蛋白等电点W及分子量的相关分 析。该基因编码蛋白含671个氨基酸，分子量为74KD，等电点为7.85。
[0039] (二)棉花L服2的诱导表达分析
[0040] 所用棉花为3个星期苗龄，病原菌培养条件为:菌株为落叶型强致病力病原菌V991 (徐荣旗，汪佳妮，陈捷胤等.棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体表型特征和侧翼序列分析.中 国农业科学，2010,43(3) :489-496;张天真，周兆华，巧留芳，等.棉花对黄萎病的抗性遗传 模式及抗(耐）病品种的选育技术.作物学报，2000,26(6):673-680)和非落叶型菌株BP2 (Baolong Zhang,Yuwen Yang,Tianzi Chen et al. Island Cotton GbvelGene Encoding A Receptor-Like Protein Confers Resistance to Both Defoliating and Non- Defoliating Isolates of Ve;rticillium d址liae,PloS ONE,7(12) :e51091)。病原菌经 PDA平板活化后，从菌落边缘挑取菌块放入PDB培养液（马铃馨200g，沸水煮40分钟，双层纱 布过滤，加入20g葡萄糖，定容至1L，121°C高溫高压灭菌20min)，25°C，120r · min培养5-6d， 用纱布过滤培养液，镜检并用血球计数板计数。接种方法为薩根法(Fradin F.，Abd-E 1 - Haliem A. ,Masini L.et al, Interfamily Transfer of Tomato VeIMediates Verticillium Resistance in Arabidopsis,Plant Physiology,2011,156:2255-226)，将 分生抱子浓度调整为IX lO^mL，将棉花根系洗净在分生抱子野种浸泡5min后，栽入±中。 分别采集未诱导和诱导后棉花根系，提取总RNA并合成cDNA，并进行后续的RT-PCR分析(RNA 提取方法及cDNA合成方法见附录），引物序列为：
[0041 ] P5:5 '-ATTGGGAACTTTGGTATGGCAAG-3 '
[0042] P6:5 '-CATAAGCAAATATGTCAATGCCTG-3 '。
[0043] 表达分析结果显示V991和BP2处理2d后，根系中L服2基因表达量明显增加，上调表 达，V991处理在8天达到最高，而BP2处理在12天达到最高（图1)。
[0044] (四）LRK1基因植物表达载体的构建W及植物转化
[0045] W上述已经构建好的pGEM-T easy:L服2质粒为模板，用Xbal/BamHI酶切，并回收 201669片段，与9〔曰11161曰2301载体连接，经测序验证100%匹配，获得的阳性质粒命名为 pCambia2301:L服2。提取质粒后，用冻融法将重组载体质粒转化农杆菌LBA4404(上海北诺 生物科技有限公司）。用薩花法转化拟南芥，在1/2MS卡那抗性(2化g/mL)筛选获得T1代植 株，用基因 PCRW及RT-PCR分别在DNA和RNA水平上检测目的基因是否转入W及是否成功表 达，在DNAW及RNA水平均能扩增获得片段的则视为阳性转化株，引物为
[0046] P3:5 '-CAGGATCTCAGAATGCCGGA-3 '
[0047] P4:5 ' -TGCCCTTMTTCATCTGCGC-3 '
[0048] 扩DM扩PCR鉴定82化p大小片段（图2)。通过PCR鉴定可扩增片段的T1代植株为候 选，再利用RT-PCR检测，可扩增出821bp片段的则为表达的T1阳性株（图3)。收获T1代转基因 植株种子为T2代。将转基因植株种子T2代播种于含有25mg/L卡那霉素的1/2MS培养基，挑选 绿色植株移栽至营养±中生长并用于抗病性鉴定。
[0049] (五)T2代转化株的抗病性鉴定
[0050] 对LRK2基因可W正常表达的转化株系进行抗病性鉴定。将经含有卡那霉素的1/ 2MS培养基筛选的绿苗转入营养±中，每盆移栽1株幼苗。待拟南芥生长2周后进行抗病性鉴 定。所用菌株分别为棉花黄萎菌落叶型强致病力菌株V991 (徐荣旗，汪佳妮，陈捷胤等.棉花 黄萎病菌T-DNA插入突变体表型特征和侧翼序列分析.中国农业科学，2010,43(3) :489- 496;张天真，周兆华，巧留芳，等.棉花对黄萎病的抗性遗传模式及抗(耐)病品种的选育技 术.作物学报，2000,26(6) :673-680)和非落叶型菌株BP2(Baolong Zhang,化wen Yang, Tianzi Chen et al. Island Cotton GbvelGene Encoding A Receptor-Like Protein Confers Resistance to Both Defoliating and Non-Defoliating Isolates of Vedicillium d址liae，PloS 0肥，7(12):e51091)。病原菌经PDA平板活化后，从菌落边缘 挑取菌块放入PDB培养液，25°C，120r · min培养5-6d，用纱布过滤培养液，镜检并用血球计 数板计数，调整抱子浓度为1 X 1〇7，每种病原菌的鉴定株数40株，接种后每天观察病害的发 生情况，在15天后就可W明显看见发病症状，主要表现为叶片黄化，萎黨，生长延缓。抗病性 鉴定结果显示，对于落叶型黄萎病V991，对照野生型病指达到61.2%，而转基因株系的平均 病指仅为18.95%;对于非落叶型黄萎病BP2,对照野生型病指达到55.7%，而转基因株系 的平均病指仅为16.6 % (图4，图5)。进一步提取发病拟南芥植株DNA，并通过PCR对发病的拟 南芥的菌丝进行定量。数据显示定量结果与表型一致，接种V991的转基因植株中的菌丝含 量仅为野生型拟南芥18.73%，而接种BP2的转基因植株中菌丝含量仅为野生型含量的 15.87% (图6)。表明L服2可显著增强拟南芥对落叶型菌系V991W及非落叶型菌系BP2的抗 性。
[0051 ]附录：
[0052] 1.RNA提取方法
[0053] (1)取材料加液氮充分研磨成粉末状转运至离屯、管中；
[0054] (2)加10倍体积的RNA提取缓冲液，震荡混匀，50°C水浴约20min，中途可混合2-3 次；
[005引（3)加0.6倍体积的氯仿，混匀，静置冰浴20min;
[0056] (4)12000巧m离屯、20min，将上清转运至一新离屯、管中；
[0057] (5)加1/2体积的SMLiCl溶液，冰浴过夜（1化W上）；
[0058] (6)120(Κ)巧m离屯、20min，弃上清，用70%酒精洗沉淀1次并将沉淀转运至一新的离 屯、管中；
[0059] (7)12000巧111离屯、2〇111；[]1，弃乙醇溶液，沉淀抽干2〇111；[]1;
[0060] (8)加200U1无 R化S e的水溶解沉淀，加1倍体积的水饱和酪/氯仿=1:1充分混匀， 静置5min;
[0061] (9) 1200化pm离屯、20min，将上清转运至另一新的离屯、管中，再加1倍体积的水饱和 酪/氯仿=1:1重复抽提一次；
[0062] (10) 1200化pm离屯、20min，上清加1倍体积的氯仿抽提一次；
[0063] (11)12000巧111离屯、20111111，上清加1/^2体积81 ^0溶液，冰浴过夜（1化^上）；
[0064] (12)12000巧111离屯、20111111，沉淀用70%酒精洗一次。抽干后溶于100-200111无1?^36 的水中。取化1检测质量。
[006引 2.CDNA的合成
[0066] 将提取的RNA用DNasel 37°C纯化处理30min后备用。用TransScript Reverse Transc;rip1:ase试剂盒（Transgen公司）合成第一链cDNA。体系如下： RNA 模板 ?.ΟμΙ^ 引物(500μιιιοΙμυ?) J.O.uL clNTPdOmmol.uL·') Ι.ΟμΙ.
[0067] 5\RTbu 化 r 4.0μΙ_. R化onucicasc Inhibhor(Rl) 0,.弓)_iL Transcript RT 1,.'0|止 DEPC ddH：0 补至 20.0μΙ>
[006引 42°C 45min，85°C 5min。于-20°C保存。
[0069] LRK2基因，其序列为沈Q ID NO.l:
[0070]
【主权项】
1. 赋予植物黄萎病抗性的LRK2基因，其序列为SEQ ID NO.l。2. 权利要求1所述LRK2基因的应用。3. 权利要求1所述LRK2基因在植物黄萎病抗性中的的应用。4. 权利要求1所述LRK2基因在拟南芥植物黄萎病抗性中的的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，包括： 1. LRK2基因的克隆以及植物表达载体的构建 以陆地棉品种奥3503的cDNA为模板，用引物 PI:5 '-TGCTCTAGAATGGCATCTGTAATGAGTAA-3 '， P2:5 '-CGCGGATCCTCACAGATTGGATGTTGTG-3 ' 扩增得到2016bp片段，将该片段命名为LRK2，PCR产物纯化后用Xbal/BamHI酶切，连接 到pCambia2301载体，测序后成功构建的重组载体命名为pCambia2301:LRK2; 2) 转基因植株的获得 将步骤1)中构建好的pCambia2301: LRK2质粒用冻融法转化农杆菌LBA4404，用蘸花法 转化拟南芥，当代的拟南芥植株为T0代，收获的种子为T1代，T1代种子在含25mg/mL卡那抗 生素的1/2MS培养基上筛选，获得候选的阳性T1植株，分别在DNA和RNA水平上检测目的基因 是否转入以及是否成功表达： 用引物 P3:5 '-CAGGATCTCAGAATGCCGGA-3， P4:5 '-TGCCCTTAATTCATCTGCGC-3 ' 扩增候选的阳性T1代植株的DNA和cDNA进行PCR鉴定，在DNA和cDNA水平均能扩增获得 821bp大小片段的T1植株则为成功转化LRK1的阳性转基因植株。6. 权利要求5所述应用中构建的重组载体pCambia2301: LRK2。
【专利摘要】本发明涉及赋予植物黄萎病抗性的<i>LRK2</i>基因及应用，属于生物技术领域。<i>LRK2</i>基因是从陆地棉品种奥3503品种中获得的一个表面受体蛋白基因，<i>LRK2</i>完整编码框长度为2016个碱基，编码蛋白含671个氨基酸，分子量为74KD，等电点为7.85。<i>LRK2</i>转基因拟南芥对落叶型黄萎病菌V991以及非落叶型黄萎病菌BP2的抗病性明显增强，转基因拟南芥发病率均低于20%，而对照野生型发病率均大于50%。
【IPC分类】C12N15/82, A01H5/00, C12N15/29
【公开号】CN105586348
【申请号】CN201610112767
【发明人】刘廷利, 顾周航, 周雪平, 张保龙, 杨郁文, 陈天子, 凌溪铁, 王金彦
【申请人】江苏省农业科学院, 浙江理工大学
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2016年2月29日