专利名称：利用药物松胞素b检测淋巴细胞转化的方法
利用药物松胞素B检测淋巴细胞转化的方法技术领域
本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种检测淋巴细胞转化的方法。
技术背景
淋巴细胞转化试验是检测细胞免疫功能的体外试验方法之一，是各医学专业学生，特别是检验专业学生必做的实验项目，临床上主要用于肿瘤、迟发性变态反应、细胞免疫缺陷、器官移植及某些可能有细胞免疫参与的疾病诊断。
已知淋巴细胞的活化或致敏作用是指当抗原与致敏淋巴细胞反应时通常发生在体内的某一过程的体外关联作用。淋巴细胞转化是由Nowell于1960年首次使用的术语， Hirschorn后来用其来描述小型静止淋巴细胞经暴露于促细胞分裂剂植物凝集素(PHA)下转化为淋巴母细胞的形态过程。淋巴细胞活化作用是一种通常用来评估人体的细胞免疫性的体外技术，实验结果可以反映机体的免疫力情况，所以检测对象主要是免疫缺陷性的，患有传染性和自身免疫性疾病或肿瘤。在与促细胞分裂剂一起孵育后，会发生许多复杂的生化反应，这些反应包括与膜相关联的早期现象，例如磷脂合成的增加、二价阳离子通透性增加、腺嘌呤环化酶的活化作用和胞内cAMP的同时增加；紧随之后的是蛋白质、RNA及DNA合成的增加，最终导致淋巴细胞形态学发生特征性改变和增值分裂。这些先于细胞分裂的生化反应，是淋巴细胞活化作用的多数试验的基本原理。便利性和习惯性使得临床免疫学家使用DNA合成而没用使用诸如cAMP或磷脂代谢的增加等作为淋巴细胞活化作用的标志物。
淋巴细胞转化作用最早是通过对培养物中存在的淋巴母细胞百分比来评估的。转化淋巴细胞即淋巴母细胞的形态特征是(1)转化淋巴母细胞体积增大，约大于原淋巴细胞3倍；(2)细胞核的核膜清晰，核内染色质疏松呈网状结构，可见1 3个核仁，有的核呈分裂相；C3)胞浆丰富，呈嗜碱性染色，核周围的胞浆有一染色较浅的透明区，为伪足状突起，胞浆内有小空泡出现。该方法的主要优点是从形态学判断转化淋巴细胞，但因其极端变异性和结果的主观性而得不到广泛利用。
目前DNA合成最准确的检测方法是使用氚标记的胸苷(3H_dT)，在DNA合成过程中3H-dT其掺入量可由液相闪烁仪来检测，通过该掺入量来计算DNA合成能力并间接反映机体的细胞免疫功能。由于使用了放射性物质，此方法对实验室要求很高，并且可能会对环境和工作场所造成放射性污染。同时，此方法是通过放射性计数来反映细胞免疫功能的，实验组和对照组的细胞数必须保证绝对相同，否则实验结果就不具有可信性。这两方面的缺点限制了此法的广泛应用。
由于上述常规方法本身的缺陷，实际应用中会碰到一系列的问题；另外，由于其复杂性和精确性，这些常规方法绝对不适用于临床，只能限于实验室研究。发明内容
本发明的目的在于提供一种简便、经济、用途广，且适合于临床使用的检测淋巴细胞转化的方法。
依据原理静止淋巴细胞暴露于促细胞分裂剂植物凝集素(PHA)可以转化为淋巴母细胞并可进一步分裂增殖，淋巴细胞的这种活化作用可用来评估人体细胞免疫性，且淋巴细胞的增殖活跃程度与机体的细胞免疫能力正相关；而松胞素B可以阻滞细胞的分裂而不阻滞细胞核的分裂。具有不同免疫能力的淋巴细胞经过PHA和松胞素B的双重作用后的双核细胞率会不同，免疫力越强的淋巴细胞的双核细胞率越高。因此，可通过淋巴细胞的双核率直观地反映机体的细胞免疫功能。
本发明提供的检测淋巴细胞转化的方法，具体步骤如下1、取若干份健康人外周血，每份血分成照射组(免疫抑制组)和非照射组；2、血样用含PHA营养液培养无菌操作将0.2-0. 6ml血样加入含有PHA营养液小瓶内， PHA终浓度为30-70 μ g/ml，混勻后，置37°C温箱培养1_2天；3、加入松胞素B继续培养在含PHA营养液中培养结束后，向培养液内加入松胞素B， 终浓度为2-6 μ g/ml，37°C温箱继续培养；4、溶解红细胞培养结束后，吸弃上清液，加入37°C预温的0.87% NH4Cl溶液3_5ml，置 37°C温箱孵育 10-15min ；5、低渗处理离心弃上清后每管细胞加入5-10ml0.075M KCl混勻，室温低渗 10-20min ；6、固定液固定采用两步固定法，低渗后加入固定液固定液(固定液低渗液=15-8), 滴管混勻后立即离心，弃上清每管加入5-8ml固定液固定20-30min ；所述固定液为甲醇和冰醋酸的混和液，两者质量比为甲醇冰醋酸=7-9 1 ；7、检测照射与非照射淋巴细胞的双核率的差异，双核率=双核细胞数/N，N为观察淋巴细胞个数，N 一般取500—1000。
依据本发明采用松胞素B进行致敏性淋巴细胞转化试验的新方法，可以克服传统方法遇到的问题。该方法的主要优点有1、转化的淋巴细胞可形成双核细胞，这与单核细胞相比，更加直观且客观(见附图)；2、检测指标为形态学观察，所以属于金标准(见附图)；3、实验成本很低；4、操作简单，设备要求低，所有实验室都可以开展；5、不使用放射性物质，不会对环境和工作场所造成污染；6、全血培养物，结果不受细胞数影响；7、结果准确，重复性好。
本发明是一种淋巴细胞转化试验的新方法，是检测细胞免疫功能的体外试验方法之一，可应用于肿瘤、迟发性变态反应、细胞免疫缺陷、器官移植、以及某些细胞免疫性疾病的诊断；另外，该技术也可用于药物或毒物的免疫毒理学研究，如检测药物或毒物对淋巴细胞的影响、估算药物或毒物剂量的大小等。
图1为不同处理情况下淋巴细胞的形态学特点(*400倍)。其中(1)显示血样在没有植物凝集素(PHA)和松胞素B (CB)处理的情况下，血液淋巴细胞的形态学特点；(2)显示血样在有PHA而没有CB处理的情况下，血液淋巴细胞的形态学特点，体积增大、胞浆丰富的细胞为转化的淋巴细胞；(3)显示血样在PHA和CB共同处理的情况下，血液淋巴细胞的形态学特点，形成明显双核的细胞为转化的淋巴细胞；(4)显示以2Gy γ射线照射(免疫抑制)血样后，在PHA和CB共同处理的情况下，血液淋巴细胞的形态学特点，形成明显双核的细胞为转化的淋巴细胞。
具体实施方式
(一)材料。
1植物血凝素(sigma公司)，松胞素B (Sigma公司)。
2培养液为RPMI1640 (PAA)，含10%小牛血清(四季青)，1%双抗(基诺)。
3肝素抗凝管。
4 生理盐水、087% NH4Cl 溶液、Giemsa 染液。
(二)操作方法。
1.无菌采血，每份0. 5ml，分成2Gy照射组(免疫抑制组)和非照射组，将其分别注入4. 5ml含有PHA的RPMI1640培养液内，PHA终浓度为50 μ g/ml，混勻后，置37°C温箱培养2天。
2.第3天向培养液内加入松胞素B，终浓度为3 μ g/ml，细胞继续培养Mh。
3.溶解红细胞第4天吸弃上清液，加入37°C预温的0.87% NH4Cl溶液:3ml，置 37 °C温箱孵育15min，然后加生理盐水7ml。
4. 300g离心lOmin，弃去上清液，每管细胞加入7ml 0. 075M KCl混勻，室温低渗 15min。
5.加入Iml固定液(质量比为甲醇冰醋酸9:1)预固定细胞。
6. 300g离心lOmin，除去低渗液，每管加入5ml固定液固定30min。
7. 300g离心lOmin，保留约0. 5ml固定液，滴片，干燥。
8.用Giemsa染液染色30min，40倍显微镜观察500个淋巴细胞，双核率=双核细胞数/500。
结果取10份健康人外周血，每份血分成2Gy照射组(免疫抑制组)和非照射组，检测照射与非照射淋巴细胞的双核率的差异。结果显示，转化后的淋巴细胞形成了明显的双核细胞，非照射组的双核率为51. 7%士4. 3%，照射组的双核率为29. 4%士5. 6%，照射后淋巴细胞的双核率下降了 22. 3%(P<0. 001)，表明照射后T淋巴细胞的免疫功能明显受到抑制， 表明淋巴细胞的双核率可以很好的反映机体的细胞免疫功能。见图1所示。
该新方法检测指标直观、操作简单、快速、经济、结果准确。
权利要求
1. 一种利用药物松胞素B检测淋巴细胞转化的方法，其特征在于具体步骤为(1)取若干份健康人外周血，每份血分成照射组(免疫抑制组)和非照射组；(2)血样用含PHA营养液培养无菌操作将0.2-0. 6ml血样加入含有PHA营养液小瓶内，PHA终浓度为30-70 μ g/ml，混勻后，置37°C温箱培养1_2天；(3)加入松胞素B继续培养在含PHA营养液中培养结束后，向培养液内加入松胞素B， 终浓度为2-6 μ g/ml，37°C温箱继续培养；(4)溶解红细胞培养结束后，吸弃上清液，加入37°C预温的0.87% NH4Cl溶液3_5ml， 置37°C温箱孵育10-15min ；(5)低渗处理离心弃上清后每管细胞加入5-10ml0.075M KCl混勻，室温低渗 10-20min ；(6)固定液固定采用两步固定法，低渗后加入固定液(固定液低渗液=1:5-8)，滴管混勻后立即离心；弃上清每管加入5-8ml固定液固定20-30min ；所述固定液为甲醇和冰醋酸的混和液，按质量比，甲醇冰醋酸=7-9 1 ；(7)检测照射与非照射淋巴细胞的双核率的差异，双核率=双核细胞数/N，N为观察淋巴细胞个数，N取500—1000。
全文摘要
本发明属于医学检测技术领域，具体为一种利用药物松胞素B检测淋巴细胞转化的方法。本发明根据外周血淋巴细胞在体外经过植物血凝素的刺激后可以转化为可以分裂的淋巴母细胞，以及药物松胞素B可以阻滞细胞的分裂而不阻滞细胞核的分裂这两个原理，以2Gyg射线照射人外周血进行免疫抑制，并以PHA刺激后再加入松胞素B处理，检测照射与非照射淋巴细胞的双核率的差异。结果表明，转化后的淋巴细胞会形成双核细胞，而受照射淋巴细胞的双核率显著下降，表明照射后T淋巴细胞的免疫功能明显受到抑制，双核率可以很好地反映淋巴细胞的免疫功能。该方法检测指标直观、操作简单、快速、经济、结果准确。
文档编号C12Q1/06GK102505039SQ20111033355
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月28日 优先权日2011年10月28日
发明者叶爽, 张江虹, 潘燕, 白杨, 袁德晓, 邵春林 申请人:复旦大学