE 3结构的预测模型(图4B)和与针的相互作用模型(图4C)。图4B和4C摘自Deane 等，PNAS 2006 103:12529-33。
[0057]图5A-C的图片显示了显性负性蛋白T3SS嵌入闭锁元件4(图5A，SEQ ID NO:8)，闭锁元件的预测模型(图5C)，和针(图5B)。图5B和5C摘自Deane等，PNAS 2006 103:12529-33。值得注意的是，重复的尾部可能会与不同单体相互作用，干扰和阻断所述针通道。
[0058]图6A-D的图片显示了显性负性蛋白T3SS嵌入闭锁元件5(图6A，SEQ IDNO:10)和6 (图6C，SEQ ID NO:12)和T3SS嵌入闭锁元件5和6的结构的预测模型(图6B和6D)。值得注意的是，HrpY的头部和尾部α-螺旋被脯氨酸破坏，这样的形变可能会阻断针的通道并干扰针的功能。图6Β和6D摘自Deane等，PNAS 2006 103:12529-33。
[0059]图7A-C的图片显示了不同的青枯雷尔氏菌(Rs)HrpY显性负性蛋白。图7Α显示了 T-DNA克隆图。通过XbaI和SacI位点，每个嵌入闭锁元件(IBE)被克隆至CaMV 35S启动子的下游和NOS终止子的上游。图7Β显示了与针状结构相互作用的模型，图7C显示了不同的 HrpY 突变(SEQ ID NO:2，4，6，8，10 和 12)。图 7Β 摘自 Deane 等，PNAS 2006 103:12529-33。
[0060]图8 的图片摘自 Taira等，Mol Microbiol.(1999)34(4):737_44，其显示了插入突变以及它们在hrpA基因(SEQ ID NO:18)中的位置。简单的说，496bp BamHI 土EcoRI片段编码HRPA菌毛，片段中的突变插入位点用棒糖形标记表示，标记上的数字表示突变号。每个插入包括10个来自转座子的碱基对，在其上游的5个碱基对在所述10个碱基对的下游向远端重复。氨基酸序列(SEQ ID NO:19)写在核苷酸序列下面。启动子中的Hrp盒用方框表示；假设的核糖体结合位点以下划线表示。氨基末端蛋白的加工位点用氨基酸序列下方的箭头标记。带箭头的方框突变号表示四个缺失突变的起始和终点。
[0061]图9是青枯雷尔氏菌HrpY多肽变体(即菌株间微小的序列变化，SEQ ID NO:14和70-86)的比对。
[0062]10A-C的图片显示了番茄植物的PCR和sqRT-PCR分析，所述番茄植物表达萎蔫抗性(WiItR) HrpY突变6。用构建体转化番茄植物，所述构建体携带HrpY突变6，并且用基因组PCR和半定量RT-PCR对植物进行进一步分析。检测到这些HrpY突变的表达。
[0063]图1lA-C的图片显示了表达萎蔫抗性(WiltR)HrpY突变I的番茄植物的PCR和sqRT-PCR分析。用携带HrpY突变I的构建体转化番茄植物，并用基因组PCR和半定量RT-PCR对植物进行进一步分析。检测到这些HrpY突变的表达。
[0064]图12A-C的图片显示了番茄植物的PCR和sqRT-PCR分析，番茄植物表达萎蔫抗性(WiltR)HrpY突变2。用携带HrpY突变2的构建体转化番茄植物，并且用基因组PCR和半定量RT-PCR对植物进行进一步分析。检测到这些HrpY突变的表达。
[0065]本发明【具体实施方式】的说明
[0066]本发明，在一些实施方式中，涉及抗菌性植物及制备所述植物的方法。
[0067]通过参考附图和所附描述可以更好的理解本发明的原理和操作。
[0068]在对本发明的至少一个实施方式进行详细说明前，应当理解，本发明的应用并不一定限于如下文描述或由实施例所举例说明的细节。本发明可以有其它实施方式或以各种方式来实施或执行。同样地，也应理解，本文所用的措辞和术语是用于描述的目的，不应该被理解为用于限制。
[0069]在完成本发明的一些实施方式时，本发明的发明人制备了显性负性细菌III型蛋白质分泌系统(T3SS)蛋白，它在植物细胞中表达并从中分泌。本发明的所述新型显性负性T3SS蛋白在其组装过程中嵌入T3SS针状结构中，并阻断细菌针状结构通道，从而保护植物不受细菌感染。
[0070]本发明的显性负性T3SS蛋白的设计是基于保留并利用了天然T3SS蛋白(例如HrpY)亚单位-亚单位间的相互作用位点，并整合了通过蛋白翻译形成的融合的通道阻断肽或T3SS蛋白的变形结构(例如HrpY α -螺旋)，从而阻止细菌效应器从细菌分泌到植物细胞中。加入其中的植物分泌信号允许植物细胞中表达显性负性蛋白并从植物细胞中分泌出来。当细菌菌毛在靠近植物细胞壁处组装时，分泌的显性负性T3SS蛋白能接近正在组装的菌毛。因此，如下文实施例部分中所示，本发明的发明人制备了革兰氏阴性菌T3SS针通道(T3SS-1BE)的嵌入闭锁元件。通过HrpY蛋白(SEQ ID NO: 14)的结构修饰，产生青枯雷尔氏菌的T3SS-1BE(SEQ ID NO:2，4，6，8，10和12)，所述HrpY蛋白为Rs针状结构的结构单元。本发明进一步产生了表达载体，所述表达载体包含这些用于转化植物细胞的T3SS-1BE。此外，本发明的发明人已经示出用青枯雷尔氏菌HrpY突变体1，2或6转化番茄植物，及其表达(分别参见图11A-C，图12A-C和图10A-C)。此外，本发明构思转基因植物中修饰的Rs易位子蛋白(PopFl)的过表达。这些蛋白的过表达能阻断T3SS的组装，这是由于这些蛋白能与不成熟的针状结构相互作用，并因此导致其失活。因此，修饰的PopFl蛋白被整合入易位子门并将其阻断。总而言之，本发明的教导可以在用于产生抗菌性植物的农业领域中作为有力工具。
[0071]因此，根据本发明的一个方面，提供了一种制备植物的方法，所述植物与未修饰的植物相比，包含针对细菌病原体的增强的抗性，该方法包括将所述核酸表达载体引入植物或植物细胞，由此制备的植物，与未修饰的植物相比，包含针对细菌病原体的增强的抗性。
[0072]本文所用的术语“植物”包括整个植物，所述植物的先代和后代和植物部分，包括种子，芽，茎，根(包括块茎)，植物细胞，组织和器官。植物可以是任何形式的，包括悬浮培养物，胚胎，分生组织区，愈伤组织，叶，配子体，孢子体，花粉和小孢子。在本发明所述方法中特别有用的植物包括所有属于超家族植物界的植物，特别是单子叶和双子叶植物，包括草料或饲料豆科，观赏植物，粮食作物，树，或灌木植物，其选自相思树属，宏基属，猕猴桃属，七叶树属，贝壳 杉芦苇，合欢阿马拉，桫三色，须芒草属，花生属，槟榔，阿斯特瑞雅(Astelia)桂花，黄芪鹰嘴豆，多小叶红苏木，桦属，芸苔属，艳紫铆木榄，伯克苏森，灰树花，伞形科植物(Cadaba farinose),朱楼花属，茶树,美人蕉,辣椒属，槐属，距瓣豆属毛竹，木瓜属，肉桂，小果咖啡，可乐豆木，绣球小冠花，枸子黑樱桃，山楂属，黄瓜属，柏木属，极稷荆，媪梓，柳杉，香茅属，银白树蕨(Cynthea dealbata),媪椁,黄檀属(Dalbergiamonetaria),骨碎补属,蚂幢属,粗糙蛘壳蕨,拢双黄茅(Dibeteropogon amplectens),镰扁豆属，扁豆属，Dorycnium rectum,金字塔稗,Ehraff ia属,糝,麸属,刺桐属,桉树属，施氏假乌木属，金茅红丁香属，荞麦属，费约果属，草莓属，千斤拔属，河岸藤露兜树(Freycinetiabanksli)，天竺葵，银杏属，罗德毛豆属，南洋樱属，陆地棉，银桦属，鞘籽古夷苏木属，岩黄苗属，Hemaffhia altissima,黄茅属，大麦，红荀茅属，连翅，Hypeffhelia dissolute,靓蓝水俣，鳶尾属，虎耳草，胡枝子属，莴苣属，银合欢属，Loudetia simplex, Lotonusbainesli，莲花属，阿切尔扁豆，平邑属。，木薯,苜蓿,水杉,大蕉,烟草属。，红豆属，鸟足豆属。，水稻属，巴西盾，非洲狼尾草属，酪梨，矮牵牛属，菜豆，加拿利海枣，红叶石楠属，新西兰剑麻，云杉青K，松属，豌豆属，罗汉松托塔拉，Pogonarthria fleckii, Pogonaffhriasquarrosa,杨属，牧豆瓜叶菊,花旗松,老虎刺属，西洋梨，栎属，厚叶石斑木，尼卡香棕，火炬纳塔尔，醋栗属，香茶属，刺槐，蔷薇属，悬钩子属，柳属，红裂稃草(Schyzachyriumsanguineum), Sciadopitys vefficillata,红杉，巨杉，高粱，菠菜属，鼠尾粟，Stiburusalopecuroides,矮柱花草(Stylosanthos humilis),葫芦茶属,落羽杉,菅草，红三叶属，小麦属，铁杉属太子参，越桔属，蚕豆属，葡萄，锥穗沃森花(Wat son I a pyramidata),马蹄莲，玉米，苋菜，朝鲜蓟，芦笋，花椰菜，抱子甘蓝，白菜，油菜，胡萝卜，菜花，芹菜，亚麻，羽衣甘蓝(flax)，羽衣甘蓝(kale)，扁豆，油菜，秋葵，洋葱，马铃薯，水稻，大豆，秸杆，甜菜，甘蔗，向日葵，番茄，南瓜茶，树木。或者，藻类和其他非植物界可用于本发明的方法。
[0073]根据具体的实施方式，所述植物是茄科植物。
[0074]根据具体的实施方式，所述植物是茄属植物。
[0075]根据另一具体的实施方式，所述爺属植物是番爺(番爺(Lycopersicumesculentum))。
[0076]根据另一具体的实施方式，所述植物包括:马铃薯(马铃薯(Solanumtuberosum));番爺(蕃爺(Lycopersicum esculentum));爺子(爺植物)(爺子(Solanummelongena));香蕉(色蕉科属)；天竺葵(通用名)(天竺葵(Pelargonium)) ?’姜(姜(Zingiber officinale));烟草(烟草(Nicotiana tabacum));甜椒(辣椒属);橄榄(Oleaeuropea)拟南芥植物,桉树,苹果,海棠,梨,火棘，山楂，枸子，媪梓或花揪植物。[0077]如本文所用的术语“细菌病原体”是指任何类型的毒力细菌菌种或菌株，其能感染植物，包括，但不限于，假单胞菌属，欧文氏菌相关的菌株，青枯雷尔氏菌和野油菜黄单胞菌。所述细菌可以是假单胞菌属，包括金色假单胞菌，绿针假单胞菌，荧光假单胞菌，边缘假单胞菌，丁香假单胞菌，托拉氏假单胞菌，蘑菇假单胞菌和绿黄假单胞菌。所述细菌可能是欧文氏菌相关的菌株，包括达旦迪基氏菌(菊欧文氏菌)，软腐欧文氏菌，黑腐欧文氏菌和解淀粉欧文氏菌。这种细菌可能是野油菜黄单胞菌相关的菌株，包括十字花科黑腐病菌(Xcc)和白叶枯黄单胞菌。
[0078]根据本发明的实施方式，所述细菌是革兰氏阴性菌。
[0079]根据具体的实施方式，所述革兰氏阴性菌是变形菌种。
[0080]根据另一个具体的实施方式，所述变形菌是青枯雷尔氏菌。
[0081]根据另一个具体的实施方式，所述革兰氏阴性菌选自青枯雷尔氏菌，丁香假单胞菌，解淀粉欧文氏菌，欧文氏Psidii，亚洲梨火欧文氏菌，野油菜黄单胞菌和白叶枯黄单胞菌。
[0082]如本文使用的短语“增强的抗性”是指，减少细菌的毒力，从而与非修饰植物相比，降低宿主植物的易感性，所述未修饰植物被相同的细菌病原体感染。根据本发明的教导，降低细菌的毒力是通过表达与细菌毒力相关的显性负性蛋白(例如针状复合物，如下文进一步详细描述)来起作用，并可影响与宿主相关的细菌的生命周期中的任何一步，包括但不限于，粘附，侵入，复制，逃避宿主防御及传送到新宿主。
[0083]针对细菌病原体的抗性增强可表现为宿主中的症状减少，因此，可以通过监测宿主中与细菌相关的反应的减少来检测。增强的抗性可以表现为，相对于适当的对照(例如在相同条件下的非修饰的植物)，至少减少了约1%，至少减少了约5%，至少减少了约10 %，至少减少了约20 %，至少减少了约30 %，至少减少了约40 %，至少减少了约50 %，至少减少了约60 %，至少减少了约70 %，至少减少了约80 %，至少减少了约90 %，或至少减少了约100%的与细菌病原体相关的症状，这可以通过本领域技术人员公知的任何测定法测量。
[0084]本发明的方法可以通过将核酸表达载体引入植物起作用，所述核酸表达载体包含核酸序列和顺式作用调控元件，所述核酸序列编码显性负性T3SS蛋白，所述顺式作用调控元件能够驱动所述核酸序列在植物细胞中转录，所述显性负性T3SS蛋白介导功能失调的针状复合物的组装。
[0085]本文使用的术语“T3SS”是指细菌(例如革兰阴性菌)的III型分泌系统(也称为TTSS)，其通常以针状结构起作用，可直接从细菌细胞分泌蛋白质。T3SS针状复合物通常始于该细菌的细胞质中，穿过两层膜并伸出细胞(参见，例如图1A)。固定在膜上的部分是T3SS的底座(或基体)。胞外部分是针(也命名为菌毛)。作为通向宿主细胞细胞质的门的最后一个结构是易位子。(参见图1B-C)。所谓的内杆将针与底座连接。
[0086]如本文使用的术语“T3SS蛋白”指的是一种蛋白质，其构成T3SS分泌系统复合物。这包括结构蛋白，即构建底座的蛋白，内杆，针，尖端或易位子。针本身通常由单一 T3SS蛋白的许多单位构成。因此，T3SS蛋白的差异大多数是那些构建底座以及那些被分泌进宿主的蛋白。
[0087]根据本发明的实施方式，T3SS蛋白是一种蛋白质，如HRP(过敏性反应和致病性的)蛋白，其组成T3SS针状结构。示例性的HRP蛋白包括，但不限于，青枯雷尔氏菌HrpY蛋白，丁香假单胞菌HrpA蛋白，解淀粉欧文氏菌HrpA蛋白，亚洲梨火欧文氏菌HrpA蛋白和野油菜黄单胞菌HrpE蛋白(示例性的蛋白质，参见下表1，其引自Buttner和He,PlantPhysiology (2009) 150:1656-1664 并且并入本文]。
[0088]表1:示例性的T3SS蛋白·
Ig&I 预测蛋白功能丨细菌种类—
HrpA蘭毛蛋Q解淀粉欧文氏爾
HrpK玆+位-Z1 蛋 Π j
H^a--?5 I rmmmm pv
___番茄
HrpKJI
_]....................................................................tlrpY............................................................................1?_____￡Μ"ι?.................................j______________________:19函.尔氏.蘭____________________
^PopFi1...................................................................PoPF2.........................................................................................................................................................................................................................................1.....................................................................................................................................................................................Hrpt-xcv1? tUiTl j 黄单I龜齡i
I I IrpFxcv I Mn、 I~~
IhpFxoo
[0090]注:XCV-野由菜黄单胞菌辣椒斑点病致.病变种，XOO-水稻黄单胞菌水稻致病变种
[0091]根据一具体的实施方式，野生型青枯雷尔氏菌HrpY多肽如SEQ ID NO:14所示。
[0092]根据另一实施方式，青枯雷尔氏菌HrpY多肽包含如SEQ ID N0:70_86所示的变体。
[0093]根据一具体的实施方式，野生型丁香假单胞菌HrpA多肽如SEQ ID NO:19所示。
[0094]根据一具体的实施方式，野生型解淀粉欧文氏菌HrpA多肽如SEQ ID NO:88所示。
[0095]根据一具体的实施方式，野生型野油菜黄单胞菌HrpE多肽如SEQ ID NO:90所示。
[0096]根据一具体的实施方式，野生型白叶枯黄单孢菌HrpE多肽如SEQ ID NO:92所示。
[0097]根据另一实施方式，T3SS蛋白是易位子蛋白，如青枯雷尔氏菌易位子蛋白PopFl或 PopF2 (分别为 SEQ IDNO:67 和 69)。
[0098]根据一具体的实施方式，野生型亚洲梨火欧文氏菌HrpA多肽如SEQ ID NO:100所不。
[0099]本文使用的短语“显性负性T3SS蛋白”是指具有结构改变的基因产物的T3SS蛋白，所述基因产物能与细菌分泌的野生型T3SS蛋白相互作用，但介导功能失调的针状复合物的形成(例如，不能穿透宿主细胞，无法转运效应器蛋白进入宿主细胞，或与野生型蛋白相比，能力下降)。细菌功能失调的针状复合物可以是结构变形(例如，部分或完全被阻断或变形，从而使得它不能转运效应蛋白至宿主细胞)，或可部分组装或根本没组装。通常情况下，本发明的显性负性T3SS蛋白能降低细胞的感染性和致病性。测定感染性的方法为本领域所熟知。
[0100]因此，显性负性T3SS蛋白降低了针状复合形物组装和/或功能，因此，与具有由野生型T3SS蛋白组成的针状结构的细菌相比，致病性细菌的感染性降低约5%，约10%，约20%，约 30%，约 40%，约 50%，约 60%，约 70%，约 80%，约 90%或约 100%。
[0101]值得注意的是，根据一个具体的实施方式，显性负性蛋白由植物细胞外源地表达至细菌。
[0102]通常情况下，显性负性T3SS蛋白由基因编码，所述基因在野生型蛋白编码序列中包含一个或多个突变，如插入突变，缺失突变或取代突变。这些突变可包含野生型T3SS蛋白的单个核酸的改变(例如，包括β阻断氨基酸，如脯氨酸或其合成类似物)，或者可以包含2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25或更多的核酸改变。另外，突变可以包括在T3SS蛋白中，单一肽的插入(3，4，5，10个氨基酸长)，或若干肽的插入(例如，五肽插入)。
[0103]可实施于本发明肽的示例性单氨基酸突变，包括在HrpA基因23位的甘氨酸被丙氨酸取代，HrpA基因54位的丙氨酸被谷氨酸取代，HrpA基因93位的赖氨酸被异亮氨酸取代，HrpA基因95位的门冬氨酸被丝氨酸取代，HrpA基因101位的异亮氨酸被苏氨酸取代，HrpA基因111位的异亮氨酸被脯氨酸取代。
[0104]可插入本发明所述肽的不例性的五肽插入如SEQ ID NO:20-65所不(参见下表2)。
[0105]可以理解的是，T3SS基因中任何位点的突变都可能生成显性负性蛋白。对于HrpA基因，描述了核酸插入和缺失的示例性位点，参见下文的图8和表2[来自Taira等，MolMicrobiol.(1999)34(4):737_44，并且并入本文]。
[0106]如前所述，根据具体的实施方式，本发明的显性负性T3SS蛋白保留了蛋白-蛋白相互作用位点，这使得它能够以高亲和力与同源的野生型细菌蛋白结合并形成针状结构，但是，由于显性负性蛋白中的突变，所得到的针状结构功能失调。
[0107]因此，本发明考虑了能使针状复合物功能失调的T3SS基因中或对T3SS基因的任何突变。
[0108]根据本发明的一个实施方式，插入突变包括嵌入闭锁元件(IBE)。包含IBE的显性负性T3SS蛋白通常与同源蛋白形成亚基-亚基相互作用，同时整合入翻译水平上融合的通道-闭锁元件(例如，肽)或使T3SS蛋白结构变形(例如HrpY α-螺旋)，从而阻止细菌效应器从细菌分泌至植物细胞中(参见，下文实施例部分的实施例1)。
[0109]根据本发明这方面的一个实施方式，所述核酸序列编码如SEQ ID NO:2，4，6，8，10或12所示的肽。
[0110]根据另一实施方式，通过与不成熟的针相互作用，显性负性T3SS蛋白能够阻断T3SS组装(例如，显性负性易位子蛋白提前与针相互作用，从而干扰T3SS组装并使其失活(参见下文实施例部分的实施例3)。
[0111]表2:示例性五肽插入和HrpA基因中核酸插入和缺失的位点
[0112]
【权利要求】
1.一种核酸表达载体，所述核酸表达载体包含核酸序列和顺式作用调控元件,所述核酸序列编码显性负性T3SS蛋白，所述顺式作用调控元件能够驱动所述核酸序列在植物细胞中转录，所述显性负性T3SS蛋白介导功能失调的针状复合物的组装。
2.根据权利要求1所述的核酸表达载体,其中所述核酸序列包含SEQID NO:1,3,5,7,9 或 11。
3.根据权利要求1所述的核酸表达载体,其中所述核酸序列包含SEQID NOs:20_65。
4.根据权利要求1或2所述的核酸表达载体，其中所述核酸序列编码如SEQID NO:2,4，6，8，10或12所示的多肽。
5.根据权利要求1所述的核酸表达载体,还包含附加核酸序列,所述附加核酸序列编码所述核酸序列的内质网信号肽上游。
6.根据权利要求1所述的核酸表达载体，其中所述顺式作用调控元件包含启动子序列。
7.根据权利要求6所述的核酸表达载体，其中所述启动子序列是组成型启动子。
8.根据权利要求7所述的核酸表达载体，其中所述组成型启动子是CaMV35S启动子。
9.根据权利要求1所述的核酸表达载体，其中所述显性负性T3SS蛋白通过引入突变而产生，所述突变选自插入突变、缺失突变和取代突变。
10.根据权利要求9所述的核酸表达载体，其中所述插入突变包含嵌入闭锁元件。
11.根据权利要求1所述的核酸表达载体，其中所述T3SS蛋白是T3SS结构蛋白。
12.根据权利要求11所述的核酸表达载体，其中所述T3SS结构蛋白是HRP蛋白。
13.根据权利要求1所述的核酸表达载体，其中所述T3SS蛋白选自青枯雷尔氏菌HrpY蛋白，丁香假单胞菌HrpA蛋白，解淀粉欧文氏菌HrpA蛋白，野油菜黄单胞菌HrpE蛋白，亚洲梨火欧文氏菌HrpA蛋白和白叶枯黄单胞菌HrpE蛋白。
14.根据权利要求1所述的核酸表达载体，其中所述T3SS蛋白是青枯雷尔氏菌易位子蛋白。
15.根据权利要求14所述的核酸表达载体，其中所述青枯雷尔氏菌易位子蛋白选自PopFl 和 PopF2。
16.包含核酸序列的分离的多核苷酸，所述核酸序列编码SEQID NO:2，4，6，8，10或12。
17.包含如权利要求16所述的多核苷酸的核酸表达载体。
18.包含如权利要求1-15或17中任意一项所述的核酸表达载体的宿主细胞。
19.根据权利要求18所述的宿主细胞是植物细胞。
20.包含如权利要求1-15中任意一项所述的核酸表达载体的基因修饰植物。
21.表达外源多核苷酸的基因修饰植物，所述外源多核苷酸编码如SEQID NO:2,4,6,8，10或12所示的显性负性T3SS蛋白。
22.根据权利要求20所述的基因修饰植物，其中所述植物与未修饰的植物相比，包含针对细菌病原体的增强的抗性。
23.生成植物的方法，所述植物与未修饰的植物相比，包含针对细菌病原体的增强的抗性，所述方法包括将根据权利要求1-15中任何一项所述的核酸表达载体引入植物或植物细胞，由此生成的植物与未修饰的植物相比，包含针对细菌病原体的增强的抗性。
24.评价植物针对细菌病原体的抗性的方法，所述方法包括: (a)在植物中表达外源核酸序列和顺式作用调控元件，所述外源核酸序列编码显性负性T3SS蛋白，所述顺式作用调控元件能够驱动所述核酸序列在植物细胞中转录； (b)使细菌病原体作用于所述植物；和 (c)比较所述植物和野生型植物的疾病，所述野生型植物被培养于相同条件下并被所述细菌病原体感染，由此评价所述植物针对所述细菌病原体的抗性。
25.根据权利要求22，23或24所述的基因修饰植物或方法，其中所述细菌病原体是革兰氏阴性菌。
26.根据权利要求25所述的基因修饰植物或方法，其中所述革兰氏阴性菌选自青枯雷尔氏菌，丁香假单胞菌，解淀粉欧文氏菌，野油菜黄单胞菌和白叶枯黄单胞菌。
27.根据权利要求25所述的基因修饰植物或方法，其中所述革兰氏阴性菌是变形菌种。
28.根据权利要求27所述的基因修饰植物或方法，其中所述变形菌是青枯雷尔氏菌。
29.根据权利要求20，21，23或24所述的基因修饰植物或方法，其中所述植物选自作物植物，装饰植物和树。
30.根据权利要求20，21，23或24所述的基因修饰植物或方法，其中所述植物是茄科植物。
31.根据权利要求20，21，23或24所述的基因修饰植物或方法，其中所述植物选自番茄植物，马铃薯植物，茄植物，香蕉植物，甜椒植物，橄榄植物，苹果植物，梨植物，火棘植物，海棠植物，山楂植物，枸子植物，榲梓植物，花楸植物，拟南芥植物，天竺葵，姜植物，烟草植物及桉树植物。
32.根据权利要求20，21，23或24所述的基因修饰植物或方法，其中所述植物是番茄植物。
【文档编号】C12N15/82GK103597078SQ201280021463
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年3月1日 优先权日:2011年3月2日
【发明者】哈南·施泰因, 德罗尔·阿维萨尔 申请人:富途锐基尼以色列有限公司