HER2/neu组织特异启动子变异体及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物学和医学领域，更具体地，本发明涉及一种经过优化的肥R2/neu 组织特异启动子变异体及其用途，该启动子变异体可在化r2/neu阳性细胞中驱动其下游 目的基因表达，尤其可驱动目的基因在低氧环境下获得更高效的表达。
【背景技术】
[0002] erbbS基因编码产物是表皮生长因子受体2 (epidermal growth-factor receptor 2)，又称肥R2/neu抗原，其胞内段具有蛋白酪氨酸激酶活性。肥R2/neu与配体结合后可W 活化下游的多个信号途径，包括；Ras/MAPK和PI3K/AKT，最终激活C-化S和c-jun等转录因 子，促进有丝分裂，引起细胞的增殖。肥R2/neu是一种肿瘤相关抗原，过度表达在多种人类 肿瘤组织并与送些肿瘤的发生发展密切相关，包括乳腺癌、卵巢癌、胃肠道肿瘤、肺腺癌等。 因此祀向肥R2/neu阳性肿瘤是肿瘤生物治疗的热点。最显著的是，肥R2基因是影响乳腺 癌预后的一个重要因素，大约有25 % -30 %左右的乳癌患者，受到体内癌细胞肥R-2基因过 量表现的影响，他们的癌细胞不仅繁殖能力强，对部份化学治疗药物也容易有抗药性，造成 病患即使接受手术治疗，癌细胞仍然有较高复发及转移的机率，无法长期存活。乳腺癌病人 可分为化r-2/neu阳性或化r-2/neu阴性两种截然不同的预后之乳癌。肥R-2蛋白过量表 达的肿瘤生长速度较快且生物行为较为恶性，使得手术后复发率高于其他类型的乳癌。因 此，W肥R2/neu抗原为祀标的免疫治疗方案是治疗化r2阳性乳腺癌的研究热点，包括单克 隆抗体、肥R2/neu重组疫苗、肥R2/neu-热休克融合蛋白、肥R2/neu致敏的树突状细胞疫苗 等，其中抗肥R2/neu单抗（英文名；Herceptin;赫赛汀，注射用曲妥珠单抗）已广泛应用于 临床治疗肥R2过度表达的转移性乳腺癌和转移性胃癌，但抗体治疗的成本无疑是昂贵的， 并且对一些正常组织具有一定的毒性。因此，开发祀向肥R2/neu、毒性低、成本低廉、制备方 便、高效的生物新药领域的重要课题。
[0003] 抑癌基因 （tumor suppressor gene)也称为肿瘤抑制基因。抑癌基因的产物能够 在多个环节上保护正常细胞，使其免于最终发生癌变，主要参与抑制细胞增殖、促进细胞分 化、诱导肿瘤细胞调亡和抑制细胞迁移，因此在肿瘤发生发展过程中起负调控作用。抑癌基 因的产物主要包括转录调节因子（如，化、p53)、负调控转录因子（WT)、周期蛋白依赖性激 酶抑制因子（如，Pl5、pl6、p21)、DNA修复因子（如BRCAUBRCA2)、与发育和干细胞增殖相 关的信号途径组分（如，APC、Axin)、信号通路的抑制因子（如ras GTP酶活化蛋白，NF-1)， 石奔月旨酉每（phosphatase and tension homology deleted on chromosome ten gene,PTEN)) 等。肿瘤抑制蛋白Axin是一种多结构域支架蛋白，对Wnt/目-catenin、JNK信号途径具有 负向调控作用，还能够活化另一个抑癌基因 p53,因此参与细胞生长、增殖、分化、癌变和调 亡等多种重要细胞命运的调控过程。在许多肿瘤组织中都发现了 Axin异常表达和功能缺 失，如肺癌、大肠癌、乳腺癌，恶性黑素瘤等，因此Axin功能异常参与多种肿瘤发生、发展的 机制涉及信号转导、细胞周期、细胞增殖、调亡W及细胞黏附等多个方面。PTEN是具有双特 异性磯酸酶活性的肿瘤抑制蛋白，其编码基因在多种恶性肿瘤中发生突变或缺失，导致其 抑癌功能减弱或丧失，在肿瘤的发生、发展中起重要作用。目前发现卵巢癌、乳腺癌、前列 腺癌、子宫内膜癌、恶性胶质瘤等存在PTEN基因的突变、缺失或低表达，从而影响其肿瘤抑 制功能。PTEN主要通过抑制PI3k/Akt/mTor信号转导通路，负向调控细胞的增殖、侵袭、转 移、血管形成和多药耐药等恶性生物学特征。因此，利用携带促进野生型抑癌基因如Axin、 PTEN祀向肿瘤组织可W诱导肿瘤细胞的调亡、抑制肿瘤细胞的过度增殖、促进肿瘤细胞分 化、增加传统化疗药物对相关肿瘤的化疗效果，逆转肿瘤细胞的多药耐药等，目前已经成功 应用于部分肿瘤的临床研究，并取得了初步成果。然而，如何将上述抑癌基因选择性的革己向 肿瘤组织、减少对正常组织的毒性，并在肿瘤组织中获得优势表达，是肿瘤基因治疗领域的 一个迫切需要解决的技术难题。
[0004] 解决肿瘤祀向方面的一条途径是，通过将控制肿瘤相关抗原表达的启动子或调控 元件构建于抗肿瘤基因的上游，使目的基因选择性高表达在表达该肿瘤相关抗原的肿瘤细 胞中，实现目的基因对肿瘤的抑制作用，送一方案无疑拥有潜在的临床应用前景。此外，研 究调控肿瘤相关抗原表达的启动子W及调控序列也对研究肿瘤发生发展的机制具有指导 意义。肥R2/neu是乳腺癌等肿瘤组织特异表达的肿瘤相关抗原，相关文献（Marion Lanteri 等，Breast Cancer Research 2005,7:R487-R494)曾报道过控制肥R2/neu 的启动子基因， 能够将具有细胞毒效应的基因选择性的祀向肥R/neu阳性的肿瘤细胞。
[0005] 肿瘤组织微环境已被公认是促进肿瘤进展的重要因素，其中低氧是肿瘤微环境中 的一个关键病理因素。低氧在肿瘤生物学中的许多方面扮演着重要的角色，包括肿瘤组织 的血管生成、上皮间质转化、侵袭、转移、遗传不稳定性、永生化和干细胞维持、免疫逃避、代 谢、PH调节和放射治疗耐受等。肿瘤内低氧是常见的并且往往是最严重的，正常乳腺组织的 氧分压是65mmHg，而乳腺癌瘤内氧分压是lOmmHg，会增加患者死亡风险，送一风险独立于 肿瘤大小，分期，组织学分型，等级，或淋己结状态等因素。低氧促进肿瘤进程的机制在于， 作为转录因子的低氧诱导因子化ypoxia-irKlucible factor, HI巧促进肿瘤组织中的血管 生成、诱导免疫抑制因子基因（如ID0，TGF-目，比-10等）和癌基因（如，肥R/neu，BCR-ABL， EGFR)但失活抑癌基因（如P53, PTEN等）的表达等。因此将低氧因素考虑到启动子设计 方案中，使目的基因在具有低氧特征肿瘤组织中获得优势表达，是提高肿瘤祀向治疗效果 的一个有效手段。
[0006] 因此针对肥R2/neu阳性肿瘤细胞，改造控制肥R2/neu抗原表达的启动子序列，使 下游目的基因能够在肿瘤低氧微环境下并选择性的在肥R2/neu阳性肿瘤细胞中获得优势 表达，是本发明的目标。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种经过优化的肥R2/neu组织特异启动子变异体及其用 途。
[0008] 在本发明的第一方面，提供一种多核巧酸，所述的多核巧酸选自下组：
[0009] (1)核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示的多核巧酸；
[0010] (2)核巧酸序列在严格条件下能够与SEQ ID NO: 1杂交且具有指导目的基因在 肥R2/neu阳性细胞或组织中特异性表达功能的多核巧酸；
[0011] 做核巧酸序列与（1)-似任一限定的序列互补的多核巧酸。
[001引在一个优选例中，（2)或（3)所述的多核巧酸中，对应于SEQ ID NO: 1的第156位 位置的核巧酸为C。
[0013] 在本发明的另一方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的核酸，作为启动子元 件。
[0014] 在一个优选例中，所述的载体还含有与所述的核酸可操作地连接的目的基因。
[0015] 在另一优选例中，所述的目的基因选自：能够被转录成多肤的RNA分子的目的基 因，被转录成反义RNA分子或被转录成针对内源基因的干扰RNA或miRNA的目的基因；较佳 地，所述的多肤是对于防止疾病有效的多肤，或是能指示体内存在肥R2/neu阳性肿瘤细胞 或组织的多肤；
[0016] 较佳地，所述的目的基因选自；抑癌基因；或可W沉默或者抑制癌基因的反义核 酸或干扰RNA、或者miRNA。
[0017] 在另一优选例中，所述的目的基因包括但不限于；Axin、PTEN等。
[0018] 在另一优选例中，所述相对于所述启动子元件，所述的目的基因是同源的或是异 源的。
[0019] 在另一优选例中，所述的目的基因位于所述核酸的下游，且与所述启动子的间隔 小于lOOObp ;优选的，小于50化P ;更优选的，小于10化P ;如小于50bp。
[0020] 在另一优选例中，所述的表达载体是病毒载体（如腺病毒载体）。
[0021] 在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述的细胞：
[002引含有所述的载体；或
[0023] 其基因组中整合有外源的所述的核酸。
[0024] 在本发明的另一方面，提供一种重组病毒，所述的重组病毒由所述的载体包装而 成。
[0025] 在本发明的另一方面，提供所述的核酸的用途，用于作为启动子元件，指导目的 基因在肥R2/neu阳性细胞或组织中特异性表达；更佳地，在低氧条件下，指导目的基因在 肥R2/neu阳性细胞或组织中特异性表达。
[0026] 在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，所述的药物组合物含有有效量的所