专利名称：在交叉流动式离心机中纯化dna的方法
描述本发明涉及一种利用连续流动式离心机纯化染色体外DNA的方法。
在分子生物学和现代医学中，核酸，特别是质粒DNA的分离具有重要意义。质粒DNA指的是染色体外DNA双链分子，它们的大小通常为1kb直至200kb以上，并以一至数百拷贝的数目存在于宿主细胞中。通常在细胞(如革兰氏阴性细菌)，特别是大肠杆菌内扩增质粒DNA。随后，裂解细胞，并从中分离质粒DNA。所分离的质粒DNA即可用于分子生物学或医学应用中，例如用于构建克隆载体，转化原核细胞和转染真核细胞。已知有许多方法可用于裂解细胞和分离质粒DNA(参见J.Sambrook等人，实验室手册，第2版，1989，冷泉港实验室出版社)。
在Birnboim & Doly建立起来的一种由细胞分离质粒DNA的方法(Birnboim & Doly，核酸研究，7(1979)，1513～1523)中，先用NaOH/去污剂溶液裂解生物质，再用醋酸钾将pH值调至大约pH5.0。在该过程中，形成了一种主要含基因组DNA和细胞壁片段的沉淀。为了分开这些杂质，将悬浮液转移至离心桶中，然后在桶式离心机中进行离心，以获得含有质粒DNA的上清。
离心机也普遍用于发酵工艺中，以便例如将发酵上清液与细胞和细胞碎片分开。为此，通常使用的是筛式离心机和固定壁式离心机(参见Gerhartz W.，工业用酶生产与应用，1990，VCH，Weinheim，Germany，第3.2.1章)。
对于普通实验室离心机而言，可以处理的体积受到转子及转桶大小的限制，而低于10升(如Sorvall离心机，GSA转子，6×250ml)。因此，这一方法只能用来分离少量质粒DNA。由于离心体积有限，在大规模加工中应用该方法就很有问题。
大体积可以借用于连续流动式离心机进行加工。WO92/12780中描述了连续流动式离心机的技术设计及其在分离大分子混合物中的用途。在该方法中，例如，依据四种标准蛋白质的相应分布系数，在一个水性双相体系中，以1000rpm的最大转速对它们进行了分离。由于洗脱时间的不同，得到了混合物中的诸成分，它们彼此完全分开。
然而，由于分子生物学方法愈来愈广泛的应用，越来越需要纯化的质粒DNA，以用于研究和医药中的分析和治疗目的。因此，本发明的一个目的是提供一种可以有效并快速地纯化大量质粒DNA的方法。
本发明的一个方面涉及一种纯化染色体外DNA的方法，其特征在于在能使得染色体外DNA与不溶性细胞成分分开的条件下，将含有染色体外DNA和其它细胞成分的液体通过一台连续流动式离心机，并分离已纯化的染色体外DNA。
在现有技术中，先前仅将连续流动式离心机用于分离细胞。现已令人惊奇地发现，连续流动式离心机也可以用于纯化大量染色体外DNA，且不会因随之而来的剪切力造成染色体DNA损伤。同样令人惊奇的是，在连续流动离心过程中，裂解细胞悬液中的染色体DNA不会断裂成碎片，因而可以与染色体外DNA定量地分离。
由本发明方法纯化的染色体外DNA可以是线性或环形，单链或双链。优选该DNA是环形的双链质粒DNA。含有染色体外DNA的细胞可以是原核细胞或真核细胞；优选的是原核细胞，特别是革兰氏阴性细胞，如大肠杆菌细胞。或者可以使用含有所谓人工染色体形式的染色体外DNA的细胞。人工染色体是线性的双链DNA分子，它们通常被称为YAC(yeast artificial chromosome，酵母人工染色体)，并在酵母细胞中进行扩增。
用于本发明方法的含有染色体外DNA之液体优选是细胞裂解物。细胞裂解物特别优选是通过碱裂解含有染色体外DNA的细胞及随后酸化而制成的。然而，也可以利用细胞裂解的其它普通方法，如结合应用酶(溶菌酶)和热处理法。
任何所需量的细胞生物质都可以作为本发明方法的起始材料。优选每批裂解100g-50kg的生物量。
通常通过梯度和/或泵，将含有染色体外DNA的液体送入连续流动式离心机。在本发明方法中，通常采用具有与裂解制备物相适合容量的连续流动式离心机。优选采用至少0.1-50升的体积，特别优选采用0.2-4升的体积。离心容器优选是圆筒形的。在合适的g值下，优选10000-40000×g下运行连续流动式离心机。市售连续流动式离心机的例子有Carr公司(美国)的CEPA快速离心机或高效离心机，目前其工作能力可达9000升/小时。
本发明方法通常是连续地进行的。将已裂解的生物质的悬浮液从下部送入连续流动式离心机。由于离心管的旋转(10,000-40,000×g)，粘附于其上的固体成分(如细胞壁成分和基因组DNA)沉积到离心管的壁上。含有已纯化染色体外DNA的溶液通常由连续流动式离心机的顶部流出，当然，也可以考虑使含有染色体外DNA的溶液从旁侧、底部或其它部位流出。
连续流动式离心机可以在不同温度下运行；优选该方法在4℃至室温的温度下进行。
在本发明方法中，可以纯化不同大小的染色体外DNA，优选纯化大小为1kb-200kb的染体外DNA。染色体外DNA优选是线性、环形或超螺旋质粒DNA。
从离心机中出来后，可以对染体外DNA进一步纯化。因此，可以选择性地进行RNase处理，以便从溶液中除去RNA。此外，也可以进行层析纯化步骤，例如阴离子交换层析、亲和层析或羟磷灰石层析。用于阴离子交换层析的合适材料的例子有有机或无机聚合物和共聚物，如聚甲基丙烯酸酯(Macroprep-Biorad，Germany)，聚苯乙烯-二乙烯基苯(Poros-Perseptive，Hyper D-Biosepra，Source Pharmacia)或硅胶，在其表面结合了带正电荷的基团，如二乙氨乙基(DEAE)或二甲氨乙基(DMAE)。特别优选用于阴离子交换层析的材料是Q-Sepharose。特别优选用于亲和层析的材料是羟磷灰石。
此外，所得DNA溶液可以进行交叉流过滤，以便进一步纯化、浓缩或/和更换缓冲液。在此交叉流过滤中，也可能达到从DNA制备物中基本除去内毒素的效果。为此，使DNA溶液切向透过一层或数层半透膜，它们的排阻大小被选择成可以使诸膜阻滞DNA分子，而具有更小分子量的物质可以透过膜，从而得到无内毒素的DNA溶液。
由本发明方法所得染色体外DNA基本上未受损伤，并且基本上无单链或双链裂口。特别是根据本发明纯化的质粒DNA在经凝胶电泳分离后仅显示一条显著条带，对应于“共价闭环”构象。此外，除了对应于开环和线性环状构象的条带外，再没有其它条带。
由本发明方法得到的DNA可以直接用于标准分子生物学和医学应用中，如用于克隆、转化、转染、微注射入细胞中、基因治疗方法中、DNA疫苗或/和聚合酶链反应(PCR)中。
本发明另一方面涉及连续流动式离心机在纯化染色体外DNA中的用途。
实施例在实验中，使用具有由不锈钢制成之净化瓶(1.4571，V4A)的CEPA实验室离心机LE(开口式设计)。通过碱裂解法(Birnboim & Doly的改进方法，Birnboim & Doly，核酸研究，7(1979)，1513～1523)，裂解大约2000g生物量。1.大肠杆菌生物质的裂解将发酵罐来源的2000g湿大肠杆菌生物质置于去热原化烧杯中。加入22.5升重悬液(50mmol/l Tris-HCl，10mmol/l EDTA-Na2，pH8±0.2)，在5±4℃下缓慢搅拌(约35rpm)至少24小时，直至生物质完全悬浮。再将悬浮液温度缓慢升至25℃。在以约80rpm搅拌的同时，向悬浮液中加入22.5l 0.2mol/l NaOH，1％SDS，并在25℃下温育5分钟。一边搅拌一边加入22.5l乙酸钾缓冲液(3mol/l乙酸钾缓冲液，pH5.5)，并尽快使生物质的温度降低到4℃。借助于连续流动式离心机，以连续流过模式，过滤澄清所得到的裂解物。2.连续流动式离心通过入口，将粘稠的悬浮液泵入连续流动式离心机。在此过程中，离心机在10,000-18,000×g下运行。一旦流出的液体变浑浊，就必须从瓶中除去沉淀，插入清洁过的瓶后继续离心。已除去细胞杂质的清亮质粒DNA溶液从连续流动式离心机的顶部流出，收集于容器中。3.额外的纯化步骤Q-Sepharose层析，羟磷灰石层析和交叉流过滤下一步进行Q-Sepharose和羟磷灰石层析。通过加入TE缓冲液(10mmol/l Tris-HCl，1mmol/l EDTA，pH8.5±0.2)，将倾出的离心上清液调节到传导率为49-50mS/cm，冷却至5±4℃。在该温度下进行整个层析。将离心上清液上样到已平衡过的柱中。再用约8 CV 10mmol/lTris-HCl，1mmol/l EDTA，0.65mol/l NaCl，pH8.5±0.2洗涤柱。
洗脱时，向柱施加一个梯度(5 CV缓冲液A(10mmol/l Tris-HCl，1mmol/l EDTA，0.65mmol/l NaCl，pH8.0±2)，5 CV缓冲液B(10mmol/lTris-HCl，1mmol/l EDTA，0.85mol/l NaCl，pH8.0±0.2)，洗脱液分部收集，在254nm进行检测。前峰是杂质，从上行侧开始收集主峰(质粒DNA)于一个独立容器中，从而将前峰与主峰分开。
随后于5±4℃在羟磷灰石(HA ceramic)上进行层析。
平衡缓冲液0.1mol/l磷酸钾，6mol/l尿素，pH7.0±0.2。
洗涤缓冲液10.15mol/l磷酸钾，6mol/l尿素，pH7.0±0.2。
洗涤缓冲液20.02mol/l磷酸钾缓冲液，pH7.0±0.2。
洗脱缓冲液0.5mol/l磷酸钾缓冲液，pH7.0±0.2。
利用紫外检测/记录仪，在254nm处进行检测。将1％产物溶液(质粒DNA)在校准过的光度计中进行测量，以此作为校准溶液。
将Q-Sepharose汇集物调节至氯化钙终浓度为1.1mmol/l，上样到平衡过的柱中。
然后用下述缓冲液连续洗涤柱1.0.1mol/l磷酸钾，6mol/l尿素，pH7.0±0.2，直至检测器中测不出吸收值为止。
2.2-4 CV，0.15mol/l磷酸钾，6mol/l尿素，pH7.0±0.23.5 CV，0.02mol/l磷酸钾，pH7.0±0.2。
洗涤步骤后，以5-6CV/小时的流速，用0.5mol/l磷酸钾缓冲液(pH7.0±0.1)进行洗脱。
收集洗脱峰，并经交叉流过滤浓缩至大约50ml。按以下条件进行CFF保留物流速100-200l/h·m2，跨膜压力约0.8巴，交叉流压力为大约1.2巴。随后，在TE缓冲液(10mmol/l Tris-HCl，1mmol/l EDTA，pH8.0)中对保留物进行流动渗滤，直至保留物和TE缓冲液的pH值及传导率变成一致。渗滤完成后，用渗滤缓冲液稀释保留物，将质粒DNA浓度调至1mg/ml。4.凝胶电泳通过琼脂糖凝胶电泳检查所得质粒DNA的完整性。
为此，将质粒DNA等分样品上样于各种浓度的琼脂糖凝胶上进行分析。举例说明的琼脂糖凝胶中，在泳道1和10显示了DNA长度标准标准II(各片段大小为125，564，2027，2322，4361，6557，9416，23130bp)，泳道2和9显示了DNA长度标准III(各片段大小为125，564，831，947，1375，1584，1904，2027，3530，4268，4973，5148，21226bp)。由常规氯化铯梯度方法纯化的pBR322(4162bp)作为参考质粒上样于泳道3。已知由该方法纯化的质粒DNA主要含有对应于共价闭环构象的质粒DNA(主要是超螺旋条带)。以不同的量，将由本发明方法纯化的质粒DNA(pCMV-CAT)上样于泳道4，5和6。
在本发明方法之后，通过Q-Sepharose和羟磷灰石层析及交叉流过滤进一步纯化该质粒DNA。
1％琼脂糖凝胶泳道1DNA长度标准II(Boehringer Mannheim GmbH，目录号236250)泳道2DNA长度标准III(Boehringer Mannheim GmbH，目录号528552)泳道3pBR322(Boehringer Mannheim GmbH，目录号481238)(0.4μg)泳道4经CFF后的pCMV-CAT，0.19μg(大批活性物质溶液)泳道5经CFF后的pCMV-CAT，0.45μg(大批活性物质溶液)泳道6经CFF后的pCMV-CAT，0.71μg(大批活性物质溶液)泳道7TE缓冲液泳道8pBR322(Boehringer Mannheim GmbH，目录号481238)(0.4μg)泳道9DNA长度标准III(Boehringer Mannheim GmbH，目录号528552)泳道10DNA长度标准II(Boehringer Mannheim GmbH，目录号236250)与参考质粒DNA(泳道3)类似，由本发明方法纯化的质粒DNA基本上显示一条主要条带。这表明按照本发明分离的质粒DNA未受损伤，仍维持了其原初构象。此外，琼脂糖凝胶上无额外条带，这表明，裂解细胞悬浮液中所含染色体DNA在连续流动离心期间未被断成片段，因而能作为沉淀大分子与质粒DNA完全分开。
权利要求
1.纯化染色体外DNA的方法，其中，在能使得染色体外DNA与不溶性细胞成分分离的条件下，将含有染色体外DNA和其它细胞成分的液体通过连续流动式离心机，并分离已纯化的染色体外DNA。
2.权利要求1的方法，其中含有染色体外DNA的液体是通过裂解含有染色体外DNA的细胞得到的。
3.权利要求2的方法，其中该裂解是碱性裂解。
4.前述权利要求中任一项所述的方法，其中该含有染色体外DNA的细胞是细菌细胞，优选是大肠杆菌细胞。
5.前述权利要求中任一项所述的方法，其中送入离心机中的液体是通过裂解100g-50kg的生物量而得到的。
6.前述权利要求中任一项所述的方法，其中该含有染色体外DNA的液体是通过梯度或/和泵送入连续流动式离心机中的。
7.前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用一种离心容器体积至少为0.1-50升的连续流动式离心机。
8.前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用一种离心容器体积为0.2-4升的连续流动式离心机。
9.前述权利要求中任一项所述的方法，其中以10,000-40,000×g的加速度运行连续流动式离心机。
10.前述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法连续地进行。
11.前述权利要求中任一项所述的方法，其中该染色体外DNA的大小为1kbp-200kbp。
12.前述权利要求中任一项所述的方法，其中该染色体外DNA是线性、环状或超螺旋质粒DNA。
13.前述权利要求中任一项所述的方法，其中可以对含有纯化过的染色体外DNA的溶液进一步纯化。
14.权利要求13的方法，其中进一步的纯化包括阴离子交换层析、亲和层析、羟磷灰石层析、RNase处理或/和交叉流过滤。
15.前述权利要求中任一项所述的方法，其中分离的染色体外DNA基本上无链断裂。
16.由前述权利要求中任一项的方法纯化的染色体外DNA用于克隆、转化、转染、微注射入细胞内、基因治疗方法、DNA疫苗接种或/和聚合酶链反应(PCR)中的用途。
17.连续流动式离心机用于纯化染色体外DNA的用途。
全文摘要
本发明涉及通过在给定条件下,使染色体外DNA和含有其它细胞组分的液体通过交叉流动式离心机,从而将染色体外DNA与其它细胞组分分开,得到纯化的染色体外DNA的一种染色体外DNA纯化方法。本发明还涉及已纯化的染色体外DNA用于克隆、转化、转染、微注射入细胞内、基因治疗方法、DNA疫苗接种和/或聚合酶链反应(PCR)中的用途。本发明最后涉及交叉流动式离心机用于纯化染色体外DNA的用途。
文档编号C12N15/09GK1243542SQ98801763
公开日2000年2月2日 申请日期1998年1月9日 优先权日1997年1月10日
发明者W·库尼, F·保普 申请人:罗切诊断学有限公司