选择转化的细胞的方法

专利名称：选择转化的细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种选择用所需基因转化后的细胞的方法。更具体地，其涉及一种通过将来自水稻组织的细胞在含巴龙霉素的选择性培养基上培养来选择转化的细胞的方法。
现在技术在常规方法中，为了得到在其中转入有特定基因的转化植物，还把一个选择性标记基因与目的基因一起转入以确定所需基因是否被转入到了细胞中。检测选择性标记基因的表达以对其中转入了上述基因的转化细胞进行选择。转化植物可由如此选择的细胞再生而来。关于这类标记基因，可以使用对选择性药物具有抗性的那些，即药物抗性基因。换句话说，在广泛使用的选择方法中，将抗药性基因和目的基因同时转入细胞中，并选择抗药性细胞作为转化细胞。这种抗药性基因的一个典型例子是新霉素磷酸转移酶(npt II)基因，其与相应的选择性药物卡那霉素一起使用。
在水稻转基因的早期研究中，就利用了上述的npt II基因和卡那霉素结合的方法(Uchimiya等，1986，Yang等，1988)。然而，在这些报道中，还没有得到再生的转化植物。Toriyama等(1988)报导还未得到通过卡那霉素的筛选的任何完整的绿色植物。而且，Dekeyser等(1989)指出水稻愈伤组织对卡那霉素有固有的抗性。因此，关于用npt II基因结合卡那霉素来选择转化的水稻细胞的方法中存在着各种问题。
另一方面，已尝试用G418作为一种选择性药物，其通过npt II表达来进行中和，与用卡那霉素相似。因此，有一些报道说已通过利用G418得到了水稻转化体(Toriyama等，1988，Peng等1992，Chan等1993)。Toriyama等(1988)报道说G418在转化效率方面比卡那霉素要占优。
目前，潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因是在水稻转化中应用最为广泛的选择性标记基因。该基因与作为相应的选择性药物潮霉素一起使用(Vasil1994)。还有报道说bar基因(选择性药物PPT及其衍生物)作为水稻的选择性标记基因是高度有效的(Ayres和Park1994)。
虽然在水稻转化中可用的选择性标记基因方面的比较很少有报道，但有人指出npt II标记的效率不如hpt标记(shimamoto等，1989，Aldemita和Hodges 1996)。事实上，如上所述，目前已不大使用npt II标记了。
因此，在水稻转化中一般是使用htp基因和bar基因来作为水稻转化中的选择性标记基因(抗药物基因)。与此相反，在水稻的转化中并不常用npt II基因，因为其转化效率低。
虽然可以用hpt或bar基因来转化水稻，但如果需要将一个或多个额外的基因转到转化体中去时就需要一个或更多个不同的选择性标记。也就是说，如果要把一个额外的基因转入到已通过hpt或bar基因共转化所得的转化体中，有必要使用另一个选择性标记(药物抗性)基因。
虽然，可以将npt II和G418结合使用来进行选择，但将导致转化效率低下。因此，非常需要具有改善的转化效率的新的选择性标记基因(药物抗性基因)与选择性药物的组合。
发明简述为了满足上述要求，本发明人已进行了大量的研究以建立一个利用药物抗性基因和选择性药物的新组合的高效水稻转化系统。结果，他们发现用巴龙霉素作选择性药物可以解决问题，因而完成了本发明。
因此，本发明人通过提供一种选择转化细胞的方法和通过此方法选择的转化细胞解决了上述问题，该方法包括将至少一个所需的结构基因和巴龙霉素抗性基因转到水稻组织中，在含巴龙霉素的选择性培养基中培养细胞，并选择转化的细胞。
在本发明的一个实施方案中提供了一种选择转化细胞的方法，包括的步骤为a)提供一株携带含有T-DNA区的质粒的土壤杆菌，该T-DNA区以能够使所说基因进行表达的方式依次含有巴龙霉素抗性基因和目的基因；b)提供水稻组织的细胞；c)将水稻细胞以上述的土壤杆菌株进行接种；d)在含巴龙霉素的植物细胞培养基中培养接种过的细胞，而巴龙霉素的浓度使得只有那些以巴龙霉素抗性基因转化过的细胞能存活(此后被称为选择性培养基)，以及如此选择巴龙霉素抗性愈伤组织；以及e)如果必要，利用选自愈伤组织的细胞重复选择步骤d)一到多次。如此所选择的细胞可在适于植物再生的培养基上培养因此将会再生成完全植株。
附图简述

图1表明了实施例2中所用的载体pSB133的限制性图谱。
图2显示的是电泳照片，该照片表明了利用LBA4404(pSB133)所得的转化体的Southern分析结果。从每个转化体提取的DNA用Hind III处理，并以npt II基因为探针进行Southern杂交。C非转化体(Asanohikari)。1-13转化体图3显示了一张电泳图，该图表明了利用LBA4404(pSB133)所得的转化体的Southern分析。从每个转化体所提取的DNA用Hind III处理，并用GUS基因为探针进行Southern杂交。C非转化体(Asanohikari)。1-13转化体。
发明详述现在将对本发明进行更详细的描述。
如上所述，本发明的主要特征在于选择转化细胞的方法和由此方法选择的转化细胞，而此方法包括将至少一个目的结构基因和巴龙霉素抗性基因转到水稻组织细胞中，并在含巴龙霉素的选择性培养基中培养细胞，以及选择转化细胞。
本发明中所使用的巴龙霉素是一种氨基糖苷类抗生素，其代表性分子式是C23H45N5O14(分子量615.5)，其由放线菌产生，典型的是龟裂链霉菌巴龙霉素原种(Sterptomyces rimosus forma paromomycinus)，其能够抑制格兰氏阳性和格兰氏阴性细菌。其结构中，新霉素的6′位氨基已被羟基取代。据报道巴龙霉素的功能和抑制机制类似于那些含2-脱氧链霉胺的抗生素例如卡那霉素。含有作为主要成分的巴龙霉素I和作为杂质的巴龙霉素II的制剂在市场上可以买到，即硫酸巴龙霉素。这类产品可以购自Sigma(St.Louis，USA)等。
根据本发明，应用的是含巴龙霉素的选择性培养基。优选选择性培养基中的巴龙霉素浓度范围在5毫克/升到400毫克/升之间，更优选20毫克/升到200毫克/升，再更优选从40毫克到100毫克/升。当培养基中巴龙霉素的浓度高于所确定的上限时，转化细胞的生长将会受到强烈抑制。当其浓度低于所确定的下限时，未转化细胞的生长将不会受到抑制。因此在两种情况下都不能够选择转化的细胞。
对本发明中所用的选择性培养基并无特定的限制，只要它是从常规使用的水稻细胞的选择性培养基中选出就可以了。优选的实施例包括改良的CC培养基和改良的MS培养基(Christou等，1991)。更优选的是2N6培养基和N6-7培养基，其成份将在下面给出的实施例中进行描述。
在这些培养基中的培养可在常规条件下进行。
用本发明的方法所选择的转化细胞可以是任何细胞，只要它们来源于水稻组织即可，虽然来源于水稻胚的细胞是优选的。
如此所选择的转化细胞可以携带至少一个目的基因，其特征为除了已被转入其中的巴龙霉素抗性基因之外的编码有益蛋白的结构基因或可赋予水稻优良特性的基因。
如上所述，对目的基因并无任何具体的限制，只要它可以赋予水稻优良特性即可。同样，该基因并不限于是天然的。也就是说，可以使用通过遗传工程改良的基因或编码由相互联系在一起的多个蛋白组成的嵌合蛋白的基因，等等。而且目的基因可以以有义方向转化也可以以反义方向转化。
对巴龙霉素抗性基因并无具体限制，只要它可以抵消巴龙霉素的效应即可。此处将一个编码新霉素磷酸转移酶(npt II)的基因用作是巴龙霉素抗性基因的适当实例。
应当对上述的两个基因进行转移，从而让其得到表达。因此，常常将这些基因与表达必需的启动子和终止子等一起使用。而且还可以将两个或更多个目的基因与额外的药物抗性基因等进行转移。
本发明中，通过常规使用的将基因转移到水稻组织细胞中的方法将这些基因转移到水稻中。例如可以使用电穿孔法、聚乙二醇法、粒子枪法或土壤杆菌介导法。其中，就转化效率而言优选土壤杆菌介导法。以土壤杆菌介导法向来自于水稻组织的细胞转入基因的方法的描述见于例如WO95/06722。
本发明中，对转化细胞的选择可只进行一次。然而，为了提高得到转化体的可能性，优选重复筛选几数。在下文给出的实施例中，将筛选重复了3次。实施例1(1)土壤杆菌株与质粒使用LBA4404(pTOK 233)(Hiei等，1994)来制备其中带有载体的土壤杆菌。载体的T-DNA区含有由一个CaMV(花椰菜花叶病毒)35S启动子驱动的hpt基因，一个由NOS(胭脂氨酸合酶)启动子驱动的npt II基因，以及由来自蓖麻豆的过氧化氢酶基因的内含子所间断的GUS基因。(2)待试品种和组织使用日本水稻品种Asanohikari作为待试品种。待试组织是来自该品种的未成熟胚的愈伤组织。根据Hiei等，(1994)的方法制备未成熟胚，并于2N6培养基(Hiei等，1994)上培养2周。在相同的培养基上对来自于盾片的愈伤组织再额外培养4到5天，并以其作为待试组织。(3)接种和协同培养如Hiei等的报道(1994)进行接种和协同培养。接种物密度为1×109/毫升。(4)转化细胞的选择在协同培养后3天，将愈伤组织移植到含有50毫克/升潮霉素、400毫克/升卡那霉素、50毫克/升G418或含有50毫克/升巴龙霉素的2N6培养基(Hiei等，1994)上，并在光照条件下于30℃培养约3周。将如此所得的抗药性愈伤组织转移到分别含50毫克/升各种药的N6-7培养基(Hiei等，1994)上，并进行十天的第二轮选择。每种选择培养基进一步含有250毫克/升的头孢噻肟(cefotaxime)。含有巴龙霉素和G418的选择培养基含有8克/升的琼脂糖作为胶凝剂。
上述2N-6培养基和N6-7培养基的配方如下。
2N6培养基N6无机盐、N6维生素、1克/升的酪蛋白水解物、30克/升的蔗糖、2毫克/升2,4-D(2,4-二氯苯氧基乙酸)、2克/升的Gelrite，pH5.8。
N6-7培养基N6无机盐、N6维生素、2克/升的酪蛋白水解物、30克/升的蔗糖、30克/升的山梨醇、1毫克/升的2，4-D、0.5毫克/升的6-苄基腺嘌呤、2克/升的Gelrite，pH5.8。(5)转化体的再生和GUS表达的检测将第二轮选择所得的抗药性的胚发生愈伤组织置于Abe和Futsuhara(1986)所描述的再生培养基上，前提是主要的无机盐浓度都减半。将Gelrite(4克/升)或琼脂糖(8克/升)加到培养基中作为胶凝剂。再生培养基也各含有一种选择性药物，其浓度为如上所述。在光照条件下于25℃培养4到5周，将如此所得的抗药性再生植株的叶片用X-Gluc处理以检测GUS的表达(Hiei等，1994)。再生的个体被移植到Hyponex的500倍稀释水溶液中，并在那里在光条件下于25℃培养10天，然后再移植到温室的盆中。(6)结果和讨论在卡那霉素测试组中，虽然有高的药物浓度(400毫克/升)，但未转化的愈伤组织的生长并未受到抑制。因此，未能选择到转化的愈伤组织(表1)。在G418组中，没发生再生，虽然也以低的频率观察到非胚发生药物抗性愈伤组织(表1)。
用巴龙霉素选择和经历再生的许多个体在叶中都观察到相当一致的表达，与用潮霉素进行选择时的现象是一样的。因此，证实这些个体就是转化体(表1)。在任何一个测试组中都未观察到白化个体。用巴龙霉素所得的转化效率明显高于用潮霉素进行选择的组，而潮霉素是水稻转化中所常规使用的(表1)。
这些事实表明巴龙霉素在水稻转化中是一种新的高度有用的选择性药物。换句话说，发现npt II基因虽然由于其效率低而不再使用，但如果在水稻转化中它与巴龙霉素一起使用就是一种极其有用的标记基因。
用巴龙霉素进行的转化体的选择在其它水稻品种即Tsukinohikari和Koshihikari中也有高的转化效率。
表1用潮霉素和巴龙霉素进行选择转化的结果
实施例2(1)载体将LBA4404(pSB 133)(图1)作为含质粒载体的土壤杆菌菌株来转化日本粳稻品种Asanohikari和Tsukinohikari。在T-DNA区，该载体具有一个在NOS启动子控制下的npt基因，以及一个由来自蓖麻豆的过氧化氢酶基因的内含子间断的GUS基因。用上述方法进行转化。再生培养基含有4克/升的Gelrite作为胶凝剂。
pSB 133以下列方式进行构建。将以SaII消化pGA482(An等，1985)所得的DNA片段(6.2kb)连接到以SalI消化pSB 11(Komari等，1996)所得的另一DNA片段(5.1kb)上得到一个质粒。接着，用EcoRI和BglII对质粒进行消化得到一DNA片段(8.6kb)。将该DNA片段平端化并在其中插入一个BglII接头(Takara生产)得到质粒pSB27。该质粒再用Hind III消化然后连到一个含35S启动子和一个内含子间断的GUS基因的片段(3.1kb)上，其是用Hind III消化pIG 221(Ohta等，1990)得到的。因此就得到了pSB33。再将pSB33导入大肠杆菌株LE392中，然后再通过三亲本杂交法(Ditta等，1980)转到含pSB1(Komari等，1996)的土壤杆菌菌株LBA中。通过在土壤杆菌中pSB1和pSB33之间的同源重组形成质粒pSB133。(2)转化在含巴龙霉素培养基上以LBA4404(pSB 133)转化产生高频率的药物抗性愈伤组织，类似于用LBAA4404(pTOK 233)的情况。该愈伤组织可在含巴龙霉素的培养基上毫无困难地再生。如此所得的许多再生个体在叶中都表现出了一致的GUS表达，这说明其为转化体(表2)。
表2以巴龙霉素选择用LBA4404(pSB 133)转化的结果
(3)基因转移的确证从13株用LBA4404(pSB 133)接种Asanohikari所衍生的巴龙霉素抗性和GUS阳性个体的叶中提取DNA。将所提取的DNA用Hind III处理，并用npt II基因或GUS基因为探针进行Southern杂交。作为对照，使用的是来自于未转化的Asanohikari的DNA。Southern杂交依据分子克隆(Sambrook等，1989)所述进行。
用npt II基因作探针对Hind III消化DNA的Southern分析表明在所有测试的13株个体中转入了一到多个拷贝的转移的基因(图2)。在质粒pSB133中，含npt II基因的Hind III片断恒定地表现出大小为5.9kb(图1)。因此，如果有土壤杆菌留在水稻植株中，那么就应该只检测到这样大小的带。事实上，从测试转化体中检测到了各种不同大小的带(图2)。而且，其中的大部分带(图2)都比从Hind III位点起延伸、通过npt II并到达左边界(约2.5kb，图1)的区段要长。这些结果表明，在所测试的个体中，T-DNA整合入不同的染色体区域，暗示这些个体是独立的转化体。
以GUS基因为探针对Hind III消化的DNA的Southern分析显示在13株转化体中有11株中出现了一条3.1kb的带(图3)。在质粒pSB133中，含GUS基因的Hind III片段表现出恒常大小为3.1kb(图1)。因此，Southern分析的结果与预期的带长是一致的。从一些个体中得到了各种不同长度的带，这看起来是由于转移的基因的重排引起的。这种现象在用土壤杆菌介导法所得的双子叶植物转化体中也常观察到(Peroles和Gardner，1988，Komari，1989；Komari，l990)。
当对这些转化体下一代的自体授粉的个体中检测了巴龙霉素抗性和GUS基因的表达时，确证了基于孟德尔法则的遗传分离。
以前，在用npt II作为选择性标记基因转化水稻时，所用的选择性药物是卡那霉素和G418。然而，以这些药物仅得到低转化效率。根据本发明，利用巴龙霉素作为新的选择性药物可能以显著高的效率对水稻组织的细胞进行转化。
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权利要求
1. 选择转化细胞的方法，其包括在将至少一个目的结构基因和巴龙霉素抗性基因转到来自于水稻组织的细胞中后将该细胞在含巴龙霉素的选择性培养基上进行培养，以及选择转化细胞。
2. 权利要求1所要求的选择转化细胞的方法，其中所说的巴龙霉素抗性基因是编码新霉素磷酸转移酶(nptII)的基因。
3. 权利要求1或2所要求的选择转化细胞的方法，其中所说的转化通过土壤杆菌介导法来进行。
4. 权利要求1到3中任一项所要求的选择转化细胞的方法，其中所说的转化细胞源自水稻胚。
5. 权利要求1到4中任一项所要求的选择转化细胞的方法，其中在所说选择性培养基中巴龙霉素的浓度从5毫克/升到400毫克/升。
6. 权利要求1到5中任一项所要求的选择转化细胞的方法，其中所说的选择性培养基是2N6培养基或N6-7培养基。
7. 从源自水稻组织的细胞中选出的转化细胞，其选择方法是将细胞在其中至少转入一个所需的结构基因和一个巴龙霉素抗性基因后将该细胞在含巴龙霉素的选择性培养基上进行培养。
8. 产生由所需基因转化的水稻转化体的方法，包括a)提供一株属于土壤杆菌属的菌株，其含有一个在其T-DNA区以能使得各个所说基因得以表达的方式含一个巴龙霉素抗性基因和一个所需基因的质粒；b)提供来自于水稻组织的细胞；c)用上述属于土壤杆菌属的菌株对源自水稻的上述细胞进行接种；d)将接种过的细胞在含巴龙霉素的植物培养基上进行培养，而该巴龙霉素的浓度使得除去那些由巴龙霉素抗性基因转化的之外的细胞不能在所说培养基(此后称之选择性培养基)中存活，以及选择巴龙霉素抗性愈伤组织；e)如果必要，用从选出的愈伤组织得到的组织细胞重复一次或多次选择步骤d)。f)将选出的愈伤组织在适于植物再生的培养基上培养以得到完全再生的植株。
9. 权利要求8所要求的方法，其中所说的步骤b)的细胞来源于水稻胚。
10. 权利要求8或9所要求的方法，其中所说的巴龙霉素抗性基因是编码新霉素磷酸转移酶(npt II)的基因。
11. 权利要求10所要求的方法，其中所说选择性培养基中巴龙霉素浓度在5毫克/升到400毫克/升之间。
12. 权利要求11所要求的方法，其中所说的选择性培养基是2N6培养基或N6-7培养基。
13. 权利要求8所要求的方法，其中所说的步骤c)中接种是将来自于水稻的所述细胞在有所说属于土壤杆菌属的菌株存在的条件下培养几分钟到几天而进行的。
14. 权利要求8所要求的方法，其中一个或多个拷贝的所说的所需基因被整合到如此再生的植物的基因组中。
全文摘要
用nptⅡ作为选择性标记基因(药物抗性基因)，以及用卡那霉素、G418等作为选择性药物已是选择水稻转化体的惯常方法。然而，通过该方法所得的选择效率很低，因此需要开发一种利用新组合的高效的水稻转化系统。通过使用巴龙霉素作为新的选择性药物，可以极其高效地转化水稻。
文档编号C12N15/82GK1239513SQ9880137
公开日1999年12月22日 申请日期1998年7月23日 优先权日1997年7月23日
发明者小鞠敏彦, 樋江井佑弘, 笠冈启介 申请人:日本烟草产业株式会社