寡糖转移酶催化的天冬酰胺连接的糖基化的组分的合理设计的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于鉴定或设计用于寡糖转移酶(OST)-催化的天冬酰胺-连接(“N-连接”)的糖基化的(a)潜在寡糖供体、(b)潜在寡糖转移酶(OST)、(c)潜在共有序列基序多肽和/或(d)潜在糖基化抑制剂的方法，其包括生成红嘴鸥弯曲杆菌的寡糖转移酶(OST)的催化结构域和/或多肽结合位点的三维模型和设计或选择选自(a)至(d)的潜在组分(其优化所述一种或多种三维模型和潜在组分的立体化学互补性)的步骤。
【专利说明】寡糖转移酶催化的天冬酰胺连接的糖基化的组分的合理设计
发明领域
[0001]本发明涉及用于鉴定或设计用于寡糖转移酶(OST)-催化的天冬酰胺-连接(“N-连接”)的糖基化的(a)潜在寡糖供体、(b)潜在寡糖转移酶(OST)、(C)潜在共有序列基序多肽和/或(d)潜在糖基化抑制剂的方法，其包括生成红嘴鸥弯曲杆菌{Campylobacter lari)的寡糖转移酶(OST)的催化结构域和/或多肽结合位点的三维模型和设计或选择选自(a)至(d)的潜在组分(其优化所述三维模型和潜在组分的立体化学互补性)的步骤。
[0002]发明相关背景
据估计，所有真核细胞蛋白的超过一半是糖蛋白，这意味着特定氨基酸侧链被碳水化合物化学修饰。这些修饰丰度最高的形式是天冬酰胺连接(“N-连接”)的糖基化，这影响范围从蛋白折叠、质量控制、分选和分泌到生物体发育和宿主-病原体相互作用的多种细胞功能。面向内质网(ER)内腔的天冬酰胺当位于共有“序列肽段”Asn-X-Ser/Thr(其中X可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸)中时特别被糖基化。该反应发生在ER周围的膜处，并且被嵌入在高等真核细胞的ER膜中的酶寡糖转移酶(OST)异源寡聚蛋白复合体所催化(参见图1b)。N-连接的糖基化的一个标志是其对于多肽底物的广泛特异性，这是短识别序列肽段的直接结果。该特征使OST区别于糖基转移酶，所述糖基转移酶修饰丝氨酸或苏氨酸残基(O-连接的糖基化)，并且表现出对其蛋白底物的较高特异性。
[0003]OST-催化的糖基化中的关键步骤是在受体天冬酰胺的酰胺氮和脂质连接的寡糖(LLO)供体的第一糖部分的Cl碳之间形成N-糖苷键(参见图1a)。这导致寡糖整体转移到受体天冬酰胺上。潜在反应机制的详细信息知之甚少。这不仅是由于缺乏在高分辨率下对OST的结构深度理解所导致的，而且是由于LLO底物的复杂化学性质、其在生物样品中的低丰度和其在水中的不溶性导致的。相比之下，已经公开了各种可溶性O-糖基转移酶的晶体结构，并且详细研究了它们的反应机制。对于0ST，目前接受的模型表明，糖基化序列肽段当位于未折叠的蛋白区段中时被识别，这可以发生在蛋白易位到ER的过程中或易位完成后发生。OST内的核心催化活性组分是STT3亚基，而其他亚基被认为通过促进OST复合体装配或通过与受体蛋白的子集或LLO底物相互作用，导致可进入和修饰的糖基化位点的数目增加，从而协助和改善该过程 。
[0004]N-连接的糖基化不限于真核生物。同源过程在古菌和变形菌的确定分类群中被发现。然而，原核生物和真核生物动粒含有单一亚基OST酶，其与高等真核生物的STT3亚基同源。研究最好的原核生物的N-糖基化过程由来自细菌空肠弯曲菌iPampylobacterjejuni)的蛋白糖基化基因座pgl所介导(Szymanski等人.(1999) MolecularMicrobiology 32，1022 - 1030)。该基因座包含与真核生物STT3共有明显序列相似性的被称为PgIB的内在膜蛋白，表明共同的膜拓扑结构和反应机理(参见图lb)。该基因簇对于当转移到大肠杆菌细胞中时催化蛋白糖基化是足够的。含有序列肽段的蛋白底物的OST-催化的原核生物蛋白糖基化是糖基化重组产生的蛋白的经济、有效和便捷的方式(Wacker等人(2002)，Science 298，1790-1793)。可以在大肠杆菌中用非空肠弯曲菌来源的不同O抗原脂多糖结构工程改造N-连接的蛋白糖基化(Feldman等人(2005) PNAS102(8)，3016-3021)，因此允许将真核细胞N-聚糖原核转移至重组蛋白底物。Glover等人(2005, Chemistry & Biology 12, 1311-1315)首次证明使用包含过表达的PgIB和焦磷酸i 异戍二烯酯结合的寡糖的大肠杆菌细胞膜的体外蛋白糖基化。在2006年,Kowarik等人.(2006，EMBO J.25(9)，1957-1966)进一步定义了细菌N-糖基化位点共有序列肽段序列，其显示细菌OST的底物特异性延伸到在受体天冬酰胺的-2位带负电荷的氨基酸，导致共有序列肽段Asp/Glu-X1-Asn-X^Ser/Thr (其中X1和X2都不是脯氨酸；SEQ ID NO: 3)。通过使用肽底物文库，Chen等人(2007，Biochemistry 46, 5579 -5585)验证了受体天冬酰胺的-2位负电荷的必要性，并且将序列DQNAT (SEQ ID N0:4)鉴定为空肠弯曲杆菌PgIB的最佳底物。[0005]根据上述，结论就是原核生物寡糖转移酶(OST)对于蛋白底物具有广泛特异性(因为基于小序列肽段)，并且可以用来转移真核、原核以及合成的N-聚糖。基本上，基于原核OST的N-糖基化系统需要三个组分，(a)寡糖供体，优选脂质或焦磷酸十一异戊二烯酯连接的寡糖供体、(b)原核寡糖转移酶(OST)、(c)潜在共有序列基序多肽底物，和最后但并非不重要的合适的生理微环境，例如体外或体内的细胞膜。
[0006]作为本信息基础的问题是，人们无法超越对于已知OST组分提供的信息预测或设计对于非常有效的基于原核OST的N-糖基化系统必需的组分。此外，没有任何关于潜在OST糖基化抑制剂必须具有何种结构要求的线索。预计这种抑制剂将具有显著的生物学效应，并且可能具有巨大的医疗、诊断和科学价值。另一个问题是，到目前为止，还不可能提供可以为科学界提供关于参与OST-介导的糖基化的组分的可能变化的深刻理解的OST的催化结构域和多肽结合位点的三维模型。
[0007]上述问题已经通过提供与受体六肽DQNATF (SEQ ID NO:5)复合的细菌OST(来自红嘴鸥弯曲杆菌的PgIB蛋白(与空肠弯曲菌的PgIB共有56%序列同一性))的三维X射线结构而得到解决。红嘴鸥弯曲杆菌PgIB当与空肠弯曲杆菌/^7簇在大肠杆菌细胞中共表达时是活性的，正如含有共有序列肽段的受体蛋白的糖基化所证明的(参见图2)。对于其结构分析，红嘴鸥弯曲杆菌PgIB与含有在体内分析中被糖基化的序列肽段的六肽DQNATF(SEQ ID NO:5)进行共结晶，所述六肽DQNATF (SEQ ID NO:5)已经被鉴定为红嘴鸥弯曲杆菌PgIB的最佳受体序列(参见上文Chen等人)。红嘴鸥弯曲杆菌PgIB (712个氨基酸残基，SEQ ID NO:1)的结构使用实验阶段和分子替换的组合，利用先前确定的红嘴鸥弯曲杆菌PgIB的周质结构域的结构进行确定。PgIB的共晶体是小的易碎的，并且各向异性地X射线衍射，最佳天然数据延伸到3.4 A分辨率。该结构被定义为分别23.8和27.1 %的R/Rftee值(表2)。红嘴鸥弯曲杆菌PgIB的结构的进一步详情提供在下面的实验部分。
[0008]这种新的三维结构为序列肽段识别提供分子基础的深刻理解，并且揭示了蛋白的跨膜结构域和保守的特征、酸性侧链残基和结合的二价阳离子形成的催化位点。这些结果首次表明酰胺氮活化和糖基化的机制，并且提供了用于鉴定和设计新的寡糖供体、新的寡糖转移酶变体(OST)、新的共有序列基序多肽以及OST糖基化抑制剂(所有这些可用于重组糖蛋白生产、诊断、医学和作为科学工具)的合理方法。
[0009]鉴于上述情况，本发明的第一个方面涉及用于鉴定寡糖转移酶(OST)-催化的天冬酰胺-连接(“N-连接”)的糖基化的潜在组分的方法，所述潜在组分选自
(a)潜在寡糖供体，优选脂质-连接的寡糖(LLO)或焦磷酸十一异戊二烯酯(undecaprenyl pyrophosphate)结合的寡糖供体，
(b)潜在寡糖转移酶(OST)，
(c)潜在共有序列基序多肽，和
(d)潜在糖基化抑制剂，
所述方法包括步骤 (i)使用表1的原子坐标(距离骨架原子优选±2A、更优选±1.5A、最优选±1.0 A均方根偏差(rmsd))用于生成红嘴鸥弯曲杆菌的寡糖转移酶(OST)的催化结构域的三维模型，所述催化结构域包含氨基酸D56、R147、D154、D156、E319、R375、Y468、和H485中的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、最优选所有氨基酸,和/或,优选并且
(?)使用表1的原子坐标(距离骨架原子优选±2A、更优选±1.5A、最优选±1.0 A均方根偏差(rmsd))用于生成红嘴鸥弯曲杆菌的寡糖转移酶(OST)的多肽结合位点的三维模型，所述多肽结合位点包含氨基酸1318、1?331、1463、1464、0465、和1572中的至少一个、两个、三个、四个、五个、最优选所有氨基酸，
(iii)优选在(i)和/或(ii)的三维模型的氨基酸的坐标上进行全身平移和/或旋
转，
(iv)使用所述(i)、(ii)和/或(iii)的三维模型用于设计或选择潜在组分(a)至(d)中的至少一种，
(v)提供所述潜在组分(a)至(d)中的至少一种，和
(vi)将所述潜在组分(a)至⑷中的至少一种与对于寡糖转移酶(OST)-催化的天冬酰胺-连接(“N-连接”)的糖基化必需的进一步功能组分接触，
(vii)鉴定选自以下的功能组分
(A)功能性寡糖供体，优选功能性脂质-连接的寡糖(LLO)供体或焦磷酸十一异戊二烯酯结合的寡糖供体，
(B)功能性寡糖转移酶(OST)，
(C)功能性共有序列基序多肽，和
(D)功能性糖基化抑制剂。
[0010]在一个优选的实施方案中，在步骤(ii)中，红嘴鸥弯曲杆菌的寡糖转移酶(OST)的多肽结合位点的三维模型包含氨基酸13183331、1463、胃464、0465和1572中的至少两个、优选至少三个、更优选至少四个、最优选所有氨基酸。
[0011]用于本发明方法中的表1的原子坐标显示在图7中。红嘴鸥弯曲杆菌的OST的X-射线坐标，特别是与优化多肽底物DQNAT (SEQ ID NO:4)复合的催化位点和/或多肽结合位点的X-射线坐标，为技术人员提供了对于鉴定对于OST催化和催化抑制的潜在组分必需的三维信息。参与催化作用和多肽结合的氨基酸的个别原子的空间限制组合化学功能性质，例如，电子密度、范德华力位置、离子相互作用、疏水性相互作用等为技术人员在以下的结构和空间先决条件的计算机辅助分子建模中提供了信息:(a)潜在寡糖供体，优选脂质连接的寡糖(LLO)或焦磷酸十一异戊二烯酯结合的寡糖供体；(b)潜在寡糖转移酶(OST)，(c)潜在共有序列基序多肽，和/或(d)潜在糖基化抑制剂。[0012]如前所述，细菌OST对于寡糖供体分子具有广泛特异性。使用本发明的坐标信息和方法，可以合理设计有用的寡糖供体的所有组成成分并且延伸，而不必回复到试验和错误的合成策略。此外，在不使催化位点和多肽结合口袋变得没有功能的情况下，OST本身可以合理变化。该OST变化是有用的，例如用于修饰OSTs的催化潜力、多肽的底物特异性和/或寡糖供体特异性。此外，多肽寡糖受体的共有基序可以合理变化并且进行设计，从而导致扩大OST实用性，诸如例如真核生物位点的糖基化。最后但并非最不重要的，本发明的三维X射线模型为设计潜在糖基化抑制剂提供了优异基础，可以预期所述潜在糖基化抑制剂通过中断、修饰或减慢OST活性而具有生理活性。这些抑制剂具有提供科学、诊断和治疗工具的很大潜力。 [0013]术语“均方根偏差”或“ rms偏差”或“ rmsd”是指距离平均值的偏离的平方的算术平均值的平方根。在原子对象的背景下，数值可以以埃(A)给出。它是表达距离趋势或对象的偏差或变化的一种方式。
[0014]本发明方法包括以下步骤:使用表1的原子坐标(距离骨架原子优选土2、更优选土1.5、最优选土1.0 A均方根偏差(rmsd))用于生成红嘴鸥弯曲杆菌的寡糖转移酶(OST)的催化结构域的三维模型，所述催化结构域包含氨基酸D56、R147、D154、D156、E319、R375、Y468、和H485中的至少一个、两个或三个、优选至少四个、更优选至少五个或六个、最优选七个或所有氨基酸，和/或，优选并且
使用表1的原子坐标(距离骨架原子优选±2A、更优选±1.5A、最优选±1.0 A均方根偏差(rmsd))用于生成红嘴鸥弯曲杆菌的寡糖转移酶(OST)的多肽结合位点的三维模型，所述多肽结合位点包含氨基酸M318、R331 (或A331)、W463、W464、D465、和1572中的至少一个或两个、优选至少三个、更优选至少四个或五个、最优选所有氨基酸。
[0015]在多肽结合位点，W463、W464和D465与结合的受体序列肽段中T的β -羟基形成强氢键。这些残基强烈贡献受体序列肽段结合，并且是为何S或T位于受体天冬酰胺(N-X-S/T)的+2位的原因。R331形成与受体多肽的带负电荷D的盐桥，并且因此贡献受体序列肽段结合。R331负责受体天冬酰胺的-2位的带负电荷的氨基酸的要求，并且负责延伸共有序列肽段用于细菌N-连接的蛋白糖基化(D/E-XfN-XfS/T; SEQ ID N0:3)(图4a)。R331只有在细菌OST中保守，并且可以充当用于将PgIB的底物特异性改变朝向识别真核细胞糖基化位点的目标。事实上，当R331被突变为A时，获得的受体蛋白中的糖基化位点AQNAT (SEQ ID NO:8)，例如初始含有序列肽段DQNAT (SEQ ID NO:4)的修饰的scFv片段3D5可以被糖基化，而该位点不充当野生型酶的底物(图4b)。
[0016]在催化位点，D56、D154和E319似乎负责协调对于催化关键的结合的二价金属离子。更重要地，D56和E319与结合的受体序列肽段的天冬酰胺侧链的酰胺基形成氢键。该相互作用引起酰胺基中C-N键的旋转，这对于氮的亲核活化是重要的。D156和R147稳定氢键键合网络，并且R375复合结合的脂质连接的寡糖(LLO)的磷酸酯之一的负电荷。
[0017]例如，在多肽结合位点中，W463、W464和D456可以被两个H和一个E替代(WffD —HHE) 0为了保持受体天冬酰胺的-2位中负电荷的要求，R331可以被K替代。为了在该位置产生正电荷的要求，R331可以被D或E替代。为了克服受体天冬酰胺的-2位中负电荷的要求，R331可以被A替代(图4)。在催化位点，D154和D156可以各自被E替代。分别地，E319可以被D替代，并且D56可以被E替代(见下文)。为了修饰PgIB活性，例如，D56、D154和E319可以被丙氨酸或相应的氨基官能团(N或Q)替代。H485可以被W替代，因为W在真核生物OST的该位置处出现。
[0018]如图7表1中列出的来自红嘴鸥弯曲杆菌的PgIB的结构坐标对于技术人员而言可以从Pdb数据库下载获得。(结构生物信息学研究合作实验室(RCSB)蛋白数据库(PDB))。在计算机和可自由获得的结构程序诸如PyMOL或商业上可获得的结构程序的帮助下，技术人员可以很容易地生成可用于要求保护的方法的三维模型。
[0019]本领域技术人员将理解，蛋白、蛋白/底物或蛋白/抑制剂复合物或其部分的结构坐标集合是定义三维形状的点的相对集合。因此，可能完全不同的坐标集可以定义相似或相同的形状。出于这个原因，优选在从表1的原子坐标获得的三维模型(i)和/或(ii)的氨基酸的坐标上进行全身平移和/或旋转。这些坐标变化可以通过数学运算结构坐标，例如，通过晶体排列结构坐标而运算，部分或矩阵运算为结构坐标集或任何以上的组合而生成。
[0020]接下来，上述生成的三维模型用于设计或选择OST糖基化的潜在组分中的至少一种或潜在抑制剂。各种计算机分析对于确定分子诸如特定寡糖供体、修饰的0ST、寡糖受体共有序列基序多肽或糖基化抑制剂是否充分设计以合理地预测它在OST-催化的反应中的功能性是必要的。将不得不进行空间、功能和化学考虑诸如性质、原子位置、合理的旋转自由度、电子密度、空间位阻、范德华力、离子和疏水相互作用等。这种分析可以通过标准软件应用诸如 CCP4 方便地实施(COLLABORATIVE COMPUTATIONAL PROJECT, NUMBER 4.1994.The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography'J.Acta Cryst.D50，760-763.) o
[0021]现有计算机 分子相似性应用允许不同结构、相同结构的不同构象和相同结构的不同部分之间的比较。比较程序通常分为四个步骤:(I)加载结构信息，⑵定义这些结构上的原子等效物，(3)执行拟合(叠加)操作和(4)分析结果。各结构通过名称标识。然后一个结构标识为潜在OST组分或OST抑制剂(即目标或固定结构)，所有剩余的结构是工作结构(即移动结构)。当使用刚性拟合方法时，将工作结构平移和旋转以获得与目标结构的最佳拟合(空间和功能互补性)，例如，OST抑制剂是固定结构并且将OST氨基酸平移和旋转以获得最佳拟合。拟合操作使用一种计算出最佳平移和旋转以应用到移动结构的算法，从而使得对等效原子的指定对的拟合的rmsd是绝对最小值。将两种结构叠加后，可以计算出对于等效原子的特定集合的rmsd值。
[0022]如上所述根据本发明方法选择或设计的OST反应的潜在功能组分或抑制剂将为技术人员当验证其在常规OST活性测定中的功能性时提供合理的成功预期。出于所述目的，潜在组分必须通过购买、修改购买的材料、化学和/或重组合成等来提供。然后该潜在组分将必须与对于OST-催化的天冬酰胺-连接(“N-连接”)的糖基化必需的进一步功能组分接触，当然在允许OST活性的条件下。优选OST活性测定描述于(I) 2005 Chemistry &Biology 12， 1311-1315， (2) 2006 Science 314， 1148-1150， (3) 2007 Biochemistry46， 5579-5585， (4) 2007 Glycobiology 11， 1175-1182 和(5) 2011 Glycobiology 5，575-583。潜在组分或抑制剂是否具有OST活性优选通过与阳性或阴性标准品比较来验证。例如，OST测定的功能性使用已知寡糖受体多肽例如六肽DQNATF (SEQ ID N0:5)来建立，然后用潜在功能性共有序列基序多肽取代六肽，并且确定取代多肽的糖基化。该简单OST测定系统可调整用于鉴定任何功能性OST组分，优选选自以下的OST组分:(A)功能性寡糖供体，优选功能性脂质连接的寡糖(LLO)或焦磷酸^^一异戍二烯酯连接的寡糖供体，(B)功能性寡糖转移酶(OST)，(C)功能性共有序列多肽，和(D)功能性糖基化抑制剂。
[0023]在第二个方面，本发明涉及用于设计寡糖转移酶(OST)-催化的天冬酰胺-连接(“N-连接”)的糖基化的潜在组分的方法，所述潜在组分选自(a)潜在寡糖供体，优选脂质-连接的寡糖(LLO)或焦磷酸^^一异戍二烯酯(undecaprenyl pyrophosphate)结合的寡糖供体，(b)潜在寡糖转移酶(OST)，(c)潜在共有序列基序多肽，和(d)潜在糖基化抑制剂，其包括步骤
(i)使用表1的原子坐标(距离骨架原子优选土2、更优选±1.5、最优选±1.0A均方根偏差(rmsd))用于生成红嘴鸥弯曲杆菌的寡糖转移酶(OST)的催化结构域的三维模型，所述催化结构域包含氨基酸D56、R147、D154、D156、E319、R375、Y468、和H485中的至少一个、两个或三个、优选至少四个或五个、更优选至少六个或七个、最优选所有氨基酸，和/或，优选并且
(ii)使用表1的原子坐标(距离骨架原子优选土2、更优选±1.5、最优选±1.0 A均方根偏差(rmsd))用于生成红嘴鸥弯曲杆菌的寡糖转移酶(OST)的多肽结合位点的三维模型，所述多肽结合位点包含氨基酸M318、R331、W463、W464、D465、和1572中的至少一个或两个、优选至少三个、更优选至少四个或五个、最优选所有氨基酸，
(iii)优选在(i)和/或(ii)的三维模型的氨基酸的坐标上进行全身平移和/或旋
转， (ii1.D使用所述和/或(iii)的三维模型用于评价所述三维模型和/或(iii)和选自寡糖供体、优选脂质连接的寡糖(LLO)供体或焦磷酸十一异戊二烯酯结合的寡糖供体、共有序列基序多肽和潜在糖基化抑制剂的寡糖转移酶(OST)-催化的天冬酰胺-连接(“N-连接”)的糖基化的已知或潜在组分之间的立体化学互补性，或者
(ii1.2)改变所述(i)、(ii)和/或(iii)的三维模型中的至少一个氨基酸并且使用所述改变的(i)、(?)和/或(iii)的三维模型用于评价所述三维模型(i)、(?)和/或
(iii)和选自寡糖(LLO)供体、优选脂质连接的寡糖(LLO)供体或焦磷酸十一异戊二烯酯结合的寡糖供体、共有序列基序多肽和潜在糖基化抑制剂的寡糖转移酶(OST)-催化的天冬酰胺-连接(“N-连接”)的糖基化的已知或潜在组分之间的立体化学互补性，
(iv)以迭代方法通过观察(ii1.1)、(ii1.2)的三维模型或寡糖转移酶(OST)-催化的天冬酰胺-连接(“N-连接”)的糖基化的组分的变化优化所述立体化学互补性，
(v)设计选自(a)至(d)的潜在组分，其优化所述三维模型和潜在组分的所述立体化学互补性，
(v1.1)任选地提供优化的潜在组分，和
(v1.2)将所述潜在组分(a)至(d)中的至少一种与对于寡糖转移酶(OST)-催化的天冬酰胺-连接(“N-连接”)的糖基化必需的进一步功能组分接触，
(v1.3)鉴定选自以下的功能组分
(A)功能性寡糖供体，优选功能性脂质连接的寡糖(LLO)或焦磷酸十一异戊二烯酯结合的寡糖供体，(B)功能性寡糖转移酶(OST)，(C)功能性共有序列基序多肽，和(D)功能性糖基化抑制剂。[0024]在一个优选的实施方案中，在步骤(ii)中，红嘴鸥弯曲杆菌的寡糖转移酶(OST)的多肽结合位点的三维模型包含氨基酸13183331、1463、胃464、0465和1572中的至少两个、优选至少三个、更优选至少四个、最优选所有氨基酸。
[0025]该方法与第一个方面的方法基本上非常类似，除了在刚刚上面的方法中，潜在OST组分通过以下来设计:当改变至少一种所述三维模型中的至少一个氨基酸时，在有或没有全身平移和旋转的情况下以迭代方法通过观察三维模型或寡糖转移酶(OST)-催化的天冬酰胺-连接(“N-连接”)的糖基化的组分的变化来优化其与所述三维模型的立体化学互补性。
[0026]一旦基于其与所述三维模型的优化的立体化学互补性选择设计的潜在OST组分，其可以任选在OST测定中进行验证，优选通过提供优化的潜在成分(通过化学和/或重组合成、购买、修饰已知化合物等)，将所述优化的潜在组分与对于寡糖转移酶(OST)-催化的天冬酰胺-连接(“N-连接”)的糖基化必需的进一步功能组分接触。在最后的任选步骤中，OST反应的功能性组分或其抑制剂通过其对OST反应的影响来鉴定。通常，阳性和阴性参考组分用来验证OST测定活性。
[0027]在本发明用于鉴定或设计潜在OST组分的方法的优选的实施方案中，步骤(i)的特定三维催化位点模型进一步包含以下氨基酸的一个或多个，优选至少5个，更优选至少10个，最优选所有，所述氨基酸选自与SEQ ID NO:2的结合肽的范德华距离之内的残基，优选选自与所述肽的距离在5 A之内的氨基酸，更优选选自T53、T54、N55、D56、N146、R147、Y152、E315、T316、I317、M318、E319、V320、N321、R331、L374、R375、Y433、S435、V438、W463、W464、D465、G482、H485、1572、V575。
[0028]在进一步方面，本发明涉及机器可读介质，其包含，例如，存储
α)表1的原子坐标(距离骨架原子优选±2A、更优选±1.5A、最优选±1.0 A均方根偏差(rmsd))，优选包含氨基酸 D56、R147、D154、D156、E319、R375、Y468、和 H485 中的至少一个、两个或三个、优选至少四个或五个、更优选至少六个或七个、最优选所有氨基酸，和/或，优选和
(?)表1的原子坐标(距离骨架原子优选±2A、更优选土1.5A、最优选±1.0 A均方根偏差(rmsd))，其用于生成红嘴鸥弯曲杆菌的寡糖转移酶(OST)的多肽结合位点的三维模型，所述多肽结合位点包含氨基酸M318、R331 (或A331)、W463、W464、D465、和1572中的至少一个或两个、优选至少三个、更优选至少四个或五个、最优选所有氨基酸。
[0029](iii)优选地通过在⑴或(ii)的原子坐标上进行全身平移和/或旋转而修改的(i)或(ii)的原子坐标。
[0030]上述介质尤其可用于各种目的，诸如来自其他细菌的OSTs的计算机辅助的药物设计、药物发现和X射线晶体分析。
[0031]接下来，参照特定实施方案和实验进一步说明本发明，它们不应被理解为限制由所附权利要求提出的本发明的范围。
[0032]SEQ ID NO:1列出红嘴鸥弯曲杆菌PgIB的寡糖转移酶(OST)的712个氨基酸。
【权利要求】
1.用于鉴定寡糖转移酶(OST)-催化的天冬酰胺-连接(“N-连接”)的糖基化的潜在组分的方法，所述潜在组分选自 (a)潜在寡糖供体，优选脂质-连接的寡糖(LLO)或焦磷酸十一异戊二烯酯结合的寡糖供体， (b)潜在寡糖转移酶(OST)， (c)潜在共有序列基序多肽，和 (d)潜在糖基化抑制剂， 所述方法包括步骤 (i)使用表1的原子坐标，所述原子坐标距离骨架原子优选土2A、更优选±1.5 A、最优选土1.0 A均方根偏差(rmsd)，用于生成红嘴鸥弯曲杆菌的寡糖转移酶(OST)的催化结构域的三维模型，所述催化结构域包含氨基酸D56、R147、D154、D156、E319、R375、Y468、和H485中的至少三个、优选至少四个、更优选至少六个、最优选所有氨基酸，和/或，优选并且 (ii)使用表1的原子坐标，所述原子坐标距离骨架原子优选土2A、更优选±1.5 A、最优选土1.0 A均方根偏差(rmsd)，用于生成红嘴鸥弯曲杆菌的寡糖转移酶(OST)的多肽结合位点的三维模型，所述多肽结合位点包含氨基酸1318、1?331、1463、1464、0465、和1572中的至少两个、优选至少三个、更优选至少四个、最优选所有氨基酸， (iii)优选在(i)和/或(ii)的三维模型的氨基酸的坐标上进行全身平移和/或旋转， (iv)使用所述和/或(iii)的三维模型用于设计或选择潜在组分(a)至(d)中的至少一种， (v)提供所述潜在组分(a)至(d)中的至少一种，并且 (vi)将所述潜在组分(a)至⑷中的至少一种与对于寡糖转移酶(OST)-催化的天冬酰胺-连接(“N-连接”)的糖基化必需的进一步功能组分接触， (vii)鉴定选自以下的功能组分 (A)功能性寡糖供体，优选功能性脂质-连接的寡糖(LLO)或焦磷酸十一异戊二烯酯结合的寡糖供体， (B)功能性寡糖转移酶(OST)， (C)功能性共有序列基序多肽，和 (D)功能性糖基化抑制剂。
2.权利要求1的方法，其中在步骤(ii)中，红嘴鸥弯曲杆菌的寡糖转移酶(OST)的多肽结合位点的三维模型包含氨基酸13184331、1463、胃464、0465和1572中的至少两个、优选至少三个、更优选至少四个、最优选所有氨基酸。
3.用于设计寡糖转移酶(OST)-催化的天冬酰胺-连接(“N-连接”)的糖基化的潜在组分的方法，所述潜在组分选自 (a)潜在寡糖供体，优选脂质-连接的寡糖(LLO)或焦磷酸十一异戊二烯酯结合的寡糖供体， (b)潜在寡糖转移酶(OST)， (c)潜在共有序列基序多肽，和 (d)潜在糖基化抑制剂，所述方法包括步骤 (i)使用表1的原子坐标，所述原子坐标距离骨架原子优选土2 A、更优选±1.5 A、最优选土1.0 A均方根偏差(rmsd)，用于生成红嘴鸥弯曲杆菌的寡糖转移酶(OST)的催化结构域的三维模型，所述催化结构域包含氨基酸D56、R147、D154、D156、E319、R375、Y468、和H485中的至少三个、优选至少四个、更优选至少六个、最优选所有氨基酸，和/或，优选并且 (?)使用表1的原子坐标，所述原子坐标距离骨架原子优选±2Α、更优选±1.5Α、最优选±1.0 A均方根偏差(rmsd)，用于生成红嘴鸥弯曲杆菌的寡糖转移酶(OST)的多肽结合位点的三维模型，所述多肽结合位点包含氨基酸1318、1?331、1463、1464、0465、和1572中的至少两个、优选至少三个、更优选至少四个、最优选所有氨基酸， (iii)优选在(i)和/或(ii)的三维模型的氨基酸的坐标上进行全身平移和/或旋转， (ii1.D使用所述和/或(iii)的三维模型用于评价所述三维模型和/或(iii)和选自寡糖供体、优选脂质连接的寡糖(LLO)或焦磷酸十一异戊二烯酯结合的寡糖供体、共有序列基 序多肽和潜在糖基化抑制剂的寡糖转移酶(OST)-催化的天冬酰胺-连接(“N-连接”)的糖基化的已知或潜在组分之间的立体化学互补性，或者 (ii1.2)改变所述(i)、(ii)和/或(iii)的三维模型中的至少一个氨基酸并且使用所述改变的(i)、(?)和/或(iii)的三维模型用于评价所述三维模型(i)、(?)和/或(iii)和选自寡糖(LLO)供体、优选脂质连接的寡糖(LLO)供体或焦磷酸十一异戊二烯酯结合的寡糖供体、共有序列基序多肽和潜在糖基化抑制剂的寡糖转移酶(OST)-催化的天冬酰胺-连接(“N-连接”)的糖基化的已知或潜在组分之间的立体化学互补性， (iv)以迭代方法通过观察(ii1.1)、(ii1.2)的三维模型或寡糖转移酶(OST)-催化的天冬酰胺-连接(“N-连接”)的糖基化的组分的变化优化所述立体化学互补性， (v)设计选自(a)至⑷的潜在组分，其优化所述一种或多种三维模型和潜在组分的所述立体化学互补性， (v1.1)任选地提供优化的潜在组分，和 (v1.2)将所述潜在组分(a)至(d)中的至少一种与对于寡糖转移酶(OST)-催化的天冬酰胺-连接(“N-连接”)的糖基化必需的进一步功能组分接触， (v1.3)鉴定选自以下的功能组分 (A)功能性寡糖供体，优选功能性脂质-连接的寡糖(LLO)或焦磷酸十一异戊二烯酯结合的寡糖供体， (B)功能性寡糖转移酶(OST)， (C)功能性共有序列基序多肽，和 (D)功能性糖基化抑制剂。
4.权利要求3的方法，其中在步骤(ii)中，红嘴鸥弯曲杆菌的寡糖转移酶(OST)的多肽结合位点的三维模型包含氨基酸13184331、1463、胃464、0465和1572中的至少两个、优选至少三个、更优选至少四个、最优选所有氨基酸。
5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中步骤(i)的特定三维催化位点模型进一步包含以下氨基酸的一个或多个，优选所有，所述氨基酸选自位于与SEQ ID N0:2的结合肽的范德华距离之内的残基，优选选自 Thr53、Thr54、Asn55、Asp56、Asnl46、Argl47、Tyrl52、Glu315、Thr316、Ile317、Met318、Glu319、Val320、Asn321、Arg331、Leu374、Arg375、Tyr433、Ser435、Val438、Trp463、Trp464、Asp465、Gly482、His485、Ile572、Val575。
6.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中步骤(i)的特定三维催化位点模型进一步包含以下氨基酸的一个或多个，优选所有，所述氨基酸选自位于与SEQ ID N0:2的结合肽的范德华距离之内的残基，优选选自 Thr53、Thr54、Asn55、Asp56、Asnl46、Argl47、Tyrl52、Glu315、Thr316、Ile317、Met318、Glu319、Val320、Asn321、Ala331、Leu374、Arg375、Tyr433、Ser435、Val438、Trp463、Trp464、Asp465、Gly482、His485、Ile572、Val575。
7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中所述潜在组分是寡糖供体(a)，优选脂质-连接的寡糖(LLO)或焦磷酸十一异戊二烯酯结合的寡糖供体。
8.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中所述潜在组分是寡糖转移酶(OST)(b)。
9.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中所述潜在组分是功能性共有序列基序多肽(C)。
10.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中所述潜在组分是糖基化抑制剂(d)。
11.机器可读介质，其包含 (i)表1的原子坐标，所述原子坐标距离骨架原子优选±2A、更优选±1.5 A、最优选土1.0 A 均方根偏差(rmsd)，优选包含氨基酸 D56、R147、D154、D156、E319、R357、Y468、和H485中的至少一个、两个或三个、优选至少四个或五个、更优选至少六个或七个、最优选所有氨基酸，和/或，优选和 (ii)表1的原子坐标，所述原子坐标距离骨架原子优选±2A、更优选±1.5 A、最优选±1.0 A均方根偏差(rmsd)，其用于生成红嘴鸥弯曲杆菌的寡糖转移酶(OST)的多肽结合位点的三维模型，所述多肽结合位点`包含氨基酸1318、1?331、1463、1464、0465、和1572中的至少一个或两个、优选至少三个、更优选至少四个或五个、最优选所有氨基酸， (iii)优选地，通过在(i)或(ii)的原子坐标上进行全身平移和/或旋转而修改的(i)或(ii)的原子坐标。
12.根据权利要求11的机器可读介质，其包含 (ii)表1的原子坐标，所述原子坐标距离骨架原子优选±2A、更优选±1.5A、最优选土1.0A均方根偏差(rmsd)，其用于生成红嘴鸥弯曲杆菌的寡糖转移酶(OST)的多肽结合位点的三维模型，所述多肽结合位点包含氨基酸M318、A331、W463、W464、D465、和1572中的至少一个或两个、优选至少三个、更优选至少四个或五个、最优选所有氨基酸。
【文档编号】C12Q1/48GK103620053SQ201280021372
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2012年5月3日 优先权日:2011年5月4日
【发明者】M.阿伊比, K.洛彻尔, C.里扎克 申请人:瑞士苏黎世联邦理工学院