专利名称：几丁质珠、聚氨基葡糖珠、这些珠的制造方法和这些珠制得的载体以及微孢子虫孢子的制 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及从主要细胞壁物质为几丁质的微孢子虫孢子制得的均匀微细粒径的几丁质珠、该几丁质N-脱乙酰化所得的均匀微细粒径的聚氨基葡糖珠、这些珠的制造方法和这些珠制得的载体以及微孢子虫孢子的制造方法。
背景技术：
聚氨基葡糖因为具有良好的物理化学吸附性、生物体适应性和微生物分解性，作为医药·医疗用、香料用、化妆品用、粘合材料·涂料用和复印·记录表示用的材料等，是能够在广泛产业范围内应用的生物高分子。一方面，粒径波动小的多孔性珠(beads)作为酶等的固定化用载体，广泛地应用于化学、医疗、食品和工业过程等各种产业领域。所以，如果能够提供聚氨基葡糖的具有均匀粒径的多孔性珠，可望能在多方面进行应用。
以前，聚氨基葡糖珠例如按以下的复杂方法制造。首先，从形成甲壳类外骨骼的成分中除去无机物，得到聚氨基葡糖，将其充分溶于有机酸作成均匀的原液。将此原液滴入碱性凝固液中或在其中放出，使之凝固，制造得到聚氨基葡糖珠(Knorr,D.,M.Daly聚氨基葡糖/藻酸多层凝聚层胶囊观察到力学与扩散变化Mechanics and diffusional changes observedin multi-layer chitosan/alginate coacervate capsules，工艺生物化学Process Biochemistry,4,48-50(1988))。
发明的公开在上述以前的方法中，聚氨基葡糖珠的粒径和多孔状态会因脱溶剂的速度和凝固液向生成的珠中的渗透、扩散速度等的不同而发生大幅度变化。正因为如此，就不容易使珠的粒径一致，要制造粒径均匀的聚氨基葡糖珠，就必需有复杂的制备操作并有熟练的技术，从而使大量生产很困难。所以，人们希望开发出根据在收率、效率、经济等方面优秀且处理容易的制造工艺进行的制造均匀微细粒径聚氨基葡糖珠的方法。
在本发明中，利用了主要细胞壁物质为几丁质构成的均匀微细粒径的微孢子虫类的孢子在昆虫体内或培养细胞内能够效率良好地生产得到这个特性，解决了上述问题。也就是说，本发明的目的在于，利用粒状微孢子虫孢子细胞壁物质的主要成分为几丁质这一点，提供高效且经济地制造均匀微细粒径的几丁质珠、聚氨基葡糖珠和微孢子虫孢子的方法，同时提供如此所得的均匀微细粒径的珠和这些均匀粒径的珠制成的载体。
本发明者们就昆虫来源的生物高分子的新应用技术的开发进行了深入的研究。结果首先发现，微孢子虫孢子能在昆虫体内或培养细胞内高效地生产，而且微孢子虫孢子呈均匀粒径的球状、椭球状，因微孢子虫孢子的主要细胞壁物质为几丁质，如果在粒径均匀的几丁质珠或聚氨基葡糖珠上固定抗生素及生理活性物质，就可用作缓释载体，从而完成了本发明。
如果在家蚕、野蚕或其它多种昆虫或者培养细胞中接种微孢子虫孢子，则主要细胞壁物质为几丁质、数微米大小的微孢子虫孢子大量增殖。本发明者们发现了精制、分离增殖的微孢子虫孢子、得到一定粒径的几丁质珠、聚氨基葡糖珠和微孢子虫孢子的方法，以及将这些珠制成抗生素和生理活性物质等的固定化用载体的简易方法。
本发明者们首先揭示了往昆虫或培养细胞中接种微孢子虫孢子的时间、接种量、接种方法和在昆虫体内等增殖后的微孢子虫孢子的精制、分离方法，以及高效生产微孢子虫孢子所需的最适条件。
对于微孢子虫孢子往昆虫或培养细胞中的接种，现有例如有①往昆虫饲料中加入目的的微孢子虫孢子的经口接种方法、②对饲养过程中的昆虫经皮直接接种微孢子虫孢子的方法等。
微孢子虫孢子的形状很多样，但各个种类会有一定的形状，其主要的细胞壁物质为几丁质和蛋白质的复合物。所以孢子可以①作为增殖后的微孢子虫孢子的几丁质珠，还有②作为微孢子虫孢子的几丁质N-脱乙酰化的聚氨基葡糖珠来使用。此外，将微孢子虫孢子表面的几丁质进行N-脱乙酰化处理，可以制造出微粒子表面为聚氨基葡糖的聚氨基葡糖珠。还有，活化细胞内物质，使其从孢子的细胞壁中出来，也可以制造出微孢子虫孢子细胞壁上有小孔的中空珠。
如上所述，本发明的几丁质珠是由在昆虫或培养细胞内增殖的微孢子虫孢子制成的、以几丁质为主要细胞壁物质的均匀微细粒径的珠；此外，聚氨基葡糖珠为该细胞壁物质几丁质N-脱乙酰化的产物。此几丁质珠和聚氨基葡糖珠也可以是除去蛋白质的非抗原性物质。蛋白质的除去可按通常的水解处理进行。此外，根据需要，上述增殖的微孢子虫孢子也可以是细胞壁上有孔的，上述几丁质珠和聚氨基葡糖珠可以是中空的。这些孔可以通过过氧化氢处理或碱处理得到。
本发明的载体从如上述的增殖的微孢子虫孢子制得，它是以几丁质为主要细胞壁物质得到的均匀微细粒径的几丁质珠或该细胞壁物质几丁质N-脱乙酰化的聚氨基葡糖珠制成的。此几丁质珠和聚氨基葡糖珠也可以是除去蛋白质的非抗原性物质。蛋白质的除去可按通常的水解处理进行。如上所述，根据需要，这些增殖的微孢子虫孢子可以是细胞壁上有孔的，这些几丁质珠和聚氨基葡糖珠也可以是中空的。这些孔可以通过过氧化氢处理或碱处理得到。
本发明的载体是用于固定或引入生理活性物质、抗生素、生物体细胞、细菌等微生物、无色和有色的染料、药物、农药、香料、饲料原料及食品原料等的物质。
还有，本发明的几丁质珠和聚氨基葡糖珠包埋入人等的体内时，希望具有非抗原性。
本发明的均匀微细粒子(几丁质珠和聚氨基葡糖珠)的制造方法如下所述，以5×102～5×108个/毫升、优选5×102～5×107个/毫升的浓度经口或经皮往昆虫体内接种微孢子虫孢子，增殖以后，取出在生育昆虫体内增殖的孢子，精制得到均匀微细粒子(几丁质珠)，接着按照要求将几丁质珠的几丁质N-脱乙酰化，得到均匀微细粒子的聚氨基葡糖珠。孢子浓度不足5×102个/毫升时，对昆虫的感染效率低，或因感染率产生变动而无效；此外，不足浓度超过5×108时，在昆虫体内完全形成孢子前昆虫就要死亡对经济方面不利。微孢子虫的接种时间优选该昆虫为2龄起蚕的时候，孢子的采集优选从昆虫的5龄期开始。该昆虫优选家蚕的幼虫。
本发明的微孢子虫孢子的制造方法优选如下述过程进行，往以细胞培养培养基重量为基准，含家蚕幼虫体液的上清5～50％重量、优选10～40％重量的细胞培养基中加入昆虫来源的培养细胞，再往其中接种微孢子虫孢子使之增殖后，从增殖的细胞中取出微孢子虫孢子。在家蚕幼虫体液的上清的添加量不足5％重量和超过50％重量的情况时，孢子都不能增殖。此外，在优选范围内孢子能更高效地增殖。
图的简单说明
图1表示下述实施例2所得的干燥粉末(几丁质珠)和标准样品的几丁质相比较的红外吸收光谱。
实施发明的最佳形式作为本发明中所用的微孢子虫，没有特殊的限定，只要是具有形状能保持一定的珠形状而且主要的细胞壁物质为几丁质的孢子的微孢子虫就可以。例如可以使用家蚕微粒子虫(Nosema bombycis)、家蚕微粒子虫(No.402)、家蚕微粒子虫(No.408)、家蚕微粒子虫(No.520)、家蚕微粒子虫(No.611)、微粒子虫属(M 11)和微粒子虫属(M 14)等的微粒子虫属微孢子虫，多形孢虫属(Vairimorpha)(M12)，拟微孢子虫属(Plestophola)(M25)，拟微孢子虫属(M27)和消泡微孢子虫属(Thelophania)等。
在本发明中，可以利用家蚕、大菜粉蝶Pieris brassicae、美国白蛾Hyphantria cunea、绢粉蝶Aporia crataegi、人纹污灯蛾Spilosomasubcarnea Walker、蓖麻蚕Philosamia cynthia arrinda和樗蚕Philosamiacynthia等广大范围的昆虫作为微孢子虫孢子的宿主。在昆虫当中，特别符合要求的是已确立了饲养方法、饲养技术的，在遗传、育种、生理、生态等方面已进行了全方位研究的家蚕。采用家蚕的幼虫可以生产出大量的微孢子虫孢子。以家蚕为对象制造微孢子虫孢子时，以每只家蚕5×102～5×107个/毫升微孢子虫孢子的接种量对2龄起的蚕进行经口或经皮接种，在5龄期时可望精制、分离大量增殖的微孢子虫孢子。如果将微孢子虫孢子经口接种入1龄起的蚕，则在微孢子虫孢子形成前蚕就病死了。将家蚕微粒子虫的原虫给予家蚕时，优选每只2龄起的蚕大约接种5×102～3×103个孢子，在幼虫开始死亡的接种的第12天采集幼虫体内的孢子能最高效地得到微孢子虫孢子。
在本发明中，如上所述，能在昆虫体内或培养细胞内得到大量的目的物微孢子虫孢子，所以除了可以使用家蚕等昆虫外，还可以使用哺乳动物和广大脊椎动物、无脊椎动物来源的培养细胞。接种后的昆虫可以在15～32℃下按通常方法进行饲养，优选的饲养温度为25～28℃。另一方面，接种后的培养细胞可以在20～30℃下，优选25～28℃下进行培养。
作为本发明所用的培养细胞，可如下述例子所示。
作为家蚕来源的培养细胞，例如有家蚕(Bombyx mori)S.P.C.Bm36、家蚕Bm N-4、家蚕SES-BoMo-15A等；作为柞蚕来源的培养细胞，例如有中国柞蚕(Antheraea pernyi)NIS ES-AnPe-428；作为长角天蚕来源的培养细胞，例如有蓖麻蚕(Philosamia cynthiapernyi)NIS ES-SaCy-12。此外，作为桑斑污灯蛾来源的，例如有桑斑污灯蛾(Spilosoma imparilis)FRI-SpIm-1229；作为甘蓝夜蛾来源的培养细胞，例如有甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)SES-MaBr-4。
在上述培养细胞中，对中国柞蚕(Antheraea pernyi)NIS ES～AnPe-428来说，如果使用含家蚕幼虫体液的上清5～50％的Grace培养液时，在培养温度为20～30℃、优选25～28℃下，微孢子虫孢子能够在培养细胞内高效地增殖。对于中国柞蚕(Antheraea pernyi)NIS ES-AnPe-428以外的培养细胞，可以使用通常一般所用的培养液进行培养(横田等，九州蚕丝，34(1995))。
用培养细胞进行培养时，往培养基中加入一定浓度的家蚕体液上清可使微孢子虫孢子在培养细胞内容易增殖，形成大量的孢子。为了经济、高效地生产微孢子虫孢子，家蚕体液上清的添加量优选培养液的10～40％重量。培养条件可以和未添加上清时一样。对于体液的调制，用剪刀把5龄家蚕幼虫的足剪断，用冰冷却的玻璃制试管收集体液的方法既简便又有效。将这样收集的体液在水浴60℃下加热15分钟，沉淀体液中所含的蛋白质，以倾滗的方法除去它，就可以使用这样所得的体液上清。
使用昆虫来源的培养细胞时，不受昆虫的饲养、采集等、昆虫的得到的制约，能够以箱式培养简单而高效地生产微孢子虫孢子。
对野蚕来源的培养细胞桉大蚕蛾Antheraea eucalypti细胞给予微孢子虫孢子时，可以往家蚕幼虫体液的上清最大加到40％的市售细胞培养液(例如Grace培养液，Gibco公司制造)中的细胞直接接种微孢子虫孢子从而在培养细胞中高效地生产微孢子虫孢子。
因为往昆虫或昆虫来源的培养细胞中接种微孢子虫孢子而生产的孢子对家蚕具有强大的传染性，从防止对家蚕的污染的角度出发，所取出的孢子应该进行福尔马林、醇处理或热处理等，使之无毒化。无毒化后的微孢子虫孢子如果就这样使用可以作为不溶于水的几丁质微粒(几丁质珠)应用。
制造本发明的均匀微细粒径的几丁质珠时的增殖微孢子虫孢子的精制按以下步骤进行。即，例如将体内增殖了微孢子虫孢子的昆虫幼虫在0.85％氯化钠水溶液中磨碎后，用脱脂棉滤过，收集孢子，用离心分离器进行2次离心操作。接着，移至Percoll层(商品名，瑞典法玛西亚公司制造)上，以3000rpm进行30分钟的离心分离，可以精制微孢子虫孢子。
将几丁质转换成聚氨基葡糖的N-脱乙酰化处理可按通常的方法进行，例如将微孢子虫孢子的几丁质珠在30～50％氢氧化钠溶液中、80～120℃下处理数小时，使细胞壁物质几丁质N-脱乙酰化，变成聚氨基葡糖珠。还有，作为N-脱乙酰化所用的药品、pH等操作条件已知的方法可以适用(Brine等，比较生物化学与生理学Comp.Biochem.Physiol.69B、283(1983))。
本发明的几丁质珠、聚氨基葡糖珠的细胞壁物质是由无抗原性的几丁质、聚氨基葡糖及葡聚糖和抗原性的蛋白质构成的。蛋白质可以经酸和/或碱水解处理溶出除去，此时珠的形态没有变化。这种水解，使用0.1～3N、优选0.5～2N、更优选0.9～1.3N的氢氧化钠、盐酸，在温度5～35℃下进行1～25小时，优选在20～25℃下进行8～15小时，更优选在室温下进行10～12小时，由此得到无抗原性的珠。水解处理可以开始时在酸性水溶液中、而随后的过程在碱性水溶液中进行，也可以开始时在碱性水溶液中、而随后的过程在酸性水溶液中进行。酸处理和碱处理合起来为1个循环，重复此操作，应该合计处理5个循环以上。最后用水洗净后，为了进行杀菌、脱水，用95％以上的乙醇按预定时间进行清洗处理。这样，就可以完全除去为微孢子虫孢子细胞壁物质的蛋白质。
在微孢子虫孢子中把抗生素、细菌、生理活性物质、药物和生物体细胞，或固定，或引入其内部时，在微孢子虫孢子的细胞壁上打开微细的小孔是较为有效的。作为在微孢子虫孢子上开微细小孔的方法，没有特殊的限定，例如优选下述两种方法。
①1～6％重量H2O2和孢子悬浮液等量混合的方法。
②将微孢子虫孢子用25℃的0.2N KOH进行30分钟的浸渍处理后，分批少量加入pH7.2的磷酸缓冲液，调节浸渍溶液pH至中性的方法。
将微孢子虫孢子用碱性水溶液处理后，孢子内的细胞物质被活性化，根据孢子大小的不同，细胞物质在细胞壁上打开例如约0.1～0.3μm的微细小孔，释放出孢子外，所以可以利用此时生成的微孢子虫孢子壁的微细小孔。具体地说，先用0.2N的氢氧化钾水溶液在15～20℃下处理微孢子虫孢子30分钟，在这之后，进一步用pH7.2的磷酸缓冲液进行中和处理，活性化孢子内的细胞物质，往培养昆虫细胞用培养基中放出孢子内细胞物质时形成了微细小孔。
增殖后的微孢子虫孢子本身为抗原，当如上述用酸、碱进行水解除去细胞壁物质的蛋白质后的几丁质珠和聚氨基葡糖珠就不是抗原了。
如上所述，根据本发明，应用昆虫或培养细胞中极大量增殖的微孢子虫孢子，可以得到呈球形或椭球形的、数微米大小的且均匀微细粒径的几丁质珠；此外，将几丁质珠N-脱乙酰化能得到聚氨基葡糖珠。根据本发明，能够制造以前的制造方法极难得到的均匀微细粒径的珠，特别是粒径约1～6微米的无粒径不均的珠，此外，也能制造中空的聚氨基葡糖珠。按此方法制造的均匀微细粒径的几丁质珠和聚氨基葡糖珠可以作为药物释放系统的载体、以及化妆品粉底原料来使用。对于根据本发明的几丁质珠和聚氨基葡糖珠，因微孢子虫的种类不同，可以生产出各种大小的珠。此外，在聚氨基葡糖珠上吸附、固定酶或生物体细胞，就可作为生物反应器用于食品工业及其它广泛的产业之中。
本发明的几丁质珠和聚氨基葡糖珠具有富于反应性的化学组成成分，其表面能够与酶或免疫抗体形成化学或物理的结合。例如，将免疫球蛋白等抗原、抗体在粒子表面和/或内部固定化可以作为免疫载体使用。此外，几丁质用化学反应改造成乙二醇几丁质和羧甲基几丁质等的改性几丁质具有优良的保温性，可以作为化妆品材料使用。还有，将微孢子虫孢子或几丁质珠用乙烯化合物进行接枝加工后，在其上固定α-淀粉酶等酶，不仅能提高酶活性的稳定性，又因为有效表面积增大，更能高效地发挥酶的功能。
将昆虫来源的几丁质珠和聚氨基葡糖珠水解后得到的细胞壁物质为如上所述的几丁质、聚氨基葡糖和葡聚糖等构成，它们中的任一个都是不容易成为抗原的物质。所以，将几丁质珠和聚氨基葡糖珠作为缓释载体包埋于人等动物体内时也不发生抗原抗体反应。除去蛋白质的微孢子虫孢子的细胞壁物质的抗原性已经消失。此外，因为几丁质珠和聚氨基葡糖珠在一定的时间后能被体内的酶完全分解，所以可以作为能在生物体内分解的安全材料使用。
本发明的几丁质和聚氨基葡糖的任一个都可以是内部具有空隙的中空珠，它在细胞壁组织上打开了微细的小孔。所以在负压环境下能够将生物体细胞、细菌、抗生素、生理活性物质等引入微细的空隙。因为将细菌等微生物封入该珠时，被封入的微生物不容易受外界紫外线等的蛋白质变性因素影响，所以该珠可以作为天敌微生物保护材料使用。
本发明的几丁质和聚氨基葡糖例如可以作为亲和层析用载体、细胞培养用载体和医药辅助材料使用，作为药物、生理活性物质、激素和疫苗等的微囊化基质也能发挥优良的特性。将农药或肥料等封入微孢子虫孢子、几丁质珠或聚氨基葡糖珠中胶囊化的物质可以作为土壤改造材料使用；此外，将微量的有效饲料成分和食品材料封入几丁质珠或聚氨基葡糖珠中胶囊化的物质可以作为家畜饲料和养鱼饲料使用。还有，封入、固定化了细菌的微孢子虫孢子、几丁质和聚氨基葡糖对紫外线照射具有保护作用，可以作为生物防护材料用的原料使用。特别地，如果使几丁质珠和聚氨基葡糖珠的粒径一致，则能够在精细化工等领域有特殊的应用。此外，将以根据本发明的几丁质、聚氨基葡糖为成分的微囊作为压敏复印纸使用时，可以提高涂抹过程时的干燥性，此外还可大幅度改善显色打印性。
如上所述，几丁质、聚氨基葡糖微粒子能够有效地应用于农药、工业、医学、食品等广泛的领域。
如前述，微孢子虫孢子、几丁质珠或聚氨基葡糖珠中封入细菌等的微生物或生理活性物质等形成的物质在紫外线照射的情况下，因为细胞壁物质几丁质、聚氨基葡糖吸收了紫外线，阻断了紫外线的能量，所以能够长期保持微孢子虫孢子、几丁质珠和聚氨基葡糖珠中封入的细菌等微生物和生理活性物质等的生物和生理活性。这样，微孢子虫孢子、几丁质珠和聚氨基葡糖珠能够有效地防止封入的生理活性物质、细菌等微生物的活性降低。
本发明中除去蛋白质的几丁质和聚氨基葡糖如上所述即使进入生物体内也难于成为抗原，对生物体没有不良的影响，所以它固定化具有生理作用的药物后，即使将其包埋入人等的体内也不引起基于抗原抗体反应的问题。因此，特别地，封入具有抗癌作用的药物的几丁质珠、聚氨基葡糖珠能够作为用于治疗特定患部的靶向载体应用在尖端的医疗领域。
此外，根据水解处理程度的不同，或者在活性化了微孢子虫孢子的细胞物质、放出内容物的微孢子虫孢子上打开微细小孔的程度的不同，能够简单地控制被负载或封入的药物、生理活性物质、抗生素等的缓释速度、缓释量甚至生物分解性的程度。
实施例接着就实施例和比较例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不仅限于此这些例子。还有，微孢子虫有很多种类，如果没有特别限定就使用家蚕幼虫来源的家蚕微粒子虫。
实施例中细菌活性和抗原性的评价按下述方法进行。A．细菌活性的评价加热溶解后，将15毫升保持在55℃的半合成胁本培养基或King B培养基和2毫升检定菌的孢子液(浓度109-10个/毫升)混合，将此混合物倒入培养皿中固定成平板状。往此菌液混合平板培养基上滴入10微升被检样品，在20～25℃下保持2天后，按下述判定标准分四级评价被检样品下的培养基的细菌增殖抑制程度。
+++强(细菌几乎不增殖，培养基透明度高如透明的玻璃)++较强+弱(细菌稍微增殖，培养基透明度处于透明玻璃和半透明玻璃之间)±轻微(细菌的增殖有1/5的程度，培养基透明度为半透明玻璃程度)-细菌增殖良好，培养基不透明B．对放线菌(霉菌)的抗菌活性的评价方法加热溶解后，将保持在55℃的PSA培养基和2毫升检定菌的孢子液(浓度105-6个/毫升)混合，将此混合物倒入培养皿中固定成平板状，按上述细菌活性的评价进行同样的处理、观察。C．抗原性的评价微孢子虫孢子的抗血清按以下方法调制。将家蚕幼虫传代的孢子以Percoll密度梯度管法进行精制，以2000rpm进行10分钟的离心分离，将沉淀的孢子悬浮于0.85％NaCl溶液中，如此所得的孢子悬浮液(2×108个/毫升)作为抗原，将它和弗氏完全佐剂(Freund’s Complete adjuvant)等量混合，用2毫升所得的混合物对兔子进行1次肌肉注射。在这之后，每次用1毫升孢子悬浮液每隔1周静脉注射4次，从最后的注射起7天后采血。血清在56℃下去活化30分钟，然后在-20℃下保存。
对于凝集反应用的抗原，将精制的微孢子虫孢子用1％的甲醛溶液处理后，以蒸馏水离心洗净，再将此孢子用0.85％NaCl溶液悬浮(4×107个/毫升)调制而成。
将上述抗血清用0.85％NaCl溶液以2倍分级稀释后，在载玻片上与孢子悬浮液等量混合，在37℃下反应1小时后，用倒置显微镜观察，评价凝集反应(效价，滴度)。抗体(抗血清)的稀释倍数分别为16、32、64、128、256、512、1024、2040，按下述判定标准分2级进行评价。
+确认有抗原抗体反应-完全不能确认有抗原抗体反应实施例1将各种微孢子虫孢子接种于家蚕幼虫，进行培养，考查能够从家蚕幼虫中分离出的各种微孢子虫孢子的种名、孢子的大小和抗原性。作为微孢子虫，如表1所示，有家蚕微粒子虫*(Nosema bombycis)(作为比较其它微孢子虫特性的标准种Nosema bombycis Nageli)、家蚕微粒子虫(No.402)、家蚕微粒子虫(No.408)、家蚕微粒子虫(No.520)、家蚕微粒子虫(No.611)、微粒子虫属(M 11)、多形孢虫属(Vairimorpha)(M 12)、微粒子虫属(M 14)、拟微孢子虫属(Plestophola)(M 25)、拟微孢子虫属(M 27)、和消泡微孢子虫属(Thelophania)等。研究结果如表1所示。
所用的微孢子虫孢子的形状大致为椭球形，长径和短径分别为3～5微米和1～3微米，其形状和大小对一定种类的微孢子虫来说是一定的。也就是说，使用一定种类的微孢子虫，能够自由地制造均匀形状的几丁质珠、聚氨基葡糖珠。各种微孢子虫孢子的长径最大为5微米，可以将符合所望用途的微孢子虫作为对象使用。还有，它们对蚕的寄生部位如表1所示。
表
>注)*标准种上述家蚕微粒子虫*(作为标准种的Nosema bombycis Nageli)、微粒子虫属(M 11)和Vairimorpha(M 12)已在农林水产省蚕丝·昆虫农业技术研究所中分别以登记号第860001、860004和860005号保藏，在本申请的优先权日的时间，是本领域技术人员能够得到的菌种。此外，这些微孢子虫，基于布达佩斯条约，在美利坚合众国、马里兰州20852、罗克维尔、Parklawn大道12301号的美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，于1998年3月23日交付国际保藏，其保藏编号分别为ATCC第209694、209693和209692号。这些保藏于ATCC的微孢子虫按ATCC的规定可从第三方获得。实施例2使用上述表1记载的家蚕微粒子虫*、微粒子虫属(M 11)和拟微孢子虫属(M 27)的微孢子虫原虫，对2龄起蚕的家蚕幼虫(日135号×支135号)按每只3×103个的量分别经口接种入各种微孢子虫孢子，微孢子虫孢子在蚕体内增殖后，取出所得的孢子，首先将其在-30℃下冷冻干燥，接着用东西通商株式会社制造的冷冻干燥机进行干燥，得到干燥粉末。为了简单地定性孢子溶液得到的干燥粉末的化学成分，将干燥样品粉末和溴化锂混合，制片，用日本分光工业公司制造的红外分光光度计测定900～1200cm-1波数范围的红外吸收光谱。还有，作为标准样品，使用和光纯药工业株式会社制造的市售标准样品的几丁质。其结果如图1所示。在图1中，红外吸收光谱曲线a表示市售的几丁质，此外，曲线b、c和d分别表示家蚕微粒子虫、微粒子虫属和拟微孢子虫属的结果。所得的标准样品几丁质的红外吸收光谱在985、1025、1065、1100、1145cm-1处出现吸收。即使微孢子虫孢子的种类不同，也和标准几丁质样品的红外吸收光谱大致在同一波数范围(1000～1200cm-1)内有相同的吸收，因此可以确定构成各种微孢子虫孢子细胞壁的主要成分为几丁质。
此外，以经皮接种代替经口接种时，得到与上述相同的结果。
此外，大菜粉蝶用Pieris brassicae、美国白蛾Hyphantria cunea、绢粉蝶Aporia crataegi、人纹污灯蛾Spilosoma subcarnea Walker、蓖麻蚕Philosamia cynthis arrinda和樗蚕Philosamia cynthia等代替家蚕幼虫作为微孢子虫孢子的宿主时，也和上面一样得到构成细胞壁的主要成分为几丁质的微孢子虫孢子。实施例3与实施例2相同，为了定性地阐明从微孢子虫原虫得到的干燥孢子粉末的结晶形态，使用X射线衍射装置(理学电机株式会社制造)摄录X射线衍射照片。所得各样品面间距离的测定值和标准品几丁质一起如表2所示。即使微孢子虫原虫的种类不同，在样品的X射线衍射照片中，也都能见到有对应于8.53、6.70、4.64、3.31埃晶面间距的衍射，它们同时都伴随着宽的晕光。在几丁质标准品的X射线衍射图中，可见对应9.30、6.90、4.64、3.36、3.00、2.80埃晶面间距的衍射，和孢子的X射线衍射图类似。构成微孢子虫孢子细胞壁的主要物质为几丁质，X射线衍射照片也能确认这一点。
表2
实施例4蚕丝·昆虫农业技术研究所保存的微孢子虫、家蚕微粒子虫*(相当于ATCC第209694号)的孢子用于实验，对每只2龄起蚕的家蚕幼虫(日135号×支135号)经口接种入3×103个/毫升的家蚕微粒子虫孢子。因为在家蚕幼虫体内微孢子虫孢子极大量地增殖，发生孢子的形成，家蚕幼虫在5龄期时就皆因微粒子病而死亡。将死亡幼虫在0.85％氯化钠水溶液中磨碎后，用脱脂棉滤过，收集孢子。孢子的精制是将2份0.85％氯化钠水溶液的孢子悬浮液用8份Percoll(商品名瑞典法玛西亚公司制造)提取分层，以3000rpm在25℃下进行30分钟的离心分离。
从1只家蚕幼虫所得的家蚕微粒子虫孢子数总数约为1×1010个。将孢子的水溶液干燥，得到100毫克粉末状的孢子。实施例5对桉大蚕蛾Antheraea eucalypti培养细胞的微孢子虫家蚕微粒子虫*的孢子形成状态按下述方法进行研究。往加了不同量家蚕血清(家蚕体液上清)的市售细胞培养基(Grace培养液，Gibco公司制造)中接种桉大蚕蛾Antheraea eucalypti培养细胞后，加入一定量的微孢子虫家蚕微粒子虫的孢子，培养给定的时间，用血细胞密度计数板在显微镜观察下测定每毫升所含的孢子数。将5龄家蚕幼虫的足用剪刀剪断，用冰冷却的玻璃制试管收集体液，所收集的体液在60℃水浴下加热15分钟，除去所含的蛋白质，使用如此所得的体液的上清。测定结果如表3所示。
从此结果可以明显地看出，在培养细胞增殖时，如果往培养液中加入一定浓度家蚕体液的上清，微孢子虫孢子就容易在培养细胞内大量增殖，形成孢子。作为经济且高效生产微孢子虫孢子的家蚕体液上清的添加量，一般在对应培养液约5～50％重量的范围，优选在10～40％重量范围。
表3
实施例6与实施例5不同，使用其它昆虫来源的培养细胞，讨论培养细胞中微孢子虫孢子的增殖状态。将家蚕微粒子虫*和微粒子虫属(M 11)两种原虫接种于不同种类的昆虫培养细胞，观察昆虫培养细胞中增加的微孢子虫孢子的数量。培养细胞的增殖方法和实施例5一样，评价培养液中所加体液量分别为细胞培养基重量的0％和20％两种情况。所得结果如表4所示。
表4
实施例7按以下方法将上述实施例4制得的微孢子虫、家蚕微粒子虫*孢子的细胞壁物质调制成聚氨基葡糖孢子。首先，将此微孢子虫孢子在40％氢氧化钠溶液中80℃下处理4小时后，加入水洗净。其结果是微孢子细胞壁的主要成分几丁质N-脱乙酰化。光学显微镜和扫描式电子显微镜观察显示，各微孢子虫孢子即使进行N-脱乙酰化处理，微孢子虫孢子也不溶解，仍然保持微孢子形状。实施例8将2毫克和实施例4作同样处理的家蚕微粒子虫孢子水解除去孢子内容物所得的粉末状几丁质孢子的细胞壁组织按以下方法吸附抗生素。水解时，用室温的1N NaOH处理12小时后，用1N HCl在处理12小时。将分别用NaOH和HCl处理1次作为1个循环，合计反复操作5个循环后，为了使孢子脱水最后用95％乙醇处理2小时。这样就能够将作为微孢子虫孢子细胞壁物质的蛋白质完全除去。此外，对于抗生素的吸附来说，将10毫克利福平或四环素用3毫升蒸馏水溶解所得的溶液和该几丁质孢子装入管中，用水流唧筒(水泵)反复进行3次减压、抽气，进一步用超声波进行10分钟处理使抗生素渗透入细胞壁组织。接着，用离心机以2500rmp离心分离20分钟，使含有抗生素的几丁质孢子沉淀下来。进一步加入10毫升蒸馏水，再次离心分离，用倾滗的方法除去上清，分离得到含有利福平或四环素的几丁质孢子。
家蚕微粒子虫孢子中是否负载有利福平或四环素按以下方法确定。将家蚕微粒子虫孢子小心地用水洗3次后，以3000rpm离心分离20分钟回收孢子，评价对番茄溃疡病细菌(密执安棍状杆菌密执安变种Clavibactermichiganensis pv.michiganensis)增殖的抑制程度。其结果表明，即使是反复用水洗的家蚕微粒子虫孢子也能完全抑制番茄溃疡病细菌的增殖，因此判定孢子上负载有抗生素。实施例9应用实施例2所示的红外吸收光谱测定用试样片的制作方法，如下述过程制造完全不用溴化锂只用家蚕微粒子虫孢子作成的圆形板状片。
将200毫克实施例4所得的粉末状家蚕微粒子虫孢子装入日本分光工学工业公司制造的直径10mmφ的红外吸收光谱片剂成形器中，用真空泵抽气20分钟后，用油压式加压装置往片剂成形器上施加150kg/cm2的压力，在此状态保持10分钟的压力，制得厚度约0.3毫米的强韧的圆形板状盘。象这样，能够将本发明所得的微孢子虫孢子作为块状材料使用。实施例10将200毫克实施例4所得粉末状家蚕微粒子虫孢子加入装有冷凝器的50毫升梨形瓶中，再加入30毫升40％重量的氢氧化钠水溶液，用油浴在100℃下处理3小时，得到脱乙酰化度93.6％的均匀微细粒径的聚氨基葡糖珠。实施例11天敌微生物的保护效果(利用微孢子虫孢子的对紫外线的细菌保护作用)如下述将细菌封入微孢子虫孢子中。在和实施例8相同的条件下进行水解处理除去孢子的内容物，将2毫克与实施例4作同样处理所得的粉末状家蚕微粒子虫孢子装入细胞培养用的离心管，往其中加入2.0毫升109个/毫升浓度的地耳腐(褐斑)病细菌托拉氏假单胞菌Pseudomonas tolaasii或番茄溃疡病细菌(密执安棍状杆菌密执安变种Clavibacter michiganensispv.michiganensis)的悬浊液，用水流唧筒减压10分钟后，解除减压，引入空气。减压和空气引入反复操作3次。接着，用离心机以1000rpm离心分离10分钟，孢子在离心管底部聚集。取0.2毫升沉淀的孢子(下面称为有孢子区)，在直径9厘米的玻璃制培养皿内的琼脂培养基上用L字棒均匀地展开。风干孢子液直至在培养基上不呈水状后，将培养基置于距离紫外灯20厘米处，分别照射10秒、30秒、1分钟、2分钟、5分钟。还有，UV照射实验在净化台内进行，光源用national GL-15(15瓦)的杀菌灯。紫外线照射3天后统计1/6培养皿面积上出现的菌落数，评价微孢子虫孢子对紫外线照射的保护作用。所得结果如表5所示。还有，在完全不含有微孢子虫孢子的系统中，将和上述一样在离心管沉淀所得的细菌液作为对照区(下面称为无孢子区)使用。
表5杀菌灯照射时间和封入进行的微孢子虫孢子的保护作用
在上述表5中，1/6培养皿面积中出现的菌落(colony)数太多以致于不能测定时，以“多”表示；此外，对于集落数较多但可以在量上区别时，用+++～-(无)四个级别表示。
在紫外线照射下孢子对细菌的保护作用按下述方法定量化。使用半对数方格纸，将1/6培养皿面积上出现的菌落数的对数作为纵轴，将照射时间以分钟为单位作为横轴。从此图中求出使培养皿中出现的菌落数减少到大约20个所需的照射时间，无孢子区为30秒，有孢子区为5分钟。
从此结果可见，将地耳腐病细菌托拉氏假单胞菌Pseudomonas tolaasii封入家蚕微粒子虫孢子中时，即使受到紫外线照射，封入内部的细菌的死亡率也比无孢子区的低，大约有10倍的保护作用。此外，对番茄溃疡病细菌也可见保护作用。因为可以确认封入所带来的保护作用，所以封入了细菌、酶、生理活性物质等的本发明的微孢子虫孢子作为天敌微生物用的保护载体等很有用。实施例12几丁质孢子的抗生素吸附实验按下述方法，用浓碱溶液处理几丁质珠，将其改性成聚氨基葡糖珠。将100毫克几丁质珠加入装有回流冷凝器的梨形瓶中，加入50毫升30％重量的NaOH水溶液，用油浴在100℃下处理2小时。反应结束后，用充足的蒸馏水洗净，用离心机以3000rpm离心10分钟，制备聚氨基葡糖珠。接着，往0.2毫升10毫克利福平溶于3毫升水调制而成的抗生素水溶液中加入0.5毫克上述聚氨基葡糖珠后，用水流唧筒反复抽气5次，制成一个部分。按实施例8相同的方法研究对番茄溃疡病细菌增殖的抑制作用，结果表明利福平反复抽气5次部分的聚氨基葡糖珠确实吸附了抗生素。为了研究吸附了利福平的微孢子虫孢子的聚氨基葡糖作为缓释载体是否有效，用番茄溃疡病细菌评价其缓释效果。
如上所述，将0.5毫克微孢子虫孢子的聚氨基葡糖粉末分散于0.2毫升上述的利福平水溶液中，将此分散液装入离心管中。接着，以5000rpm离心分离3分钟，将微孢子虫孢子沉淀物和上清分离。将0.1毫升沉淀物装入其它离心管，往其中重新加入1毫升蒸馏水，再次离心分离，以同样方法分离上清和微孢子虫孢子沉淀物。每隔一定时间，就如此所得的沉淀物和上清部分，研究它们对番茄溃疡细菌增殖抑制的抗菌作用。这样得到的结果如表6所示。
表6
含有微孢子虫孢子的沉淀物显示出比上清恒定更高的抗菌活性，因为即使在8天后它也具有抗菌活性，所以可以判定吸附有抗生素的微孢子虫孢子作为抗生素的缓释载体是有效的。作为对照所用的上清稀释液在所经过时间0天时使用对应上清的原液，所经过时间为2、4、6、8天时分别为依次稀释10倍的原液(对应经过时间2、4、6、8天分别稀释为10、100、1000、10000倍)。稀释1000倍时对照稀释上清液的抗菌作用消失，而相同样品所对应上清的抗菌活性依然存在。由此可见，微孢子虫孢子作为抗生素用缓释载体有效。实施例13使用培养细胞的微孢子虫孢子的生产作为昆虫培养细胞，使用天蚕蛾科的一个种桉大蚕蛾Antheraeaeucalypti的培养细胞系、鳞翅目昆虫来源的Bm36培养细胞系。使用分别添加了5％在60℃下加热处理15分钟的家蚕幼虫体液上清和胎牛血清的培养液，将桉大蚕蛾Antheraea eucalypti的培养细胞系、鳞翅目昆虫来源的Bm36培养细胞系分别在Grace培养基上、26℃下进行培养。微孢子虫孢子往培养细胞的接种按下述方法进行。即，用Percoll精制已部分精制的微孢子虫孢子，以0.2N-KOH在25℃下处理30分钟后，将所得的精制孢子和培养细胞混合，以进行接种。
接种10天后收集这些培养细胞，将用超声波清洗器处理破坏的培养细胞的悬浮液用Percoll分层，进行离心分离操作，大量制造微孢子虫孢子。实施例14按下述方法除去和实施例1所用的相同的微孢子虫孢子(家蚕微粒子虫)的细胞壁物质蛋白质，制造无抗原性的几丁质珠。
首先进行水解，在室温下用1N NaOH处理12小时后，再用1NHCl处理12小时。NaOH和HCl处理合计反复操作5次后，最后用95％乙醇处理2小时，将孢子脱水。接着，以2000rpm离心分离20分钟，沉淀孢子，往此沉淀物中加入水，离心分离操作重复7次，制得完全除去孢子细胞壁物质蛋白质的几丁质珠。为了以血清反应检测如此所得的几丁质珠的抗原抗体反应，将从使用了无处理的微孢子虫孢子的家兔制得的抗血清用于实验，使用此抗血清的稀释液，比较对于无处理孢子(对照部分样品)和处理孢子(水解处理样品)，稀释到何种程度的稀释液与其发生血清反应。其结果如表7所示。
表7
注)+有血清反应-没有血清反应对于无处理孢子(对照部分样品)，抗血清即使稀释1024倍也仍然可见血清反应，而对于处理孢子(水解处理样品)稀释到16倍时就完全没有血清反应。这样可以判定，经过水解处理，作为孢子细胞壁成分中抗原的蛋白质已被完全除去，所得的几丁质珠是无抗原性的。
用酸或碱除去微孢子虫孢子的细胞壁物质蛋白质后，主要成分几丁质的量相对增加，测定X射线衍射强度确认这一点。将微孢子虫孢子用火棉胶固定，测定X射线衍射，如上述表2所见，可以观察到R1、R2、R3、R4的衍射环(干涉环)，但任一个都显示出散乱的衍射环。然而如果用酸或碱只是除去细胞壁物质中的蛋白质，那么经过此处理的微孢子虫孢子的几丁质显示的R1～R2的衍射强度变尖锐，证实几丁质含量增加。
此外，即使将经水解处理的样品在25℃下与1％的水合茚三酮反应20小时，也完全不见显色反应，可以确定样品中完全不存在氨基酸。实施例15具有微细小孔的几丁质珠和聚氨基葡糖珠将和实施例1中所用的相同的微孢子虫孢子(拟微孢子虫属M27)的悬浮液加入0.2N的氢氧化钾水溶液中，在25℃下放置30分钟。1小时后用和光纯药工业制造的生物化学用pH7.2磷酸缓冲液中和样品。经过此简单的处理，微孢子虫孢子内的细胞物质被活化，细胞内容物从孢子中放出，用扫描式电子显微镜观察确定此时生成每个约0.3μm的孔。这种放出细胞物质后的微孢子虫孢子的大小为长径1.7μm×短径0.9μm，细胞膜厚约0.13μm，呈细胞壁内全空的椭圆球状，放出细胞物质所形成的孔在椭圆球体长径方向的一端。因为此孔的存在，通过对此微孢子虫孢子环境压力的减压或解除减压，能够很容易地将酶、抗生素、金属离子、药物、病毒、生理活性物质等封入微孢子的空隙中，所以本发明的几丁质珠和聚氨基葡糖珠，作为大小一致、呈微粒状态的上述药效成分的缓释载体很有用。实施例16具有微细小孔的几丁质珠和聚氨基葡糖珠将实施例15中所用的微孢子虫孢子用家蚕微粒子虫No.520代替，其它和实施例15作相同处理。如此所得的放出细胞物质后的微孢子虫孢子的大小为长径2.6μm×短径1.4μm，细胞膜厚约0.13μm，呈细胞壁内全空的椭圆球状，透射式电子显微镜观察确定，放出细胞物质所形成的孔在椭圆球体长径方向的一端，孔的直径为0.1μm。因为此孔的存在，和实施例5一样作为药效成分的缓释载体有效。实施例17只除去微孢子虫孢子的细胞壁物质蛋白质的物质的安全性实验如下述方法进行。
用实施例1中制造的微孢子虫孢子用酸水解处理所得的孢子悬浮液(4×108孢子/毫升)每隔一周给家兔静脉注射，观察家兔的发育过程。接种6个月后，和没有注射的对照组兔子相比，注射了的处理组兔子在体重变化和外观上都完全没有异常。
产业上的利用可能性根据本发明，均匀微细粒径的几丁质珠和聚氨基葡糖珠可以作为药物输送系统用载体、甚至化妆品粉底原料使用。在聚氨基葡糖珠上吸附、固定酶或生物体细胞，能够作为生物反应器应用于食品工业及其它广泛的领域。
此外，在这些珠的表明和/或内部结合酶或免疫抗体等，可以作为免疫载体使用。此外，将几丁质改良成乙二醇几丁质、羧甲基几丁质的改良几丁质具有优良的保温性，能够作为化妆品材料使用。还有，将微孢子虫孢子或几丁质珠用乙烯化合物等进行接枝加工后，如往其中固定酶，不仅能提高酶活性的稳定性，还因为微粒子具有广大有效表面积的特征，能更高效地发挥酶的功能。
将本发明的进行蛋白质除去处理了的几丁质珠、聚氨基葡糖珠即使包埋于包括人在内的动物体内，也不发生抗原抗体反应，因此它可作为缓释载体使用。此外，几丁质珠、聚氨基葡糖珠在经过一定时间后，能被体内的酶分解，可以作为能在生物体内分解的安全材料。几丁质珠、聚氨基葡糖珠即使进入生物组织内也难于成为抗原，所以可以在其上固定具有生理作用的药物，然后埋入体内使用；特别地，封入具抗癌作用药物的几丁质珠、聚氨基葡糖珠作为靶向载体能够利用于尖端的医疗领域。
此外，本发明的几丁质珠、聚氨基葡糖珠可以制成内部有空隙的中空珠，因为细胞壁组织上开有微细小孔，所以能够将生物体细胞、细菌、抗生素、生理活性物质等通过微细小孔封入空隙中。封入的物质因不易受外界的蛋白质变性因素(紫外线等)的影响，其生物活性能够长期保持。所以这些珠例如能够作为天敌微生物保护材料的新原料。
本发明的微孢子虫孢子作为药物、生理活性物质、激素、疫苗等的微囊基质材料也很优秀，将农药、肥料等封入微孢子虫孢子中再胶囊化的物质可以作为土壤改良材料使用。此外，封入饲料成分在胶囊化的物质可以作为家畜饲料和养鱼饲料使用。
根据本发明，通过增减水解处理的程度、或者微孢子虫孢子的细胞壁上微细小孔打开的程度，就能很简单地控制药物、生理活性物质、抗生素等的缓释速度、缓释量、生物分解性的程度。更进一步，因为几丁质珠、聚氨基葡糖珠能被生物体内的酶逐渐分解，所以能够作为生物降解性材料使用。
权利要求
1．昆虫或培养细胞内增殖的微孢子虫孢子制得的、以几丁质为主要细胞壁物质的均匀微细粒径的几丁质珠和该细胞壁物质几丁质N-脱乙酰化形成的聚氨基葡糖珠。
2．根据权利要求1记载的几丁质珠和聚氨基葡糖珠，其中几丁质珠和聚氨基葡糖珠为除去了蛋白质的无抗原性的物质。
3．根据权利要求1或2记载的几丁质珠和聚氨基葡糖珠，其中增殖微孢子虫孢子为其细胞壁上有孔的物质，而且几丁质珠和聚氨基葡糖珠为中空的。
4．载体，是由昆虫或培养细胞内增殖的微孢子虫孢子制得的、以几丁质为主要细胞壁物质的均匀微细粒径的几丁质珠和该细胞壁物质几丁质N-脱乙酰化形成的聚氨基葡糖珠制成的。
5．根据权利要求4记载的载体，其中几丁质珠和聚氨基葡糖珠为除去蛋白质的无抗原性的物质。
6．根据权利要求4或5记载的载体，其中增殖微孢子虫孢子为其细胞壁上有孔的物质，而且几丁质珠和聚氨基葡糖珠为中空的。
7．根据权利要求4～6任一项记载的载体，其中的载体是用于固定或导入生理活性物质、抗生素、生物体细胞、微生物、染料、药物、农药、香料、饲料原料、或食品原料等的物质。
8．一种均匀微细粒径几丁质珠的制造方法，其特征在于，将浓度为5×102～5×108个/毫升的微孢子虫孢子经口或经皮接种于昆虫使之增殖后，取出在生育后的昆虫体内增殖的该微孢子虫孢子，进行精制，得到均匀微细粒子的几丁质珠。
9．根据权利要求8记载的均匀微细粒径的几丁质珠的制造方法，其特征在于，其中的昆虫为2龄起的蚕，上述生育后的昆虫为5龄期。
10．根据权利要求8或9记载的均匀微细粒径的几丁质珠的制造方法，其特征在于，其中的昆虫为家蚕幼虫。
11．一种均匀微细粒径聚氨基葡糖珠的制造方法，其特征在于，将浓度为5×102～5×108个/毫升的微孢子虫孢子经口或经皮接种于昆虫使之增殖后，取出在生育后的昆虫体内增殖的该微孢子虫孢子，进行精制，得到均匀微细粒子的几丁质珠，接着将几丁质珠的几丁质进行N-脱乙酰化，得到聚氨基葡糖珠。
12．根据权利要求11记载的均匀微细粒径的聚氨基葡糖珠的制造方法，其特征在于，其中的昆虫为2龄起的蚕，生育后的昆虫为5龄期。
13．根据权利要求11或12记载的均匀微细粒径的聚氨基葡糖珠的制造方法，其特征在于，其中的昆虫为家蚕幼虫。
14．一种微孢子虫孢子的制造方法，其特征在于，往含有5～50％重量家蚕幼虫体液上清的细胞培养基中加入昆虫来源的培养细胞，往此细胞中接种微孢子虫孢子使之增殖后，从增殖的细胞中取出微孢子虫孢子。
全文摘要
本发明涉及从主要细胞壁物质为几丁质的微孢子虫孢子制得的均匀微细粒径的几丁质珠、该几丁质N－脱乙酰化得到的均匀微细粒径聚氨基葡糖珠、这些珠的制造方法和这些珠制得的载体以及微孢子虫孢子的制造方法。使微孢子虫孢子在昆虫或培养细胞内增殖,得到以几丁质为主要细胞壁物质的均匀微细粒径几丁质珠。使细胞壁物质的几丁质N－脱乙酰化得到聚氨基葡糖珠。昆虫为家蚕幼虫时,将浓度为5×10
文档编号A23L1/22GK1226900SQ98800631
公开日1999年8月25日 申请日期1998年5月13日 优先权日1997年5月14日
发明者冢田益裕, 白田昭, 早坂昭二 申请人:农林水产省蚕丝、昆虫农业技术研究所长代表的日本国 被以下专利引用 (1),