用于操作细胞的纳米吸管装置制造方法

用于操作细胞的纳米吸管装置制造方法
【专利摘要】本文公开了用于使用纳米吸管将所需物质可控喷射至包括单细胞的表面和喷射并进入细胞的方法和系统。一些系统涉及为了控制细胞粘附和生长的目的，用于将用户定义的图形沉积在任意基底上的方法和系统，包含与xyz控制器组合的纳米吸管。可选的实施方案涉及以高通量方式并具有对所述该细胞最小的损伤将物质电渗注射入细胞的方法和系统，包含与xyz控制器和纳米吸管的孔中压差的电子控制部件组合的纳米吸管。又其他实施方案涉及用于研究分子相互作用并检测单个活细胞内的生物分子的方法和系统，包含与扫描离子电导显微术组合的官能化的纳米吸管。
【专利说明】用于操作细胞的纳米吸管装置
[0001]发明人:R.亚当.赛格、保罗.阿克蒂斯、波阿斯.维洛兹尼和纳德.普曼德
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求2011年3月3日提交的美国临时专利申请号61/448，998的优先权，其在此通过引用整体被并入。
[0004]政府支持的声明
[0005]本发明根据由美国国家航空航天局(the National Aeronautics and SpaceAdministration, NASA)授予的合同号NCC9-165和NNX08BA47A、由美国国立卫生研究院(the National Institutes of Health)授予的合同号 P01-HG000205、由 NASA 授予的合同号NNX09AQ44A并根据由美国国家癌症研究所(the National Cancer Institute)授予的合同号U54CA143803，在政府的支持下完成。政府在本发明中具有某些权利。
[0006]参考序列表、计算机程序或光盘
[0007]无
[0008]发明背景
发明领域
[0009]本发明涉及用于单细胞注射、生物分子的图形化和检测的纳米器件和纳米传感器领域。
[0010]相关技术
[0011]下面呈现了关于本 发明某些方面的背景信息，尽管它们可能涉及详述中所提及的技术特征，但不必然地被详细描述。即，本发明所使用的单独的部分或方法可在下面讨论的材料中被更详细地描述，这些材料可向本领域技术人员提供用于制造或使用如所请求保护的本发明的某些方面的进一步的指导。下面的讨论不应该被解释为承认信息与本文任何权利要求的相关性或所描述的材料的现有技术效果。
[0012]纳米吸管技术已被证明是用于许多应用的可行的平台。Actis等人，(包括两位本发明人)建立了传感平台，命名为STING (“通过离子纳米-门控的信号转导(SignalTransduction by 1n Nano Gating)”),其中用化学或生物受体官能化石英纳米吸管的最尖端(Actis，P.、0.Jejelowo 和 N.Pourmand, Ultrasensitive mycotoxin detectionby STING sensors.Biosensors&Bioelectronics, 2010.26 (2):第 333-337 页)。尖端处的纳米级别的开口创建了对与所附着的受体结合的分析物敏感的区域。另外，Rodolfa等人，已证明纳米吸管能够被用于可控沉积在经官能化的表面上(Rodolfa，K.T.，等人,Two-component graded deposition of biomolecules with a double-barreled纳米吸管.Angewandte Chemie-1nternational Edition, 2005.44(42):第 6854-6859 页)。进一步的研究已证明无机溶剂中将物质沉积至表面(Rodolfa, K.T.，等人，Nanoscalepipetting for controlled chemistry in small arrayed water droplets using adouble-barrel pipet.Nano Letters, 2006.6 (2):第 6 页)。使用纳米吸管将单个分子递送至细胞的质膜(Bruckbauer, A.，等人，纳米吸管 delivery of individual moleculesto cellular compartments for single-molecule fluorescence tracking.BiophysicalJournal, 2007.93:第 3120-3131 页)。
[0013]Laforge等人基于通过跨在纳米吸管开口处形成的液体/液体界面施加电压递送液体的纳米吸管，开发了电化学阿托注射器(attosyringe) (Laforge, F.0.,等人，Electrochemical attosyringe.Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America, 2007.104 (29):第 11895-11900 页)。合力是足够强以便引起液体流入/流出吸管。他们已成功地使用该作用递送毫微微升的水溶液进入培养中的哺乳动物细胞。碳纳米吸管也在细胞注射中显示了功效。Schrlau等人说明了将荧光染料压力驱动注射入口腔鳞状细胞癌的细胞(Carbon纳米吸管s for cell probes andintracellular injection.Nanotechnology, 2008:第 015101-1-4 页)。
[0014]细胞图形化
[0015]控制细胞附着和生长已作为从神经科学到干细胞研究的生物学科中一个重要的主题出现(James, C.D.，等人，Aligned microcontact printing of micrometer-scalepoly-L-lysine structures for controlled growth of cultured neurons on planarmicroelectrode arrays.1eee Transactions on Biomedical Engineering, 2000.47(I):第 17-21 页；Welle, A.，等人,Photo-chemicalIy patterned polymer surfacesfor controlled PC_12adhesion and neurite guidance.Journal of NeuroscienceMethods, 2005.142⑵:第243-250页)。通过控制细胞在哪里及如何生长并成熟，特定的特征可在细胞生长过程中被诱导。例如，由01 iva等人已证明(Patterningaxonal guidance molecules using a novel strategy for microcontact printing.Neurochemical Research, 2003.28(11):第 1639-1648 页)，通过化学诱因可控制神经分化，允许轴突生长的方向是预定的和定制的以用于特定的实验。相似地，喷墨打印(inkjetprinting)已被显示能够控制神经干细胞分化(Ilkhanizadeh, S.,等人，Inkjet printingof macromolecules on hydrogels to steer neural stem cell differentiation.Biomaterials, 2007.28(27):第 3936-3943 页)。`
[0016]已使用众多方法研究了细胞图形化。通过利用半导体制造技术中的改进，具有足够小以指导单细胞的特征尺寸的图形已变得可行。被最广泛使用的细胞图形化技术是微接触印刷(μ CP)，其中使用传统的光刻法制造主模，并从该主模创建弹性印章。随后可用生物分子涂布该印章并可将图形施加至任意基底(Wilbur，J.L.，等人,Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers.Advanced Materials, 1994.6(7-8):第600-604页)。该方法在控制细胞生长、特别在控制神经生长方面已见到了广泛成功(Park, T.H.和 Μ.L.Shuler, Integration of cell cultureand microfabrication technology.Biotechnology Progress, 2003.19(2):第 243-253页)。光刻法本身也可被用于图形化。通过将基底暴露于透过遮罩的福射下，可改变表面化学，因此允许将特定的粘附分子放置在合适的区域(Welle, A.，等人，Photo-chemicalIypatterned polymer surfaces for controlled PC_12adhesion and neurite guidance.Journal of Neuroscience Methods, 2005.142 (2):第 243-250 页)。形貌诱因也被证明控制细胞生长。通过改变细胞与其交界的表面粗糙度，可控制细胞粘附。化学与形貌附着诱因的组合甚至被证明为导致改进的细胞分化(例如，Stenger, D.A.,等人，Microlithographicdetermination of axonal/dendritic polarity in cultured hippocampal neurons.Journal of Neuroscience Methods, 1998.82 (2):第 167-173 页)。这些方法的缺点是一旦设计并制造了图形，在不设计新的遮罩并从头开始重新启动整个过程的情况下，它就不能够被改变。已开发用于不依赖于标准的半导体制造技术的图形化的一些方法，并因此不受制造过程的限制。Gustavsson,等人，(Neurite guidance on protein micropatternsgenerated by a piezoelectric microdispenser.Biomaterials, 2007.28(6):第1141-1151页)说明压电驱动的微分配器能够以6-8 μ m的精度沉积IOOpL的液滴。蘸水笔和钢笔光刻允许将小至40nm的点尺寸沉积在任意用户界定的图形中，如由Schmidt，R.C.和K.Ε.Healy(Controlling biological interfaces on the nanometer length scale)in Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2009.90A(4):第 1252-1261 页)显示的。然而，该技术限于在给定的时间仅沉积单个图形。
[0017]通过使用下面描述的石英纳米吸管技术，沉积在基底上的图形是电脑控制的并因此可在任何时间被用户修改，并能够容易地沉积相对于彼此被对齐的多个图形。该图形可被用于实现细胞附着至基底216，如图2中显示的，其中细胞212附着至已被沉积粘附物质的基底上的点。
[0018]细朐沣射
[0019]历史上用于细胞注射的方法已使用抽吸式的玻璃微米吸管。传统的微米吸管遭受一些缺点，包括相对于典型的细胞的大尺寸、低细胞活性、缺少反馈并需要有经验的操作人员(Pillarisetti, A.，等人，Evaluating the effect of force feedback in cellinjection.1eee Transactions on Automation Science and Engineering, 2007.4(3):第 322-331 页；Stephens, D.J.和 R.Pepperkok, The many ways to cross the plasmamembrane.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America, 2001.98(8):第 4295-4298 页)。
[0020]已开发了用于细胞注射的众多其他方法以减少这些缺点。已开发了诸如电穿孔及使用穿孔毒素链球菌溶血素-O (SL-O)的方法用于被动转移物质进入细胞(Wang, Μ.Y.,等人,Single-cell electroporation.Analytical and BioanalyticalChemistry, 2010.397 (8):第 3235-3248 页；Knight, D.E.和M.C.Scrutton, Gaining accessto the cytosol-the technique and some applications of electropermeabilization.Biochemical Journal, 1986.234(3):第 497-506 页；Giles, R.V.，等人,Selectingoptimal oligonucleotide composition for maximal antisense effect followingstreptolysin O—mediated delivery into human leukaemia cells.Nucleic AcidsResearch, 1998.26(7):第1567-1575页)。电穿孔已被证明通过施加高电压造成细胞膜中的瞬时通透性，之后物质便可扩散进入。已显示细胞在某些条件下修复SL-O损伤的能力。在两种情况下，都将应激引入细胞且在SL-O损伤的情况下，摄入被限制为~100kDa。
[0021]使用其他不相关的纳米制备结构已证明了细胞注射的直接方法。将组装在AFM尖端并用DNA涂覆的纳米针插入单细胞。通过DNA从纳米针的扩散实现注射(Sung-Woong, H.，等人，High-efficiency DNA injection into a single human mesenchymal stem cellusing a nanoneedle and atomic force microscopy.Nanomedicine:Nanotechnology,Biology and Medicine, 2008:第215-25页)。相似地，通过裂解连接点与纳米针的二硫键将量子点递送入细胞内(Chen，X.，等人，A cell nanoinjector based on carbonnanotubes.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America, 2007.104(20):第 8218-8222 页)。
[0022]细胞内分子物质的单细胞体内检测
[0023]已经开发了允许细胞内记录的一些方法。Kopelman和合作者(Tan, W.，等人,Submicrometer intracellular chemical optical fiber sensors.Science258, 778-781，do1: 10.1126/science.1439785，1992 ；Barker, S.L.R.,等人,Cellular Applications of a Sensitive and Selective Fiber-Optic NitricOxide Biosensor Based on a Dye-Labeled Heme Domain of Soluble GuanylateCyclase.Analytical Chemistry71,2071-2075, do1:10.1021/ac9901081, 1999)率先应用了用于细胞外监测pH和一氧化氮的经化学改性锥形光纤。Vo-Dihn和合作者报道了用于测量单细胞内荧光分析物的经抗体修饰的光纤的分析应用(Vo-Dinh，T.，等人，Antibody-based nanoprobe for measurement of a fluorescent analyte in asingle cell.Nat Biotechl8:764-767，2000)。采用锥形光纤的一个优势依赖于使用近场扫描光学显微术可实现的高空间分辨率。在显微镜下必须小心操作传感器以避免细胞损伤。除了这些物理限制外，由于细胞质内的许多干扰物质，通过亲和方法的生物分子的选择性检测其本身就是挑战。最近建造了光纤纳米生物传感器以通过酶的夹心免疫测定法检测进入单细胞的癌症生物标志物(Zheng, X.T.&Li, C.M.Singleliving cell detection of telomerase over-expression for cancer detection byan optical fiber nanobiosensor.Biosensors and Bioelectronics25:1548—1552，2010)。由于改进的耐久性、灵敏性、快速响应及与其他设备组件的整合，电子检测方法是已知比其他方法更适合的。即使如此，用于细胞内测量的基于电的传感器面临许多挑战。微电极通常足够大以致损伤典型的哺乳动物细胞(5μπι至ΙΟμπι)，且通常将程序限于卵母细胞和胚胎内的测量，其至少是10倍更大。近来，Hai，A.，等人在NatureMethods(2010)7，200-202 (In-cell recordings by extracellular microelectrodes)中采用突出入细胞内的微电极以测量`亚阈值突触电势。尽管Bakker，E.&Pretsch，E.在TrAC Trends in Analytical Chemistry27,612-618 (Nanoscale potentiometry.)中使用离子选择性膜涂覆的微电极的成功的细胞内阳离子和PH传感器，生物分子的细胞内电子检测仍然是难以捉摸的。Lieber和合作者开发了新的方法，其中用磷脂双层改性的纳米级的场效应晶体管(nanoFET)能够穿入单细胞并记录细胞内电势(Tian, B.等人Three-Dimensional, Flexible Nanoscale Field-Effect Transistors as LocalizedBioprobes.Science329, 830-834，do1: 10.1126/science.1192033, 2010)。然而，没有采用电传感器以检测单细胞内生物分子的相互作用。
[0024]还显示STING(“通过离子纳米-门控的信号转导”)技术能够检测样品中的DNA、蛋白和霉菌毒素(Fu, Y.，等人，Nanopore DNA sensors based on dendrimer—modif ied 纳米吸管 s.Chem Commun (Camb)，(2009)，4877-4879，do1: 10.1039/b91051 Ie ;Umehara，S.，等人，Label-free biosensing with functionalized纳米吸管probes.Proceedings of theNational Academy of Sciences (2009) 106，4611-4616，do1:10.1073/pnas.0900306106 ；Actisj P.,等人，Ultrasensitive mycotoxin detection by STING sensors.Biosensorsand Bioelectronics (2010) 26，333-337)。基于官能化的石英纳米吸管，STING技术不要求任何纳米制造的设施；可在工作台上容易地并廉价地定制每一个探针。使用行之有效的表面化学可并入受体分子。除生物传感外，将纳米吸管平台用于研究单个分子生物物理学、单细胞内可控递送和纳米级的细胞成像(Clarke, R.W.，等人，Trapping of proteinsunder physiological conditions in a 纳米吸管.Angew Chem Int Ed Engl (2005),44,3747-3750, do1:10.1002/anie.200500196 ；Laforge, F.0.，等人，Electrochemicalattosyringe.Proceedings of the National Academy of Sciences (2007)，104，11895-11900, do1:10.1073/pnas.0705102104 ；Klenerman, D.&Korchev, Y.Potential biomedicalapplications of the scanned纳米吸管.Nanomedicine (Lond) (2006)，1，107-114，do1: 10.2217/17435889.1.1.107) Jitol和合作者开发了用于细胞内分析的SERS活性碳纳米吸管(Singhal, R.等人 Small diameter carbon 纳米吸管 s.Nanotechnology, (2010)，015304)。通过将金纳米粒子并入吸管尖端的外表面添加SERS官能性。用插入细胞核内的纳米吸管获得的SERS光谱显示了与DNA相关的典型特征。
[0025]然而，领域中对能够在活细胞内操纵的纳米吸管生物传感器仍然存在需求。
[0026]具体的专利和出版物
[0027]Karhanek等人在2010年3月25日公布的美国专利申请公布2010/0072080中，公开了用于包括肽和蛋白的生物分子的检测的包含官能化的纳米吸管的方法和设备。
[0028]Umehara 等人在 2009 年 3 月 24 日的 Proceedings of the National Academy ofSciences,第106卷，第4611-4616页中，公开了使用官能化的纳米吸管电极的无标记、实时的蛋白测定。
[0029]Ying、Liming 在 2009 年的 Biochemical Society Transactions,第 37 卷，第702-706页中，综述了纳米吸管和它们在离子、分子(包括生物分子)和细胞的纳米感测和纳米操纵中的用途。
[0030]Actis, P.,等人在 Bioanalytical Reviewsl, 177-185, do1: 10.1007/sl2566-010-0013-y(2010)中，综述了应用纳米吸管技术作为用于核酸和小蛋白的电化学
生物传感器。
[0031]Hansma 等人的 1990 年 5 月 8 日授权的题为 “Scanning 1n ConductanceMicroscope”的美国4，924, 091描述了扫描离子电导显微术,SICM,其可通过将微米吸管探针保持在距表面的恒定的电导距离处将用电解质覆盖的软的非导电表面的形貌成像。
[0032]发明概述
[0033]下面的概述并不预期包括本发明的所有特征和方面，其也不暗示本发明必须包括该概述中所讨论的所有特征和方面。
[0034]在某些方面中，本发明涉及用于将液体沉积在基底上具有亚微米特征的预先确定的位置的装置，包括:Ca)多管筒纳米吸管,其中两个管筒在它们内部具有第一和第二电极，所述管筒内的第一电极适于维持所述液体与该管筒内的电极接触并被连接至用于在使用过程中控制所述第一和第二电极之间的电压的电路；(b) xyz控制器，其连接至所述纳米吸管用于产生该纳米吸管以亚微米X和I步长的机械移动，并产生所述纳米吸管在z方向的移动，所述xyz控制器还具有用于根据用户定义的控制来控制所述机械移动的电子控制部件；和(C)用于控制电压的所述电路，所述电路连接至所述电子控制部件以致所述电路在所述纳米吸管中的液体待被沉积的所述预先确定的位置中预期位置处向所述液体施加喷射电压，并当该xyz控制器产生该纳米吸管远离液体待被沉积的所述预定的位置中的预期位置的机械移动时去除所述喷射电压。[0035]在本发明的某些方面，基底可具有图形化物质被沉积其上的均匀的层。图形化物质可限定用于细胞生长的粘附物质。[0036]在本发明的某些方面，装置包含用于控制电压的电路，所述电路包含用于吸管偏压和测量通过第一管筒的离子电流的电流的低噪音放大器。该装置还可包含用于xyz控制器的亚微米控制的压电驱动器。该装置还可包含用于用户输入所述预先确定的位置的可编程设备，诸如计算机或FPGA。FPGA可被编程用于按图形沉积斑点，以便细胞以预先确定的图形生长。FPGA可被编程以在预定的位置处注射细胞。该位置可适于在适当的位置容纳单个细胞以便它能够被扫描或被注射。预定的位置可以是细胞内的细胞器，诸如细胞核或线粒体。
[0037]在本发明的某些方面，细胞基底适于通过具有在其中用于在单个腔中接收单个细胞的所界定的腔容纳细胞。该腔可具有用于施加负压以将细胞保持在腔内的通孔。该腔可包含用于吸引细胞至该腔的电极。该腔可用于在固定的位置容纳单个细胞，同时纳米吸管与该细胞接触，且又同时它被注射入该细胞。
[0038]本发明的某些方面包含用于将液体以具有亚微米特征的预先确定的图形沉积在基底上的方法，包括:Ca)将待被沉积的液体放置入多管筒纳米吸管,其中所述多管筒吸管的至少两个管筒在它们内部具有第一和第二电极，所述管筒内的第一电极适于维持所述液体与该管筒内的电极接触并被连接至用于控制使用过程中所述第一和第二电极之间的电压的电路；(b)驱动xyz控制器，其连接至所述纳米吸管用于产生该纳米吸管以亚微米X和y步长的机械移动，并产生所述纳米吸管在z方向的移动，所述xyz控制器还具有用于根据用户定义的图形控制所述机械移动的电子控制部件，所述驱动据此以所述预先确定的图形移动纳米吸管；和((3)使用用于控制电压的所述电路，所述电路连接至所述电子控制部件以致所述电路在所述纳米吸管中的液体待被沉积的所述预先确定的图形中预期位置处向所述液体施加喷射电压，并当xyz控制器产生该纳米吸管远离液体待被沉积的所述预先确定的图形中的预期位置的机械移动时去除所述喷射电压。可根据以上所定义的装置的特定实施方案进一步实施这些方法。
[0039]本发明的某些方面包含用于使用以上描述的装置将物质注射入基底上的细胞的方法。这些方法可包括通过将所述细胞放置在基底中的腔内将所述细胞固定在所述基底上的步骤，所述腔尺寸为仅容纳单细胞。固定可包括向该细胞施加电压以保持其在适当位置，或施加跨所述腔的压差以辅助固定所述细胞。可使用纳米吸管的孔中的多种物质注射细胞，所述多种物质包括多核酸、抗体和染料。
[0040]本发明的某些方面包括用于测量单细胞内分析物的装置，包括:(a)具有包含第一电极的管筒的纳米吸管，所述第一电极适于维持所述分析物与接触所述细胞的液体中的第二、参比电极接触，并被连接至用于在使用过程中控制所述第一和第二电极之间的电压的电路；(b) xyz控制器，其连接至所述纳米吸管用于产生该纳米吸管以亚微米X和y步长的机械移动，并产生所述纳米吸管在z方向的移动，所述xyz控制器还具有用于根据用户定义的控制来控制所述机械移动的电子控制部件；和(c)所述纳米吸管尖端，具有被固定在所述细胞内靠近尖端的内表面上的分析物结合物质。这种使用官能化的纳米吸管尖端进行感测分析物的类型还包括将尖端插入单个细胞或单个细胞附近。使用分析物结合物质官能化尖端，所述分析物结合物质诸如预期特异性结合至被检测或被测量的分析物的蛋白或多核酸。分析物的结合影响流过纳米吸管尖端处的纳米孔的电流。可通过连接至涂覆在纳米吸管内表面的PLL的硫代-SMCC将用于感测分析物的蛋白固定在尖端。可使用待被检测的抗体或适体或配体的受体官能化纳米吸管的尖端。该装置可被用于单个活细胞内的免疫分析。
[0041]因此可以以多种方式创建本发明的装置用于不同的应用。在每一种情况下，设备都包含连接至灵敏的xyz控制器的纳米吸管。
[0042]在某些方面，本发明包含用于操作基底上的单细胞的装置，包含:(a)多管筒纳米吸管，具有(i)包含被布置与第一管筒中的液体接触的第一电极的第一管筒；(ii)临近第一管筒的包含被布置与第二管筒中的液体接触的第二电极的第二管筒；和(iii)连接至所述第一电极的放大器，用于控制所述第一和第二电极之间的电压；(b) xyz控制器，其连接至所述多管筒纳米吸管用于产生该多管筒纳米吸管以亚微米X和I步长的机械移动，并产生所述多管筒纳米吸管在z方向朝向或远离基底的移动，所述xyz控制器还具有用于根据用户定义的控制来控制所述机械移动的电子控制部件；和(c)用于控制所述第一电极和所述第二电极之间的电压并用于向所述第一电极施加喷射电压的电路，所述电压足够在所述纳米吸管中的液体待被喷射的预期位置处从第一管筒喷射液体并至少当xyz控制器产生纳米吸管远离预期位置的机械移动时去除所述喷射电压。
[0043]在某些方面，本发明包含一种装置，其中检测是检测单个活细胞内的特定癌基因蛋白。
[0044]在某些方面，本发明包含一种装置，其中用于控制电压的所述电路包括用于提供吸管偏压和用于测量通过第一管筒的离子电流的电流的低噪音放大器。
`[0045]在某些方面，本发明包含具有用于xyz控制器的亚微米控制的压电驱动器的装置。在某些方面，本发明包含用于用户输入以确定所述预期位置的现场可编程门阵列(FPGA)0在某些方面，本发明包含一种装置，其中所述FPGA被编程用于将斑点以所述基底上的图形沉积。在某些方面，本发明包含一种装置，其中所述FPGA被编程以注射所述基底上的预定位置处的细胞。在某些方面，本发明包含一种装置，其中所述FPGA被编程以注射所述细胞内的细胞器。
[0046]在某些方面，本发明包含可操作地连接至适于容纳多个单细胞、每个单个位置处一个细胞的基底的装置。在某些方面，本发明包含在其中具有用于在单个腔内接收单个细胞的所界定的腔的基底。在某些方面，本发明包含一种装置，其中基底包含用于施加负压以维持细胞在腔内的通孔。在某些方面，本发明包含一种装置，其中腔包括用于吸引细胞至腔的电极。
[0047]在某些方面，本发明包含用于将液体以具有亚微米特征的预先确定的图形沉积的方法，包括步骤:(a)将待被沉积的液体放置在多管筒纳米吸管内，该多管筒纳米吸管具有:(i)第一管筒，该第一管筒包含被布置与第一管筒中的液体接触的第一电极；(ii)临近第一管筒的第二管筒，其包含被布置与第二管筒中的液体接触的第二电极；和(iii)连接至所述第一电极的放大器，用于控制所述第一和第二电极之间的电压；(b)驱动xyz控制器，其连接至所述多管筒纳米吸管用于产生该多管筒纳米吸管以亚微米X和I步长的机械移动，并产生所述多管筒纳米吸管在Z方向朝向或远离基底的移动，所述xyz控制器还具有用于根据用户定义的控制来控制所述机械移动的电子控制部件；和(0)使用电路来控制所述第一电极和所述第二电极之间的电压，并用于在所述纳米吸管中的液体待被喷射的预期位置处向所述第一电极施加喷射电压以从第一管筒喷射液体，并当xyz控制器产生纳米吸管远离预期位置的机械移动时去除所述喷射电压，据此所述液体被以所述预定的图形沉积。
[0048]在某些方面，本发明包含如以上描述的方法，其中所述液体包括细胞粘附物质，用于允许细胞仅附着在基底上沉积细胞粘附物质的区域。在某些方面，本发明包含如以上描述的方法，其中所述细胞粘附物质是层粘连蛋白。在某些方面，本发明包括如以上描述的方法，其中基底包含均匀的聚合物上表面。在某些方面，本发明包含如以上描述的方法，其中所述液体包括细胞粘附物质，该细胞粘附物质用于允许细胞仅附着在基底上沉积细胞粘附物质的区域，并且，该方法还包括向基底施加待被培养的粘附细胞的步骤，据此所述细胞仅粘附在具有细胞粘附物质的区域。
[0049]在某些方面，本发明包含如以上描述的方法，其中具有细胞粘附物质的区域是每100平方微米约至少10斑点的密度。在某些方面，本发明包含如以上描述的方法，其中该方法被用于沉积来自纳米吸管的不同管筒的不同物质。
[0050]在某些方面，本发明包含如以上描述的方法，其中纳米吸管由石英制成并具有约20nm 至 IOOnm 的开口。
[0051]在某些方面，本发明包含用于将物质注射入基底上的所选择的细胞中的方法，包括步骤:Ca)将待被注射的液体放置入多管筒纳米吸管内，所述多管筒纳米吸管具有(i )第一管筒，包含被布置与第一管筒中的液体接触的第一电极；(ii)临近第一管筒的第二管筒，其包含被布置与第二管筒中的液体接触的第二电极jP(iii)连接至所述第一电极的放大器，用于控制所述第一和第二电极之间的电压；(b)驱动xyz控制器，其连接至所述多管筒纳米吸管用于产生该多 管筒纳米吸管以亚微米X和y步长的机械移动，并产生所述多管筒纳米吸管在z方向朝向或远离基底的移动，所述xyz控制器还具有用于根据用户定义的控制来控制所述机械移动的电子控制部件；和(0)使用电路来控制所述第一电极和所述第二电极之间的电压，并用于在所述纳米吸管中的液体待被喷射的预期位置处向所述第一电极施加喷射电压以从第一管筒喷射液体，并当xyz控制器产生纳米吸管远离预期位置的机械移动时去除所述喷射电压，据此所述液体被注射入所述细胞中。
[0052]在某些方面，本发明包含如以上描述的方法，还包含通过将所述细胞放置在基底中的腔内将所述细胞固定在所述基底上的步骤，所述腔尺寸为仅容纳单个细胞。
[0053]在某些方面，本发明包含如以上描述的方法，还包括施加跨所述腔的压差以辅助固定所述细胞的步骤。
[0054]在某些方面，本发明包含如以上描述的方法，其中所述被注射的物质选自由以下组成的组:多核酸、抗体和染料。
[0055]在某些方面，本发明包含用于检测基底上单个细胞内的分析物的装置，包括:(a)具有包含第一电极的管筒的纳米吸管，所述第一电极适于维持所述分析物与接触所述细胞的液体中的第二、参比电极接触，并被连接至用于控制使用过程中所述第一和第二电极之间的电压的电路；和(b) xyz控制器，其连接至所述纳米吸管用于产生该纳米吸管以亚微米X和I步长的机械移动，并产生所述纳米吸管在Z方向的移动，所述xyz控制器还具有用于根据用户定义的控制来控制所述机械移动的电子控制部件；和((3)所述纳米吸管尖端，具有被固定在所述细胞内靠近尖端的内表面的分析物结合物质。
[0056]在某些方面，本发明包含一种装置，其中所述分析物结合物质是蛋白或多核酸。
[0057]在某些方面，本发明包括一种装置，其中分析物结合物质是通过磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(硫代-SMCC)连接至涂覆在所述内表面的多聚-L-赖氨酸(PLL)的蛋白。
[0058]在某些方面，本发明包含检测单个活细胞中生物分子的方法，包括:(a)将官能化的纳米吸管放置于细胞内的所确定的深度；(b)监测电流以控制靠近细胞膜的纳米吸管的精确位置；(C)以高速将纳米吸管插入细胞；(d)施加高电压jP(e)测量电流变化以检测细胞内的生物分子，其中官能化的纳米吸管被包含在系统中，所述系统还包括用于吸管偏压和电流测量的放大器、用于控制X、Y和Z方向的显微操纵器、用于X、Y和Z方向精细控制的压电驱动器、可配置的集成电路、高压电源和用于在低电压和高电压之间转换的继电器。
[0059]在某些方面，本发明包含如以上描述的方法，其中用抗体官能化纳米吸管。在某些方面，本发明包含如以上描述的方法，其中用适体官能化纳米吸管。
[0060]在某些方面，本发明包含如以上描述的方法，其中该方法被用于单个活细胞中的免疫分析。在某些方面，本发明包含如以上描述的方法，其中用受体配体官能化纳米吸管。
[0061]附图简述
[0062]图1是展示沉积和细胞注射系统的示意图。
[0063]图2是使用本系统的双管筒吸管的细胞穿入的示意图。
[0064]图3是显示从纳米吸管尖端喷射的液体体积随时间推移的图。如图中显示的，喷射率随时间推移是线性的。
[0065]图4Α是显示一组经图形化的斑点的顶端视图照片。
[0066]图4Β是使用磺酰罗丹明的一组经图形化的斑点的荧光图像的伪3-D图。
[0067]图5是显示本纳米注射设备的一系列照片。图5Α是显示将羧基荧光素注射入HeLa细胞内的照片。它是细胞和纳米吸管的明场图像。箭头指示纳米吸管的尖端。图5Β也是细胞注射的照片，如图5Α中的。图5Β显示注射后的HeLa细胞和纳米吸管的荧光图像。
[0068]图6是显示细胞筛制造的一列图。图6Α是显示将氮化硅层沉积在硅片上的图。图6Β是显示通过氮化物层的深度反应离子蚀刻的图。图6C是显示背面KOH蚀刻的图。图6D是显示粘合至玻璃晶片的硅片的图。图6Ε是显示最终设备中将塑料环连接至表面的图。
[0069]图7是显示培养腔和用于施加真空的装置的最终设备的照片。显示一便士用于说明设备的相对大小为小于一便士。使用该设备，可在培养环中培养细胞并通过施加负压将细胞固定在通孔上。
[0070]图8是显示固定在细胞筛上的IOmm聚苯乙烯球的荧光图像的照片。
[0071]图9Α是描绘用扫描离子电导显微术(SICM)的形貌成像的漫画。图9Β是形貌成像的图，显示纳米吸管尖端的高度相对于细胞上的位置的变化。
[0072]图10是显示通过纳米吸管传感器选择性检测HPV18E6抗原的线追踪。施加电压:-400mV。在时间O时加入抗原。[0073]图11是显示纳米吸管传感器对HeLa细胞裂解物的响应的条形图。
[0074]图12是显示用纳米吸管传感器检测单细胞内癌基因蛋白的条形图。
[0075]优选实施方案的详述
[0076]概述
[0077]本文公开了包含被连接至自动装置用于三维移动的纳米吸管的系统，该系统可用于将来自纳米吸管的物质可控沉积在基底上用于控制细胞生长、用于在单个细胞表面或细胞内部用纳米吸管尖端生化标志物感测、或用于注射纳米吸管内容物至单细胞。当用于化学沉积时，小尺寸的纳米吸管开口允许具有低于单细胞水平的分辨率的图形定义。该系统还包含使用扫描离子电导显微术(SICM)作为图形沉积的基础。因此，可由用户预先确定图形，并随后由控制软件建造(laiddown)，不需要光刻或任何类型的图形预处理。这允许用体外细胞培养并不损失分辨率的情况下快速并有效地评价任意用户定义的图形的恒定、快速地建立。该公开的系统在用于控制细胞附着和生长的生物研究中具有应用。
[0078]SICM设备先前已被设计用于软的不导电表面的形貌成像。见，例如Hansma, P.K.，等人，The Scanning 1n-Conductance Microscope.Science, 1989.243 (4891):第 641-643页。此现有技术设备使用XYZ扫描、Z反馈和控制逻辑(Z被认为是与被扫描的表面正交的方向)。
[0079]本发明另外的方面涉及包含用于高通量细胞注射的纳米吸管的系统，包含用于细胞固定和注射的方法。本发明的实施方案涉及在最小的细胞损伤下使用纳米吸管和电渗注射将任意物质细胞注射入细胞。电渗注射包含改变跨纳米孔开口的电压和离子电流以驱动感兴趣的化合物离开纳米吸管。还公开了用于更高效地喷射和细胞注射的双管筒纳米吸管。
[0080]还公开了被制造用于将细胞固定在预定的阵列中的细胞筛用于完全自动注射入细胞。该细胞筛包含三维特征，诸如嵌入式开口，其允许将可被保持的单细胞放置在预定位置、优选在位置阵列中，每一个位置包含单细胞。该技术的实施方案可被用作用于高通量单细胞研究的工具，包括将物质可靠地引入单个活细胞或细胞内的免疫分析。可选的实施方案包括包含聚合物球的结构的固定。
[0081]还公开了整合本纳米吸管传感器与用于扫描穿过生物物质的纳米吸管的装置的方法和设备。如此处描述的纳米吸管传感器可与扫描离子电导显微术(SICM)偶联以研究单个活细胞内的分子相互作用。可在生长培养基内测定(interrogated)细胞,不需要任何固定或预处理。纳米吸管相对于细胞尺寸的小尺寸与控制穿入的条件的组合最大化细胞活性。该技术的应用包括直至单细胞水平的体内分析。另外的应用是它允许连续监测单个细胞内的生物分子，例如，免疫分析以监测蛋白表达。此外，可采用该技术以功能性映射从单细胞分泌的分子。
[0082]定义
[0083]除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的领域内的普通技术人员所普遍理解的相同的含义。尽管与本文描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料可被用于本发明的实施或检测，描述了优选的方法和材料。通常，与细胞和分子生物学和化学相关使用的术语及细胞和分子生物学和化学的技术是本领域众所周知的和普遍使用的术语和技术。没有具体定义的某些实验技术，通常根据本领域众所周知的常规方法和如贯穿本说明书被引用和被讨论的多种一般的和更具体的参考文献中所描述的被实施。为了清楚的目的，下面定义了以下的术语。
[0084]本文使用的术语“纳米吸管”指的是具有纳米级的圆锥形的尖端开口(即纳米孔)的中空自我支撑的、惰性的、非生物结构，即，0.05nm至约500nm,优选约(+或-20%) 50nm。该中空的结构可以是玻璃或石英，并适于在其内部或在纳米孔的一侧容纳穿过纳米孔开口的流体。选择或改性纳米吸管的内部以最小化分析物的非特异性结合。调节内部的大小以允许与纳米吸管中的溶液接触的电极的插入。优选通过玻璃或石英毛细管的激光拉伸制造纳米吸管。纳米吸管具有大约IO-1OOnm的内径、大约200_800nm的外径及约10 μ m的典型的长度。调整这些尺寸的大小以适应特定的用途，且控制纳米孔的尺寸是重要的考虑。“炙管筒纳米吸管”是具有典型共享共用壁的两个或多个平行孔的纳米吸管。这些孔是共轴的、典型放射状间隔，但可以是同心的。可从市售的多孔毛细管制造它们。
[0085]本文使用的术语“纳米孔”指的是能够用作单个分子检测器的电绝缘膜中的小孔。检测原理是基于当施加跨膜的电压时监测通过纳米孔的离子电流。优选的纳米孔开口在约(10%内的)20nm至IOOnm之间。
[0086]术语“电流检测电路”或“用于控制电压的电路”指的是包括可控的放大器和灵敏电压和电流检测器的已知的电子电路和设备。基于10-10000微微安培的基线电流，它们可包括用于检测大约1-10微微安培的电流变化的任何灵敏设备。该术语还指的是时间响应和相对温度独立或允许补偿温度变化的电路。它应具有在提供已知电压的电路中的输入。灵敏检测电路是已知的，包括电压钳放大器和跨阻放大器。此处的术语“电压钳”指的是使用具有连接至可变指令电压的一个输入、连接至测量电压的另一个输入和反馈电路的差分放大器的电路。电压钳使用负反馈以维持系统处于指令电压，其在这种情况下是预定的交流信号，诸如来自信号产生器的交流电压信号。输出电流遵循输入电压的变化并可检测电流中小的变化。
[0087]本文使用的术语“电渗流(elect`roosmoticflow)”或“电渗流(electro-osmoticflow)”以其传统意义是指在纳米吸管表面形成的双电层上外加电场的效应。在纳米吸管尖端的内表面排列的离子在足够强的电场下被迫使离开纳米吸管，以致同时小体积的溶液被迫使离开尖端。电渗喷射液体，而电泳则移动介质内的带电粒子，所述介质诸如液体或凝胶。通过跨毛细管或任何其他流体导管的施加的电势产生电渗。
[0088]本文使用的术语“层粘连蛋白”以其传统意义是指基底膜(basal lamina)(以前错误地称之为〃基膜(basement membrane) 〃)中的主要蛋白，是大部分细胞和器官中的蛋白网络的基础。层粘连蛋白是基底膜中重要的且生物活性部分，影响细胞分化、迁移、粘附及表型和存活。层粘连蛋白是三聚体蛋白，其包含分别在五个、三个和三个遗传变体中发现的α-链、β_链和Y-链。层粘连蛋白对组织的维持和存活至关重要。有缺陷的层粘连蛋白可造成肌肉不适当形成，导致一种形式的肌肉萎缩症、致死的皮肤起疱疾病(结合性大疱性表皮松解症)和肾过滤缺陷(肾病综合症)。层粘连蛋白被用于细胞培养并用于研究与细胞外环境的细胞相互作用。例如，层粘连蛋白-111是神经轴突将沿着其体内和体外生长的主要基质。例如，它铺设了沿着它们路径从视网膜至顶盖形成视网膜神经节细胞的路径。通常它还被用作细胞培养试验的基质。
[0089]本文使用的术语“癌基因蛋白”以其传统意义是指由癌基因编码的蛋白；它们可包括已知与癌症相关的病毒蛋白。见，例如Clemens等人,“Dimerization of HumanPapillomavirus E70ncoprotien in Vivo, ’ Virology214, 289-293 (1995)。由病毒癌基因编码的蛋白和宿主细胞内相应的、同源蛋白在本文都称为癌基因蛋白，尽管细胞癌基因蛋白典型较大并以小量存在于正常细胞中，并因此不仅需要与肿瘤状态相关。它们包括myc、bcl-2、突变的 p53、DEK, HPVE6、HPVE7 等等。
[0090]本文使用的术语“细胞粘附物质”指的是诸如例如自然界中，细胞外基质中将细胞附着至特定化合物(称为细胞粘附的过程)的天然的蛋白的物质。基质粘附分子(SAM)中一些氨基酸结合至细胞外基质的成分，而其他氨基酸则结合至细胞表面的整联蛋白。整联蛋白分子由两条链的氨基酸组成，其中一条链连接至细胞骨架中的肌动蛋白微丝，而另外一条链则连接至SAM。这使得细胞外基质中的外部活性能够影响细胞形状和移动。SAM不必由结合至它们的细胞制造。它们还可与其他SAM连接，影响彼此的行为。
[0091]本文使用的术语“现场可编程门阵列”指的是被设计在制造后由客户或设计者配置的集成电路一因此为“现场可编程”。现场可编程门阵列(FPGA)的配置通常使用硬件描述语言(HDL)指定，与用于专用集成电路(ASIC)的相似。FPGA包含被称为“逻辑块”的可编程逻辑组件，和允许块被“连接在一起”的可重构互连的层次结构一某种程度上类似于能够以(许多)不同的配置被整合连接的许多(可变的)逻辑门。可配置逻辑块以执行复杂的组合功能或仅简单的逻辑门，如AND和X0R。在大部分FPGA中，逻辑块还包括存储元件，其可以是简单的触发器或更完整的内存块。
[0092]术语“xyz控制器”指的以三维移动的机械设备，三维称为X和y维，典型的平面，和Z维，典型垂直的。xyz控制器已知被用于多种微米级的应用，诸如原子探针显微镜；关于示例性xyz控制器的进一步的细节见,例如，Kajimura等人的题为“Atomic probemicroscope” 的美国 5, 394, 741。
[0093]如下面进一步描述的术语“喷射电压”，指的是在本纳米吸管中的包含溶液的孔和外部溶液之间所施加的电压，该电压造成从孔的离子流，即，喷射溶液内的原子物质。即，在本设备中，由于电渗而形成从纳米吸管孔的喷射，其意味着其取决于纳米吸管的特征而非被喷射的物质。相对于另一个孔中的对电极，液体从包含正偏压电极的孔中喷射出。如下面示例的，跨双管筒纳米吸管的两个孔施加0.1V至100V之间的电压以造成喷射。喷射物质的量取决于所施加的电压的时间和幅度。为了说明的目的，低电压在0.01V-1V之间且高电压为1V-100V。如果使用单孔吸管并施加相对于细胞外电极的高电压，那么电压将必然通过细胞膜，很可能造成损伤。因此，双孔吸管比使用单孔吸管优选。
[0094]如本领域已知的术语“低噪音放大器”或LNA，指的是多种放大器之一，其中放大器是被用于放大非常弱的信号(例如，由天线捕获的)的电子放大器。它通常位于非常接近检测设备处以减少馈线中的损失。典型地，使用LNA，通过LNA的增益减少来自接收链的后续阶段的噪音的影响，而LNA本身的噪音直接被注入接收的信号。因此，对LNA增强所需的信号功率同时增加尽可能少的噪音和失真是必需的，以致在本系统的后面阶段恢复该信号是可能的。好的LNA具有低NF (如ldB)、足够大的增益(如20dB)并应具有足够大的互调和压缩点(IP3和PldB)。
[0095]如本领域已知的术语“压电驱动器”，指的是压电式换能器。有源元件基本上是具有连接至其两个相对面的电极的一块极化物质(即，分子的一些部分带正电荷，而分子的其他部分带负电荷)。当跨该物质施加电场时，极化分子将随电场排列其本身，导致分子内感生偶极子或物质的晶体结构。分子的这种排列将造成物质改变维度。根据本设备，换能器被用于实现非常小的规模上的精细度移动。
[0096]术语“多核酸”指的是单链或(部分)双链DNA或RNA或其合成的类似物的任何寡聚物或聚合物；如本文使用的，基于Watson-Crick碱基配对,多核酸能够与互补链特异性
≤口口 ?
[0097]术语“抗述”指的是具有通过抗原结合部分的结合特异性的任何抗体或抗体片段。例如，已显示可由全长抗体的片段执行抗体的抗原结合功能。包含在抗体的术语“抗原结合部分”内的结合片段的示例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CHl域组成的单价片段；(ii)F(ab' )2片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CHl域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature341:544-546),其由VH域组成；和(vi)分离的互补决定区(⑶R)。
[0098]术语“适述”指的是与特定靶分子结合的多核苷酸或肽。适体的示例包括源自SELEX操作说明的那些，如例如在Gold等人的题为“Systematic evolution of ligandsby exponential enrichment:Solution SELEX” 的美国 5，567，588 中描述的；例如在描述包含在核糖的2’位置、嘧啶的5位置和嘌呤的8位置经化学改性的核苷酸衍生物的寡核苷酸的美国专利号5，660，985、描述包含多种2’ -经修饰的嘧啶的寡核苷酸的美国专利号5，756，703 和描述包含以 2’ -氨基(2，-NH2)、2’ -氟代(2，-F)和 / 或 2’ -O-甲基(2，-OMe)取代基修饰的一个或多个核苷酸的高度特异的寡核苷酸的美国专利号5，580，737中描述了 SELEX-鉴定的包含被修饰的核苷酸的寡核苷酸。肽适体是组合的识别蛋白。使用酵母双杂交方法已选择了与参与多种调节通路的宽范围的细胞、病毒和细菌靶蛋白结合的肽适体，如在 Colas, The eleven-year switch of peptide aptamers,，，J.Biol.7 (I) 2 (2008)中描述的° 在题为“Peptide aptamer for neutralizing the binding of platelet anti genespecific antibodies a nd diagnostic and therapeutic applications containing thesame”的美国20090318363中描述了肽适体。
[0099]术语“染赳”指的是给予另外的物质组合物或混合物颜色的组合物。优选的染料是荧光化合物。还被包括在该定义中的是能量转移染料。还被包括的是咕吨染料、不对称苯并咕吨染料、罗丹明染料、荧光素染料、4，7- 二氯罗丹明染料、4，7- 二氯荧光素染料、羧基荧光素染料、羧基罗丹明染料、羧基RllO染料、羧基R6G染料、羧基-X-罗丹明染料、花菁染料、酞菁染料、方酸菁染料和Cy5，如美国专利号6，335，440中所定义或所使用的，在此也通过引用并入。
[0100]一般方法和装置
[0101]在第一方面，本发明包含为了控制细胞粘附和生长的目的，用于将用户定义的图形沉积在任意基底上的系统。该方法具有在周围环境中可执行可控沉积至非官能化的表面的优势。此图形化的基底被用于对预先确定的图形，成功的细胞培养和好的附着及活力。
[0102]作为适于基底图形化的设备
[0103]该系统包含由用于扫描离子电导显微术(SICM)的系统所示例的计算机控制的反馈系统。SICM的基本操作在本领域被充分理解(见,例如,Hansma, P.K.,等人，The Scanning1n-Conductance Microscope.Science, 1989.243(4891):第 641-643 页；Prater, C.B.,等人，Scanning 1n-Conductance Microscope And Atomic Force Microscope.Scanning, 1990.12(1):第50-52页)。简要地，基本SICM由用电解质回填的并浸入电解槽的单个吸管组成。将电极放置在纳米吸管中并将接地电极放置在槽中一段距离外处。由于纳米吸管的开口靠近基底，垂直于表面，流过给定的吸管孔口的电流将通过“电流挤压”被减少。该电流的下降可作为反馈信号以控制纳米吸管的高度，其可被控制处于表面之上的预先确定的距离。随后，如果纳米吸管跨表面扫描，可渲染基底的形貌图像。
[0104]如下面说明的，该设备的特征可被并入相关设备用于注射单细胞，或用于测量单细胞内分子结合。
[0105]图1是本设备的示意图，根据本发明其可被包含入为细胞注射定制建立的经修饰的SICM (扫描离子电导显微术)中。本设备依赖于Z-方向的反馈控制定位用于精细控制膜的穿入。根据本设备，双管筒纳米吸管102连接至xyz控制部分，包括压电x、y、z控制器104和操作性连接至压电X、1、z控制器的压电控制器106。压电xyz控制器104被用于非常精细的移动，并被安装在步进电机显微操纵器(未显示)上用于较粗糙的移动。压电控制电路通过DAQ卡114连接至计算机116。将DAQ连接至电子传感器和将放大器连接至纳米吸管内的电极110。(在第二孔中的参比电极122，融合至第一孔，被接地，如所显示的。)SICM模块还包含用于吸管偏差和电流测量的低噪音放大器108(例如，AxOpatch200B，MolecularDevices, Sunnyvale, CA)。放大器通过DAQ卡114连接至纳米吸管内的电极110,如所显示的。它包括输入进放大器108的探头放大器112，放大器108输出至DAQ卡114 (数据采集)。适合的DAQ卡是市售可得的。例如，DAQ板(由National Instruments制造)是由板载计时器、具有8通道输入的12位模数转换器(ADC)、2数模转换器(DAC)和24TTL电平逻辑输入组成的多功能即插即用的、模拟和数字输入/输出板。
[0106]与计算机控制器116接口的DAQ卡(其是FPGA)还被连接至用于通过压电xyz控制器控制纳米吸管移动的电路 。一个xyz控制器是用于X、Y和Z方向粗控制的显微操纵器106 (例如，MP-285)。随后这被偶联至用于X、Y和Z方向精细控制(可定位2-3nm以内)的压电驱动器104和用于该系统的硬件控制的FPGA。用低噪音高电压电源118 (例如，Mode 121001 so lated Pulse Stimulator, A-M Systems)和用于在反馈控制所需的低电压(约0.01V-1V)和电泳物质喷射所需的高电压之间转换的定制继电器120进一步改进该系统(图2)。使用写入例如LabVIEW中的用户编码的软件控制该系统。LabVIEW从NationalInstruments Corporation可得,且LabVIEW是使用直观的图形图标和类似流程图的线用于开发精密测量、检测和控制系统的图形化编程环境。因此，用户可设计纳米吸管xyz移动的预定模式和电压变化以引起物质在预定位置持续预定长度的时间的喷射。LabView还允许将预定的模式装载入软件。提供了 LabView或其他传统软件与本设备以控制从纳米吸管的感测和喷射和纳米吸管的移动。
[0107]使用以适合的缓冲液和感兴趣的物质回填的双管筒纳米吸管执行物质从吸管孔的喷射。适合的缓冲液包括分子研究中通常使用的磷酸盐、柠檬酸盐或任何其他缓冲液。通过改变来自电源118的电压在电极110和122之间施加喷射电压。
[0108]可将多种电解质溶液用于纳米吸管孔以影响感兴趣的物质的喷射。在细胞图形化的情况下，感兴趣的物质将被用于创建细胞粘附图形。如下面描述的，感兴趣的物质可取决于应用而不同。将感兴趣的物质悬浮在孔中的电解质溶液中，如已知的，电解质溶液包含所溶解的电解质，即，自由离子。典型的离子包括钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、氯离子、磷酸盐和碳酸氢盐。可使用其他离子种类。感兴趣的物质典型将是液体，因为其将包含感兴趣的物质和离子在溶液中。感兴趣的物质本身可以是电解质，诸如人血浆或其他体液、溶液、水样品等等。电解质应携带离子电流；约10-100mM、优选约IOOmM的正离子和负离子种类被认为是该功能所需的。本设备可在纳米吸管内部和在样品物质中采用相同的或不同的电解质。可将多种盐用于电解质溶液。它们由阳离子(带正电的离子)和阴离子(负离子)组成以致产物是电中性的(不具有净电荷)。这些组分离子可以是无机的诸如氯离子(Cl—)、及有机的诸如醋酸根(CH3COO-)和单原子离子诸如氟离子(F—)、及多原子离子诸如硫酸根(S042_)。存在多种盐。当溶解在水中时水解产生氢氧根离子的盐是碱式盐，且在水中水解产生水合氢离子的盐是酸式盐。中性盐是既不是酸式盐也不是碱式盐的盐。熔融盐和包含被溶解的盐的溶液(例如水中的氯化钠)被称为电解质，由于它们能够导电。
[0109]待被喷射的感兴趣的物质包括，但不限于，小分子、代谢物、核酸、寡核苷酸、肽、氨基酸、染料、聚合物、纳米粒子。
[0110]可使用石英制备纳米吸管。双管筒吸管提供了形成跨吸管尖端的小的弯液面的优势，取消了对如在单管筒吸管中常见的外部接地电极的需求。另外，由于电路在吸管的两个管筒之间完成，尖端在空气中可行使SICM的功能，因此允许纳米吸管的尖端接近干的表面。先前由 Rodolfa 等人在 2005 年(Angewandte Chemie-1nternational Edition中，44:第 6854-6859 页的 “Two-component graded deposition of biomolecules witha double-barreled纳米吸管”)已证明可使用电渗力和相对高压将物质从纳米吸管的尖端喷射出。优选由熔融二氧化硅或无定形石英形成纳米吸管，其比晶状石英便宜。然而，可使用晶状石英。还可使用陶瓷和玻璃陶瓷和硼硅酸盐玻璃，但精确度不如石英好。术语“石英”被预期并定义为包含该特定物质和合适的陶瓷、玻璃陶瓷或硼硅酸盐玻璃。应该注意的是不同类型的玻璃或石英可被用于本纳米吸管的制造。主要的考虑是物质被拉至狭窄的直径开口的能力。可选地，可从其他非导电材料诸如其他氧化硅、金属氧化物(例如，铝)、碳(见，例如美国 7597941，Tubular carbon nano/micro structures and method of makingsame)等等制备纳米吸管。
[0111]在一些实施方案中，该系统被用于基底上的细胞图形化。使用被编程以控制纳米吸管的高度和位置的软件控制图形化。将预先确定的图形载入软件。在规定区域，将纳米吸管缓慢下降至待被图形化的基底的表面。在吸管的弯液面与基底接触后，继电器则隔离放大器并持续规定量的时间施加高电压。在运行时间之后，将尖端快速收回，通过接地电阻器将跨吸管尖端的电压放电并将放大器重新连接至吸管。随后将尖端移动至下一个点并重复该过程直至整个图形被沉积。喷射率取决于所施加的电压和所施加的电压的持续时间二者(见图3中喷射体积对时间的图)。
[0112]使用目前描述的装置，可从纳米吸管中喷射低至50pL/s至100pL/s之间的体积。体积甚至可低于这些量，但它们将超出光学显微镜的分辨率。通过在油浴中喷射适合的聚合物表面测定喷射体积，所述油例如矿物油。用于在尖端和基底之间接触的适合的液体包括有机液体聚合物(例如油)和基于硅的聚合物，例如硅酮。硅酮的示例是聚二甲硅氧烷。半球形的油滴被假定用于体积计算。喷射体积随所施加电压的时间推移呈现线性。直径小至3 μ m的斑点尺寸可被沉积。图4显示磺酰罗丹明图形化的斑点的阵列的示例，其中平均斑点直径为4±0.8μπι。此处呈现的结果代表了单个纳米吸管；通过线性拟合这些数据获得参数并可在纳米吸管之间不同。然而，可通过在油中喷射微滴容易校准每一个纳米吸管，用于标准化的阵列打印。另外，通过逆转跨管筒的偏压，可从不同的管筒中可控地喷射不同的物质。通过用单独的物质装载每一个管筒，可以以单一的图形化运行以预存的式样放置多层图形。
[0113]可通过使用蛋白、聚合物包括有机聚合物或生物聚合物，在基底上界定细胞待被附着用于培养的基底上的图形。图形化优选被用于界定可进行单独的细胞生长的一些不连续的区域。图形化物质的示例包括，但不限于，聚赖氨酸、牛血清白蛋白(BSA)和表面粘附分子，例如，纤连蛋白或层粘连蛋白。可通过将量子点与电解质溶液混合确认图形沉积。可使用例如荧光显微术可视化沉积以评价图形并检查打印中的错误。随后，在沉积后，在自我遮罩步骤中洗涤基底。具有遮罩分子的适合的缓冲液可被用于洗涤步骤。用于遮罩的分子的示例包括牛血清白蛋白(BSA)。图形界定之后，可将基底浸入细胞培养基中。可将细胞分散于培养基并允许细胞定殖在基底上。孵育几个小时之后，用预热的培养基温和地冲洗细胞以去除没有稳固地附着至基底的任何细胞。定性并定量地评价细胞附着。
[0114]细朐沣射
[0115]在另外的实施方案中，本纳米吸管系统被用于以高通量的方式并以最小的细胞损伤将物质电渗注射入单个活细胞中。该方法的优势为高度自动化的注射性质、注射体积的精确控制和高的细胞活性。此外，下面呈现了用于提高全系统自动化潜力的细胞固定的细胞筛设备。
[0116]可使用以适合的缓冲液和待被注射的物质回填的双管筒纳米吸管(图2中显示)执行细胞注射。适合的缓冲液包括分子生物学研究中通常使用的磷酸盐、柠檬酸盐或任何其他缓冲液。待被注射的物质包括，但不限于，小分子、代谢物、核酸、寡核苷酸、肽、氨基酸。图2说明使用双管筒吸管202的细胞穿入，双管筒吸管202具有管筒204、206和在管筒中的电极208、210，每一个管筒中一个电极。吸管202将被连接至压电控制器，如图1中显示的。双管筒吸管提供了允许一个管筒相对于可作为接地电极(见图1中的电极122)的另一个管筒的偏压的优势，取消了对如`单管筒吸管中常见的外部接地电极的需求。这具有消除用单管筒吸管和外部接地电极可能出现的任何电穿孔作用的另外的优势。从纳米吸管的尖端的喷射率取决于所施加的电压和所施加电压的持续时间二者(图3)。在吸管尖端浸入矿物油情况下，喷射体积随所施加的电压的时间推移呈现线性，所施加的电压是100V。通过测量喷射的物质的液滴尺寸将矿物油仅用于校准的目的。由于水溶液不可溶于矿物油，矿物油包含被喷射的物质。
[0117]使用以上图1中描述的电路执行并使用定制软件控制，将物质从被连接至电源118的管筒202注射入细胞212。显示注射为在细胞212的胞质区中进行，但注射入观察到的细胞核214中也可被实现。将细胞放置在可如图6中显示所建立的固体支持物216上。可将细胞包括细菌、真菌、动物、哺乳动物细胞或来自细胞系的细胞用于注射的目的。通过缓慢降低纳米吸管至细胞膜以内的50nm至200nm之间、优选~IOOnm实现注射,在那里纳米吸管进入反馈并被停止。随后将纳米吸管快速降低0.5 μ m至2 μ m之间、优选0.9-1.2 μ m之间穿入细胞膜。当降低速度时，纳米吸管的速度可以在50 μ m/s至200 μ m/s之间，优选大于80 μ m/s。将低电压反馈系统从纳米吸管断开并通过高电压继电器持续预定量的时间连接高电压电源。用于反馈的低电压包括小于2V、优选小于IV的电压。用于反馈的高电压包括大于0.5V、优选大于IV的电压。使用两个不同的电源；一个具有-1V至+IV的电源范围用于定位吸管且另一个具有-1OOV至+100V的范围用于注射。典型的细胞注射从约5-30V的范围，但只要喷射是可重现的且电压不会损伤细胞，这些范围可以不同。随后通过电阻器将纳米吸管放电并以高速度将纳米吸管收回。图5显示将染料羧基荧光素注射入HeLa细胞的示例。没有细胞损伤是直接可见的，且荧光限定持续几分钟被限定在细胞壁内(图5)。
[0118]细胞基底图形化
[0119]本发明另外的方面涉及被设计并制造用于细胞固定的细胞筛或以有序阵列中包含珠的分子结构。通过将细胞固定在有序的阵列中，可控制SICM顺序地处理阵列中的每一个元件，减少对操作者分别单独注射每一个细胞的需求。使用标准的半导体制造技术制造该筛(图6A-E)。简要地，将500nm至1000nm层、优选~750nm层的硅盐(例如，氮化硅)602沉积在硅片604的表面。硅片可以是200 μ m至1000 μ m之间厚、优选300-600 μ m之间厚。使用反应性离子蚀刻以具有合适的孔距的阵列将I μ m至5 μ m、优选2_3 μ m的孔606蚀刻穿过硅盐层。适合的孔距大于50 μ m、优选约100 μ m孔距。将可被用于SICM对齐的基准点标记物(未显示)蚀刻入阵列的一个角中。随后以适合的碱(例如，氢氧化钠或氢氧化钾)蚀刻硅片背面608以界定孔下面的腔610、及用于施加负压至腔的通道612。随后将硅片固定至封住被蚀刻的腔和通道的玻璃晶片614。对称地设计该设备以致两个阵列存在于该设备的相对的两端。通过打破一个阵列上的硅盐层并连接在其上连接真空管路的倒钩616完成设备。在另一个阵列的附近，连接具有适合的聚合物的塑料环618以作为允许将细胞浸入细胞培养基的细胞培养腔。适合的聚合物包括包含硅聚体的有机聚合物，例如硅酮。硅酮的示例是聚二甲硅氧烷。可将设备用于固定分子包括但不限于，聚合物。可将分子包含在珠620中。通过施加负压至设备的通孔固定细胞或分子。可将细胞放置在由孔界定的阵列中，如示例性的珠620所显示的。
[0120]作为示例，使用10 μ m荧光聚苯乙烯球测试该设备(黄绿色-吸收:505 ;发射:515)。球粗略地为哺乳动物细胞的尺寸并提供了用于测试设备的好的模型。通过施加负压至该设备的通孔成功地固定了球`。温和洗涤之后，观察到所有通孔在每个孔上都固定了单个聚苯乙烯球(图6E)。在另外的示例中，细胞筛被用于固定HeLa细胞。将细胞悬浮在
0.1MPBS中并通过施加负压至通孔成功地固定了细胞。
[0121]单细胞内的分子感测
[0122]本发明另外的方面涉及被官能化作为传感器的纳米吸管和与xyz控制注射设备偶联的组合，如图1中显示的。纳米吸管传感器几何上与锥形光纤极其类似；可使用相同的激光拉伸过程制造它们，然而，传导机制从根本上不同。关于光纤的生物检测依赖于荧光标记的分析物的检测或依赖于ELISA-类似的读出，而纳米吸管传感器读出仅仅是有关电的且不需要生物分子标记。纳米吸管传感器的灵敏度在锥形形状的纳米吸管尖端处被最大化，使得尖端孔的尺寸和几何形状对生物传感器的表现是重要的。来自恒定结合在纳米级-尺寸的尖端开口处的门控，造成纳米吸管电特征的独特的变化。随后用简单的电化学装备实时检测电变化，不需要任何标记。类似于光纤，纳米吸管传感器可与压电驱动器被整合在一起以实现高空间分辨率，如扫描离子电导显微术中所使用的。纳米吸管传感器和SICM的该组合被用于包括多细胞和单细胞的表面的形貌成像。另外的应用是使用无标记的生物传感器检测单个活细胞中包括蛋白和核酸的代谢物和分子。在一些实施方案中，可执行单个活细胞内的免疫分析。另外的应用是检测单个癌细胞中的癌基因蛋白。另外的应用是实时并以纳米级分辨率测量单细胞中的生物活性。例如，其可被用于研究单细胞中蛋白-蛋白相互作用。
[0123]图9A是使用本文呈现的技术描绘细胞的形貌成像的漫画。细胞902内的分子检测依赖于高精度的纳米操纵器和电流反馈环以将纳米吸管传感器904插入至探针细胞内的确定的深度。当纳米吸管904靠近细胞表面，由于扫描离子电导显微术中所使用的众所周知的效应“电流挤压”，通过在其中具有单孔和电极906的吸管904的离子电流将降低。通过监测离子电流，纳米吸管的精确位置可被确定且使用反馈电路和xyz控制器被控制在细胞膜的~200nm内，如图1中显示的。另外，反馈机制确保了纳米吸管尖端不会接触到除了细胞膜的任何事物，防止可能通过接触其他结构或基底将尖端破坏。可将细胞铺板在用一层适合的聚合物涂覆的平面908上(例如，培养皿、载玻片)。适合的聚合物包括包含硅聚体的有机聚合物，例如硅酮。硅酮的示例是聚二甲硅氧烷。可以用适合的缓冲液包括，但不限于磷酸盐、柠檬酸盐缓冲液覆盖细胞。当电渗流从纳米吸管的管筒向外定向时，纳米吸管传感器可在正电压(例如，在+IOOmV至+1000mV、优选大于+500mV的电压)时有偏压。该配置避免了存在于介质中的任何细胞碎片或分子与传感器相互作用并影响其表现。反馈环以约IOnm的步幅降低传感器直至电流被减少至其初始值的70%至99%、优选大于99%。在该细胞膜上方的该初步定位之后，以50 μ m/s至200 μ m/s之间、优选在80-150 μ m/s之间的速度将纳米吸管插入细胞约2 μ m、优选大于I μ m。以非常高的速度插入传感器以减少对细胞的干扰并最大化细胞活性。可在相同的细胞上执行多穿入，纳米吸管电流基线和细胞活性没有任何显著的变化。插入细胞内后，将具有250mV至500mV之间的振幅和IHz至IOHz之间、优选大于4Hz的频率的AC电压施加至纳米吸管传感器以执行感测。
[0124]本纳米吸管传感器包含官能化的纳米吸管，被用于本设备的传感组件。在两个本发明人的早期美国专利申请公布(2010年3月25日公布的、题为“Functionalized纳米吸管Biosensor”的美国2010/00 72080)中描述了官能化的纳米吸管，其通过引用并入本文。简要地，可通过化学连接至分子包括聚合物、多糖和生物分子包括但不限于抗体、肽和生物聚合物官能化纳米吸管。可用丙烯酸单元的聚合物聚丙烯酸(PAA)涂覆传感器的内表面。PAA的分子式为(C3H402)n。在中性pH的水溶液中，PAA的许多侧链失去它们的质子并获得负电荷。这使得PAA为聚电解质。可与多糖或蛋白结合进一步官能化表面。检测与纳米吸管传感器的结合是基于电流整流。这指的是当带电纳米孔响应对称的输入电压时，具有非对称的电流输出的效应。当扩散的双电层厚度与孔尺寸可比时，纳米孔表面所固定的带电物质和溶液中离子物质之间的静电相互作用改变了纳米吸管的选择通透性。整流系数，r，被定义为在特定正电压时所测量的电流和在相同的但具有相反的极性的电压时所测量的电流之间的比的对数。
L
[0125]r = log ?ο =
[0126]该系数是纳米吸管的整流特征的有用的指示并因此是传感器表面所固定的电荷的有用的指示。带负电荷的石英纳米孔显示负的电流整流(r〈0)。通过用带电的功能层诸如多聚-L-赖氨酸、树状聚合物、氨基硅烷和壳聚糖修饰纳米孔表面可转化整流(r>0)。实施例
[0127]实施例1:材料与方法[0128]双管筒纳米吸管制造:从具有外径为1.2mm和内径为0.90mm的Θ石英毛细管(QT120-90-7.5; Sutter Instrument C0.)制造纳米吸管。随后使用具有双线程序编程的P-2000激光拉伸仪(Sutter Instrument C0.)拉伸毛细管以制造具有内径为~50nm的纳米吸管。所用参数为:热 650、Fil4、Vel20、Dell70 和 PulO ;热 750、Fil4、Vel40、Dell70 和Pul200。所得纳米吸管尖端具有~50nm的内径。
[0129]细朐培养:在5%C02中于37°C在用薄层PDMS覆盖的培养皿上，在包含10%胎牛血清、1%丙酮酸钠和l%Pen/Str印/Glu的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中培养(37°C、5%C02) HeLa细胞(实验室中所保存)。
[0130]试剂:多聚-L-赖氨酸(PLL;I932O-A)从 Electron MicroscopySciences (Hatfield, PA)购买。Dulbecco 改良 Eagle 培养基(MT10017CV)、胎牛血清(BW14502F)、丙酮酸钠(BW13115E)和 Pen/Str印/Glu (SV3008201)从 Fisher 购买。聚二甲
硅氧烷从Dow Corning购买(Sylgard1( 184娃橡胶试剂盒)。(BSA, Qdots)。使用标准方法
制备pH7.4的PBS溶液。使用具有>18ΜΩ cm 1电阻的MilliQ水制备含水试剂。
[0131]电滲喷射的测暈装备:该装备由用于吸管偏压和电流测量的低噪音放大器(Axopatch200B, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)、用于 X、Y 和 Z 方向的粗控制的显微操纵器(MP-285)、用于X、Y和Z方向的精细控制的压电驱动器和用于系统的硬件控制的FPGA (National Instruments)组成。用低噪音高电压电源(Model2100Isolated PulseStimulator, A-M Systems)和用于在反馈控制所需的低电压与电泳物质喷射所需的高电压之间转换的定制继电器进一步改进该系统。使用写入LabVIEW中的定制编码的软件控制该系统。
[0132]实施例2:使用纳米吸管传感器的单细胞体内免疫分析
[0133]实验部分
[0134]测暈装配:由于流经纳米吸管的电流太小无法极化参比电极，因此使用了两个电极装备。用工作缓冲液回填作为工作电极的纳米吸管传感器，并插入Ag/AgCl电极。将另一个Ag/AgCl电极放置在本体溶液中作为辅助/参比电极。将电极都连接至具有DigiDatal322A数字转换器的Axopatch700B放大器(Molecular Devices)和配备pClamplO软件的PC (Molecular Devices).在室温下进行的测量的过程中，保持该系统不被搅动。
[0135]试剂:多聚-L-赖氨酸(PLL;I932O-A)从 Electron MicroscopySciences (Hatfield, PA)购买。多克隆抗体 HPV16E6 (C-19)和 HPV18E6 从 Santa CruzBiotechnology, Inc.(Santa Cruz, CA)购买。Dulbecco 改良 Eagle 培养基(MT10017CV)、胎牛血清(BW14502F)、丙酮酸钠(BW13115E)和 Pen/Str印/Glu (SV3008201)从 Fisher 购
买。聚二甲硅氧烷从Dow Corning购买(Sylgardkl 184娃橡胶试剂盒)。使用标准方法制
备pH7.4的PBS溶液。使用具有>18ΜΩ cm 1电阻的MilliQ水制备含水试剂。
[0136]纳米传感器制造:从具有外径为1.0mm和内径为0.70mm的具有细丝的石英毛细管(QF100-70-5; Sutter Instrument C0.)制造纳米吸管。随后使用经编程的P-2000激光拉伸仪(Sutter Instrument C0.)拉伸毛细管以制造具有内径为~50nm的纳米吸管。所用参数为:热700、Fil4、Vel60、Dell50和Pull92。所得纳米吸管尖端具有从37nm至82nm范围的内径，平均直径为56nm。
[0137]抗体固定:通过下面的步骤固定抗体。首先，通过用水中0.01%多聚-L-赖氨酸溶液填充、随后通过在4600rpm离心3min内部涂覆纳米吸管。离心步骤辅助使得溶液到达纳米吸管的最尖端。去除过量的PLL溶液之后，将纳米吸管在120°C烘烤Ih以稳固PLL涂覆。随后用硫代-SMCC溶液(2mg/ml、IOmM EDTA、50mM PBS)填充纳米吸管、在4600rpm离心3min并随后于室温孵育lh。随后用0.01M PBS冲洗并离心纳米吸管至少3次以去除任何未反应的硫代-SMCC分子。硫代-SMCC包含与PLL氨基反应的胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺(NHS酯)，留下可用于抗体通过硫醚键交联的马来酰亚胺基团。随后将纳米吸管与抗体溶液一起孵育(10μ g/ml IgG、PBS、lh、37°C)。随后用PBS冲洗并离心经抗体官能化的纳米吸管至少3次，以去除任何未结合的抗体并提供填充整个尖端的纯净的电解质。
[0138]细朐裂解:将Hela细胞冷冻为在生长培养基中(10%DMS0)包含~IO6细胞的等份。解冻后，将细胞向下旋转以成团，丢弃上清液并重悬于100 μ L的PBS溶液。使用由S-seriedSonoLAB软件控制的Covaris?以裂解细胞膜。条件:占空度:5%、强度3、循环/脉冲200，持续60s。在4000rpm持续5分钟离心细胞裂解物以从细胞碎片中分离生物分子。将小瓶放置在冰中并在2小时内使用以最小化蛋白酶抑制。
[0139]扫描离子电导显微镜:SICM是由内部制造的并基于电流放大器(MolecularInstruments, Multiclamp700B)、用于粗控制的显微操纵器(Sutter Instruments, MP-285)和用于精细控制的压电驱动器(Phyzik Instrumente, NanoCube)。使用内部专门开发用于该应用的用户定制软件(LabView)控制该装备。
[0140]细朐培养:在5%C02中于37°C在用薄层PDMS覆盖的培养皿上，在包含10%胎牛血清、1%丙酮酸钠和l%Pen/Str 印/Glu的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中培养(37°C、5%C02) HeLa细胞(实验室中所保存)。
[0141]细胞内蛋白检测
[0142]本纳米吸管传感器能够选择性离体检测细胞中的癌基因蛋白。首先，研究了纳米吸管传感器区分不同的HPV基因型的选择性。用靶向HPV18E6的抗体官能化探针传感器，而对照探针则包含HPV16E6。HPV-18E6是已知的人中的“恶性”蛋白。见，Li等人，“The human papilloma virus (HPV)-18E6oncoprotein physically associates withTyk2and impairs Jak-STAT activation by interferon-alpha,，，0ncogenel8 (42):5727-5737(1999)。在 Gewin 等人，“ Identification of a novel telomerase repressorthat interacts with the human papillomavirus type-16E6/E6-APcomplex,，，GenesDev.18(18):2269-2282(2004)中进一步描述了 HPV16E6。将两个传感器都浸入包含IOOpg/mL的HPV18E6抗原的溶液中。特异性的蛋白-蛋白相互作用通过逐步封闭探头传感器快速降低了电流振幅(图10)。它们在极为临近纳米吸管传感器开口处的连续结合改变了局部阻抗，因此引起所记录的离子电流的逐步变化。在对照传感器中没有观察到这些永久的封闭，其电特征没有被HPV18蛋白E6抗原扰乱。此外，这些封闭还与分子易位所产生的封闭是不同的，如穿过纳米吸管的蛋白分子产生具有持续以微秒计范围的较短和临时的封闭。
[0143]其次，检测了纳米吸管传感器在细胞裂解物中的选择性。执行从包含~IO6HeLa细胞的等份的连续稀释以确定传感器的灵敏性。350，OOOx稀释没有导致无修饰的和HPV16E6官能化的纳米吸管中的任何变化，而在HPV18E6修饰的纳米吸管传感器中检测到所测量的电流中7%的变化(图11)。对照传感器仍然没有响应10倍高浓缩的样品，而探针传感器中所测量的电流下降了其初始值的23%。结果被总结在表1中。
[0144]表1:纳米吸管传感器至连续稀释的IOsHeLa细胞裂解物的输出电流的归一化变化
[0145]
【权利要求】
1.一种用于在基底上操作单个细胞的装置，包括: (a)多管筒纳米吸管，具有 (i)第一管筒，所述第一管筒包含被布置与所述第一管筒中液体接触的第一电极； (ii)第二管筒，所述第二管筒临近所述第一管筒，所述第二管筒包含被布置与所述第二管筒中液体接触的第二电极；和 (iii)放大器，所述放大器被连接至所述第一电极，用于控制所述第一电极和所述第二电极之间的电压； (b)xyz控制器，所述xyz控制器被连接至所述多管筒纳米吸管，所述xyz控制器用于产生所述多管筒纳米吸管以亚微米X和I步长的机械移动并产生所述多管筒纳米吸管在z方向朝向或远离所述基底的移动，所述xyz控制器还具有用于根据用户定义的控制来控制所述机械移动的电子控制部件；和 (c)电路，所述电路用于控制所述第一电极和所述第二电极之间的电压并用于在所述纳米吸管中的液体待被喷射的预期位置施加喷射电压至所述第一电极以从所述第一管筒喷射液体并当所述xyz控制器产生所述纳米吸管远离所述预期位置的机械移动时去除所述喷射电压，据此 所述单个细胞能够与被喷射的液体接触。
2.根据权利要求1所述的装置，其中用于控制电压的所述电路包含用于提供吸管偏压和用于和对通过所述第一管筒的离子电流进行电流测量的低噪音放大器。
3.根据权利要求1所述的装置，所述装置还包含用于所述xyz控制器的亚微米控制的压电驱动器。`
4.根据权利要求1所述的装置，所述装置还包含用于用户输入以确定所述预期位置的现场可编程门阵列FPGA。
5.根据权利要求4所述的装置，其中所述FPGA被编程用于将斑点以图形沉积在所述基底上。
6.根据权利要求4所述的装置，其中所述FPGA被编程以注射所述基底上的预定位置处的细胞。
7.根据权利要求6所述的装置，其中所述FPGA被编程以注射所述细胞内的细胞器。
8.根据权利要求1-7中的一项所述的装置，所述装置可操作地连接至适于容纳多个单个细胞、每个单个位置处一个细胞的基底。
9.根据权利要求8所述的装置，其中所述基底在其中具有被界定的腔，所述腔尺寸为用于接收单个细胞进入单个腔。
10.根据权利要求9所述的装置，其中所述基底包含用于施加负压以维持细胞在腔内的通孔。
11.根据权利要求10所述的装置，其中所述腔包含用于吸引细胞至所述腔的电极。
12.一种用于将液体以具有亚微米特征的预先确定的图形沉积的方法，包括步骤: (a)将待被沉积的液体放入多管筒纳米吸管中，所述多管筒纳米吸管具有 (i)第一管筒，所述第一管筒包含被布置与所述第一管筒中液体接触的第一电极； (ii)第二管筒，所述第二管筒临近所述第一管筒，所述第二管筒包含被布置与所述第二管筒中液体接触的第二电极；和(iii)放大器，所述放大器被连接至所述第一电极，所述放大器用于控制所述第一电极和所述第二电极之间的电压； (b)驱动被连接至所述多管筒纳米吸管的xyz控制器，用于产生所述多管筒纳米吸管以亚微米X和y步长的机械移动并产生所述多管筒纳米吸管在z方向朝向或远离基底的移动，所述xyz控制器还具有用于根据用户定义的控制来控制所述机械移动的电子控制部件；和 (c)使用电路来控制所述第一电极和所述第二电极之间的电压并用于在所述纳米吸管中的液体待被喷射的预期位置施加喷射电压至所述第一电极以从所述第一管筒喷射液体并当所述xyz控制器产生所述纳米吸管远离所述预期位置的机械移动时去除所述喷射电压，据此 将所述液体以所述预定的图形沉积。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述液体包含细胞粘附物质，该细胞粘附物质用于允许细胞仅在沉积了细胞粘附物质的区域附着在基底上。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述细胞粘附物质为层粘连蛋白。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述基底包含均匀的聚合物上表面。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述液体包含细胞粘附物质，该细胞粘附物质用于允许细胞仅在沉积了细胞粘附物质的区域附着在所述基底上，并且，所述方法还包含向所述基底施加待被培养的粘附细胞的步骤，据此所述细胞仅粘附在具有细胞粘附物质的区域。
17.根据权利要求12所述的方法，其中具有细胞粘附物质的区域是以每100平方微米约至少10斑点的密度。
18.根据权利要求12所述的方法，其中所述方法被用于沉积来自所述纳米吸管的不同管筒的不同物质。
19.根据权利要求12-18中的一项所述的方法，其中所述纳米吸管由石英制成并具有约20nm至IOOnm的开口。
20.一种用于将物质注射入基底上的细胞中的方法，包括步骤: (a)将待被注射的液体放入多管筒纳米吸管，所述多管筒纳米吸管具有 (i)第一管筒，所述第一管筒包含被布置与所述第一管筒中液体接触的第一电极； (ii)第二管筒，所述第二管筒临近所述第一管筒，所述第二管筒包含被布置与所述第二管筒中液体接触的第二电极；和 (iii)放大器，所述放大器被连接至所述第一电极，所述放大器用于控制所述第一电极和所述第二电极之间的电压； (b)驱动被连接至所述多管筒纳米吸管的xyz控制器，用于产生所述多管筒纳米吸管以亚微米X和y步长的机械移动并产生所述多管筒纳米吸管在z方向朝向或远离基底的移动，所述xyz控制器还具有用于根据用户定义的控制来控制所述机械移动的电子控制部件；和 (c)使用电路来控制所述第一电极和所述第二电极之间的电压并用于在所述纳米吸管中的液体待被喷射的预期位置施加喷射电压至所述第一电极以从所述第一管筒喷射液体并当所述xyz控制器产生所述纳米吸管远离所述预期位置的机械移动时去除所述喷射电压，据此所述液体被注射入所述细胞。
21.根据权利要求20所述的方法，所述方法还包含通过将所述细胞放置在所述基底中的腔内而将所述细胞固定在所述基底上的步骤，所述腔尺寸为仅容纳单个细胞。
22.根据权利要求21所述的方法，所述方法还包含施加跨所述腔的压差以辅助固定所述细胞的步骤。
23.根据权利要求21所述的方法，其中被注射的所述物质选自由以下组成的组:多核酸、抗体和染料。
24.一种用于检测基底上单个细胞中的分析物的装置，包含: (a)纳米吸管，所述纳米吸管具有包含第一电极的管，所述第一电极适于在接触所述细胞的液体中维持所述分析物与参比、第二电极接触并被连接至用于在使用过程中控制所述第一电极和所述第二电极之间的电压的电路；和 (b)xyz控制器，所述xyz控制器被连接至所述纳米吸管，用于产生所述纳米吸管以亚微米X和y步长的机械移动，并产生所述纳米吸管在z方向的移动,所述xyz控制器还具有用于根据用户定义的控制来控制所述机械移动的电子控制部件；和((3)所述纳米吸管尖端，所述纳米吸管尖端具有被固定在所述细胞内靠近尖端的内表面的分析物结合物质。
25.根据权利要求24所述的装置，其中所述分析物结合物质是蛋白或多核酸。
26.根据权利要求24所述的装置，其中所述分析物结合物质是通过硫代-SMCC连接至涂覆在所述内表面上的PLL的蛋白。
27.一种检测单个活细胞内的生物分子的方法，包含: Ca)将官能化的纳米吸管放置在所述细胞内的所确定的深度； (b)监测电流以控制将纳米吸管靠近细胞膜来精确定位； (C)以高速度将纳米吸管插入所述细胞； (d)施加高电压；和 Ce)测量电压变化以检测所述细胞中的生物分子， 其中所述官能化的纳米吸管被包含在一系统中，所述系统还包含用于吸管偏压和电流测量的放大器、用于X、Y和Z方向中控制的显微操纵器、用于Χ、Υ和Z方向中精细控制的压电驱动器、可配置的集成电路、高电压电源和用于在低电压和高电压之间转换的继电器。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述纳米吸管经抗体官能化。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述纳米吸管经适体官能化。
30.根据权利要求27所述的方法，其中所述方法被用于单个活细胞中的免疫分析。
31.根据权利要求27所述的方法，其中所述纳米吸管经受体配体官能化。
32.根据权利要求27所述的方法，其中所述检测是检测单个活细胞中的癌基因蛋白。
【文档编号】C12M1/42GK103502424SQ201280021459
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2012年2月27日 优先权日:2011年3月3日
【发明者】R·亚当·赛格, 保罗·阿克蒂斯, 波阿斯·维洛兹尼, 纳德·普曼德 申请人:加利福尼亚大学董事会