一种能够提高非酶糖基化反应抑制率的蜜环菌发酵液的制备方法
【专利摘要】一种能够提高非酶糖基化反应抑制率的蜜环菌发酵液的制备方法，包括以下步骤：(1)斜面培养；(2)种子液的培养；(3)将蜜环菌种子液以4％的接种量接种到发酵培养基中，在28～32℃、摇床转速150转/分钟的条件下发酵培养2～4天；(4)调整摇床的温度，在22～25℃、摇床转速150转/分钟的条件下，继续发酵培养3～5天。本发明显著提升了蜜环菌发酵液对非酶糖基化反应的抑制率，为提高其他微生物发酵液的生物活性提供了一种新的方法，同时也为蜜环菌在发酵工业上的应用开发出一种新方向。
【专利说明】-种能够提高非酶糖基化反应抑制率的蜜环菌发酵液的制 备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物发酵领域，尤其是涉及一种能够提高非酶糖基化反应抑制率的 蜜环菌的发酵方法。
【背景技术】
[0002] 蜜环菌属于担子菌亚口、担子菌纲、伞菌目、白磨科蜜环菌属真菌，是一种食药兼 用的真菌，子实体及菌丝都可入药，具有疏风活络、强筋壮骨、明目等生理活性，民间常被用 于治疗癒痛、腰腿疼痛、俩傻病等。
[0003] 近年来，随着我国经济的持续发展和人民生活水平的迅速提高，糖尿病及其相关 的慢性并发症的发病率也在逐年上升，糖尿病所引起的并发症包括糖尿病肾病、视网膜病 变、糖尿病周围神经病变、牙周病和动脉粥样硬化等，已成为严重威胁人民健康和生命的常 见病和多发病。在引起糖尿病及其慢性并发症的诸多因素中，蛋白质非酶糖基化反应是重 要因素之一。因此，如何有效抑制非酶糖基化反应而达到防治糖尿病及其并发症是研究者 们近年来关注的热点。
[0004] 非酶糖基化反应是指由蛋白质、氨基酸等的游离氨基端与还原糖的撰基通过一系 列复杂的非酶促反应，最终生成不可逆的糖基化终末产物的过程。非酶糖基化反应不仅参 与了糖尿病的发生与发展，还与阿尔茨海默症、微血管病变等多种糖尿病并发症蜜切相关。 目前用于治疗非酶糖基化反应的药物主要包括合成药物和中药及食药用菌抑制剂。食药 用真菌在自然界分布广泛且资源丰富，多种食药用真菌已被证实具有抑制非酶糖基化的活 性，因此可用于治疗糖尿病及其并发症的重要来源。
[0005] 液体深层发酵是利用微生物合成生物产品的主要方式，一般的蜜环菌液态发酵采 用的发酵条件是在发酵起始便确定发酵温度直至发酵结束，但发酵温度对蜜环菌菌体的生 长和具有生物活性的产物的影响不同，因此限制了蜜环菌发酵液抑制非酶糖基化反应的能 力。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术存在的上述问题，本 申请人:提供了一种能够提高非酶糖基化反应抑 制率的蜜环菌发酵液的制备方法。本发明显著提升了蜜环菌发酵液对非酶糖基化反应的抑 制率，为提高其他微生物发酵液的生物活性提供了一种新的方法，同时也为蜜环菌在发酵 工业上的应用开发出一种新方向。
[0007] 本发明的技术方案如下：
[0008] -种能够提高非酶糖基化反应抑制率的蜜环菌发酵液的制备方法，包括W下步 骤：
[0009] (1)斜面培养：将蜜环菌接种于斜面培养基上，在3(TC下培养至菌丝体长满斜面；
[0010] (2)种子液的培养；将斜面中生长的蜜环菌菌体接种到种子培养基中，在3(TC、摇 床转速150转/分钟的条件下培养7天；
[0011] (3)将蜜环菌种子液W 4%的接种量接种到发酵培养基中，在28?32C、摇床转速 150转/分钟的条件下发酵培养2?4天；
[0012] (4)调整摇床的温度，在22?25C、摇床转速150转/分钟的条件下，继续发酵培 养3?5天D
[0013] 所述的斜面培养基的配方为葡萄糖20g/L、琼脂20g/L、马铃墓200g/L、 VB110Xl〇-3g/L，用自来水配置，12rc灭菌 15min。
[0014] 所述的种子培养基的配方为款皮15g/L、玉米粉20g/L、葡萄糖20g/L、M拆OJg/L， KH2P〇42g/L、酵母膏 3g/L、VB115X l〇-3g/L，用自来水配置，pH 自然，12rC灭菌 15min。
[0015] 所述的发酵培养基的配方为款皮15g/L、玉米粉15g/L、葡萄糖20g/L、M拆OJg/L， KH2P〇42g/L，用自来水配置，pH自然，12rC灭菌15min。
[0016] 优选的，步骤（3)的发酵温度为29C，发酵培养时间为3天，步骤（4)的发酵温度 为24C，发酵培养时间为4天。
[0017] 本发明有益的技术效果在于：
[0018] 本发明的基于温度分段控制的发酵策略，通过调控发酵温度，在不同时期分别满 足蜜环菌菌体生长和生物活性产物合成，最终提高了蜜环菌发酵液对非酶糖基化反应的抑 制率。本发明可W显著提升蜜环菌发酵液对非酶糖基化反应的抑制率，简单实用，便于批量 自动化生产，具有广阔的应用前景，为蜜环菌抑制非酶糖基化的研究作出重要的贡献。
【具体实施方式】
[0019] W下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用 于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0020] 其中，非酶糖基化反应抑制率（肥G)的测定方法如下：
[0021] 蛋白质体外NEG反应体系为己二酵、牛血清白蛋白和叠氮化轴按照质量浓度 12mg .HiL-IUOmg ^mL-I 和 2. Omg ^mL-I 分别溶于 0. 2mol .L-IKHaPOA-IyiPOA 磯酸缓冲液中（pH =7. 4)。量取待测样品液ImL与上述反应体系液ImL充分混合，W蒸觸水为空白对照样品， 于37C生化培养箱避光反应15d，反应结束后向反应液中补充蒸觸水至体积为lOmL。利用 英光光度计测定样品的英光强度，激发波长和发射波长分别为370nm和440nm，狭长分别为 Snm和6nm,计算公式如下：
[0022] I 二-~-XlOO % ( 1 ) 巧
[0023] 式中；1 ;肥G反应的抑制率；a ;蒸觸水英光强度（对照）；b ;待测样品英光强度。
[0024] 本发明所涉及到的蜜环菌（Armillaria mellea)购自中国普通微生物菌种保藏管 理中也，菌种编号为CGMCC 5. 146。
[0025] 实施例1
[0026] 蜜环菌液体发酵种子的制备：
[0027] 将保藏的蜜环菌菌种接种到斜面培养基上，斜面培养基组成（单位克/升）为：葡 萄糖20g/L，琼脂20g/L，马铃墓200g/L，VBl 10 X l〇-3g/L，用自来水配置，12rC灭菌15min ; 在3(TC环境下培养7天，直至菌丝体长满斜面。
[0028] 将蜜环菌斜面菌种接种到装有80毫升蜜环菌种子培养基的250毫升的H角瓶中， 种子培养基为款皮15g/L，玉米粉20g/L，葡萄糖20g/L，M拆OJg/L，KH2P〇42g/L，酵母膏3g/ L，VB115Xl〇-3g/L，用自来水配置，抑自然，12rC灭菌15min。在摇床转速150转/分钟， 3(TC条件下培养7天。
[002引 实施例2
[0030] 斜面培养和种子液培养的条件如实施例1所述。将实施例1得到的蜜环菌种子液 进行发酵，蜜环菌液体发酵的温度条件控制：
[0031] 将培养7天的蜜环菌种子6毫升接种到装有150毫升蜜环菌发酵培养基的500 毫升的H角瓶中，发酵培养基为款皮15g/L，玉米粉15g/L，葡萄糖20g/L，M拆OJg/L， KH2P〇42g/L，用自来水配置，pH自然，12rC灭菌15min。
[003引在30。摇床转速150转/分钟的条件下培养3天。然后，摇床转速不变，将温度 调整为23C，发酵培养4天后，发酵结束。最终得到具有抑制非酶糖基化反应的蜜环菌发酵 液，测得蜜环菌发酵液对非酶糖基化反应的抑制率为89. 28%。
[003引 实施例3
[0034] 斜面培养和种子液培养的条件如实施例1所述。将实施例1得到的蜜环菌种子液 进行发酵，蜜环菌液体发酵的温度条件控制：
[0035] 将培养7天的蜜环菌种子6毫升接种到装有150毫升蜜环菌发酵培养基的500毫 升的H角瓶中，各种培养基的条件同实施例2,在29C，摇床转速150转/分钟的条件下培 养3天，然后将培养温度改变为24C，摇床转速不变，继续发酵培养4天，发酵结束测得蜜环 菌发酵液对非酶糖基化反应的抑制率为92. 34%。
[0036] 实施例4
[0037] 斜面培养和种子液培养的条件如实施例1所述。将实施例1得到的蜜环菌种子液 进行发酵，蜜环菌液体发酵的温度条件控制：
[0038] 将培养7天的蜜环菌种子6毫升接种到装有150毫升蜜环菌发酵培养基的500毫 升的H角瓶中，各种培养基的条件同实施例2,在32C，摇床转速150转/分钟的条件下培 养2天，然后将培养温度改变为22C，摇床转速不变，继续发酵培养3天，发酵结束测得蜜环 菌发酵液对非酶糖基化反应的抑制率为83. 63%。
[00測 实施例5
[0040] 斜面培养和种子液培养的条件如实施例1所述。将实施例1得到的蜜环菌种子液 进行发酵，蜜环菌液体发酵的温度条件控制：
[0041] 将培养7天的蜜环菌种子6毫升接种到装有150毫升蜜环菌发酵培养基的500毫 升的H角瓶中，各种培养基的条件同实施例2,在28C，摇床转速150转/分钟的条件下培 养4天，然后将培养温度改变为25C，摇床转速不变，继续发酵培养5天，发酵结束测得蜜环 菌发酵液对非酶糖基化反应的抑制率为84. 02%。
[0042] 实施例6
[0043] 斜面培养和种子液培养的条件如实施例1所述。将实施例1得到的蜜环菌种子液 进行发酵，蜜环菌液体发酵的温度条件控制：
[0044] 将培养7天的蜜环菌种子6毫升接种到装有150毫升蜜环菌发酵培养基的500毫 升的H角瓶中，各种培养基的条件同实施例2,在28C，摇床转速150转/分钟的条件下培 养2天，然后将培养温度改变为22°C，摇床转速不变，继续发酵培养3天，发酵结束测得蜜环 菌发酵液对非酶糖基化反应的抑制率为76. 59%。
[0045] 实施例7
[0046] 斜面培养和种子液培养的条件如实施例1所述。将实施例1得到的蜜环菌种子液 进行发酵，蜜环菌液体发酵的温度条件控制：
[0047] 将培养7天的蜜环菌种子6毫升接种到装有150毫升蜜环菌发酵培养基的500毫 升的H角瓶中，各种培养基的条件同实施例2,在32C，摇床转速150转/分钟的条件下培 养4天，然后将培养温度改变为25C，摇床转速不变，继续发酵培养5天，发酵结束测得蜜环 菌发酵液对非酶糖基化反应的抑制率为78. 81%
[004引 实施例8
[0049] 斜面培养和种子液培养的条件如实施例1所述。将实施例1得到的蜜环菌种子液 进行发酵，蜜环菌液体发酵的温度条件控制：
[0050] 将培养7天的蜜环菌种子6毫升接种到装有150毫升蜜环菌发酵培养基的500毫 升的H角瓶中，各种培养基的条件同实施例2,在3(TC，摇床转速150转/分钟的条件下培 养2天，然后将培养温度改变为24C，摇床转速不变，继续发酵培养5天，发酵结束测得蜜环 菌发酵液对非酶糖基化反应的抑制率为86. 28%。
[0051] 实施例9
[0052] 斜面培养和种子液培养的条件如实施例1所述。将实施例1得到的蜜环菌种子液 进行发酵，蜜环菌液体发酵的温度条件控制：
[0053] 将培养7天的蜜环菌种子6毫升接种到装有150毫升蜜环菌发酵培养基的500毫 升的H角瓶中，各种培养基的条件同实施例2,在3rC，摇床转速150转/分钟的条件下培 养3天，然后将培养温度改变为23C，摇床转速不变，继续发酵培养4天，发酵结束测得蜜环 菌发酵液对非酶糖基化反应的抑制率为84. 62%。
[0054] 对比例1
[0055] 斜面培养和种子液培养的条件如实施例1所述。将实施例1得到的蜜环菌种子液 进行发酵，蜜环菌液体发酵的温度条件控制：
[0056] 将培养7天的蜜环菌种子6毫升接种到装有150毫升蜜环菌发酵培养基的500毫 升的H角瓶中，各种培养基的条件同实施例2,在28C，摇床转速150转/分钟的条件下培 养7天，发酵结束测得蜜环菌发酵液对非酶糖基化反应的抑制率为56%。
[0057] 实施例2?9和对比例1的发酵方法和效果总结于表1所示。
[0058] 表1 ;各中温度控制策略下发酵液非酶糖基化反应的抑制率
[0059]
【权利要求】
1. 一种能够提高非酶糖基化反应抑制率的蜜环菌发酵液的制备方法，其特征在于包括 以下步骤： (1) 斜面培养：将蜜环菌接种于斜面培养基上，在30°C下培养至菌丝体长满斜面； (2) 种子液的培养：将斜面中生长的蜜环菌菌体接种到种子培养基中，在30°C、摇床转 速150转/分钟的条件下培养7天； (3) 将蜜环菌种子液以4%的接种量接种到发酵培养基中，在28?32°C、摇床转速150 转/分钟的条件下发酵培养2?4天； (4) 调整摇床的温度，在22?25°C、摇床转速150转/分钟的条件下，继续发酵培养 3?5天。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的斜面培养基的配方为葡萄糖 20g/L、琼脂 20g/L、马铃薯 200g/L、VBl 10X10_3g/L，用自来水配置，121°C灭菌 15min。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的种子培养基的配方为麸皮15g/ L、玉米粉 20g/L、葡萄糖 20g/L、MgS04lg/L，KH2P042g/L、酵母膏 3g/L、VBl 15X10_3g/L，用自 来水配置，pH自然，121°C灭菌15min。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的发酵培养基的配方为麸皮15g/ L、玉米粉15g/L、葡萄糖20g/L、MgS04lg/L，KH2P042g/L，用自来水配置，pH自然，121°C灭菌 15min〇
5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（3)的发酵温度为29°C，发酵培 养时间为3天，步骤（4)的发酵温度为24°C，发酵培养时间为4天。
【文档编号】C12N1/14GK104357334SQ201410577583
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月24日 优先权日:2014年10月24日
【发明者】丁重阳, 田超, 彭林, 顾正华, 张梁, 石贵阳 申请人:江南大学