专利名称：用随机或确定的引物来重组多核苷酸序列的制作方法
依照能源部授予的No.DE-FG02-93-CH10578号资助和海洋研究部授予的No.N00014-96-1-0340资助，美国政府对于本发明享有一定的权利。
技术领域：
本发明涉及本发明总的来讲涉及多核苷酸序列体外诱变和重组的方法。更具体地，本发明包括一种以聚合酶催化引物寡核苷酸延伸为基础进行多核苷酸序列体外诱变和重组，然后进行基因装配和任选地基因扩增的简单而有效的方法。
2．相关领域描述本文中提到的用来描述本发明背景以及提供附加关于其实践的详细描述的出版物和其它参考材料均结合人本文作参考。为方便起见，参考材料用数字来引述，它们归纳在附加的书目中。
构造蛋白质工程化的目的是要改善它们在实践应用中的性能。所需的性能与其感兴趣的应用有关，可以包括更牢固地与受体结合、高的催化活性、高的稳定性、接受较宽(或较窄)范围底物的能力或是在非自然环境如有机溶剂中起作用的能力。各种方法(包括“理性”设计和随机诱变的方法)已经被成功用来优化蛋白质功能(1)。对于给定的优化课题，方法的选择将取决于对序列，结构和功能之间关系的了解程度。例如，理性地重新设计酶的催化部位通常需要对酶结构、酶与各种配体的复合体的结构、反应中间产物的类似物以及催化机理的详细情况有广泛的了解。这些信息对于少数已经充分研究的系统来说是可以获得的，但是对于大部分有潜在价值的酶还知之甚少。对于决定已有蛋白质功能的氨基酸以及可能会产生新功能的氨基酸的鉴定仍旧是令人困扰的问题。这个问题，以及人们逐渐知道许多蛋白质的功能并不局限于少量氨基酸而是受远离活性位点的残基影响的事实，都促使大量精力转向随机诱变或“定向”进化来构造新的蛋白质(1)。
自然进化已经启发了各种优化方法如基因算法(2,3)和进化策略(4,5)。这些方法采用诱变(在种群成员中作少量随机的变化)和交换(结合不同个体的性能)来实现特定的优化目的。如不同的优化问题的计算机模拟所显示的，诱变和交换间也存在强的相互作用(6-9)。发展有效且实用的试验技术来模仿这些关键方法是一个科学挑战。这些技术的应用应使技术人员能在体内或甚至完全脱离生存系统限制下研究和优化生物分子，如蛋白质和核酸(10,11)。
受自然进化的启发，定向进化方法包括生成诱变分子的库并进行选择或筛选，该分子库有足够的多样性能编码功能变化或增强的蛋白质分子。它通常首先是生成诱变基因文库。在所需性能或所需一系列性能方面有所改进的基因产物可通过选择或筛选来鉴定。可对编码这些产物的基因再循环进行该方法，以积累有利的突变。该进化方法可包括几代或许多代，这由所希望进展的程度和每一代中观察到的典型的突变效果来确定。这些方法可用来生成有新功能的核酸(12)、肽和其它小分子(12)、抗体(12)以及酶和其它蛋白质(13、14、16)。定向进化不需要非常了解产物本身，它只是一种评价待优化功能的方法。这些方法允许在功能评价中有误差和噪扰。
通过采用各种方法(包括PCR诱变(15)或组合盒式诱变(16))引入新的点突变，可使定向进化中的基因产生多样性。然而，由于基因在自然进化中起重要作用，因此，重组基因的能力可为进化过程提供重要的发展方向。同源重组是一个重要的自然过程，在该过程中有机体在相关的基因之间交换遗传信息，从而增加了物种内可及基因的多样性。在将潜在的强适应性和多样化竞争引入它们的宿主中的同时，这些途径也在非常低的效率下进行，通常甚至是在数十代后也只会在途径结构或功能上引起不显著的变化。因此，尽管这些机理在地质时代期间对宿主有机体/物种有利，但体内重组的方法是不适用的，如果不是不能采用，设计酶或其它蛋白质性能的重组方法与有机体的中间代谢及存活没有很大的关系。
一些研究组已经确认了基因重组在定向进化中的用途。例如在出版的PCT申请WO 97/07205和美国专利No.5,093,257中公开了体内基因重组的方法。如上所述，这些体内重组的方法是烦琐的，而且对功能迅速进化的效果差。Stemmer公开了一种体外重组相关DNA序列的方法，在该方法中通常是用酶(如DNA酶Ⅰ)将亲代序列切成片段，然后重装配(17、18、19)。然而，DNA酶Ⅰ和其它内切核酸酶形成的非随机的DNA片段将偏性引入了重组体，并限制了重组的多样性。而且，该方法局限于双链多核苷酸的重组，而不能用于单链模板。另外，该方法对某些基因和引物的组合是无效的。例如，它不能有效地重组短序列(小于200核苷酸(nt))。最后，它的劳动强度相当大，需要好几个步骤。或者说，需要有方便的方法来通过点诱变和重组产生新的基因。
发明概述本发明提供了一种新颖的，有显著改进的通过一系列亲代序列(模板)的点突变和重组来产生新的多核苷酸序列的方法。新的多核苷酸本身是有用的(例如用于DNA为基的计算)，或它们可在重组有机体中表达，以使基因产物定向进化。本发明的一个实例包括用随机序列的寡核苷酸对模板基因进行引导，以生成DNA短片段的库。在合适的反应条件下，这些DNA短片段可根据互补性相互引导，从而可在热稳定的DNA聚合酶存在下通过重复热循环来重装配成全长基因。这些含有点突变和与亲代基因不同的新的序列组合的重装配的基因可用常规的PCR来进一步扩增，并克隆入合适的载体中来表达编码的蛋白。对基因产物进行筛选或选择可获得功能有所改进甚至是新功能的新变种。这些变种本身可被使用，或它们可作为新一轮诱变和重组循环的新的起始点。
本发明的第二个实例包括用一系列有确定序列或表现出有限随机性的确定序列的引物寡核苷酸来引导模板基因，以生成DNA短片段库，然后如上所述将它们重装配成全长基因。
本发明的第三个实例包括一种新的方法(我们称之为“交错延伸”或StEP)。全长基因是在模板存在下装配成的，而不是延伸的引物产生的片段库重装配成的。StEP包括变性然后极短退火/延伸步骤的重复循环。在每次循环时，延伸的片段可根据互补性退火到不同的模板上并稍有延伸以形成“重组盒”。由于该模板的转换作用，大多数多核苷酸含有与亲代基因不同的序列(即新的重组体)。重复该方法直至形成全长基因。然后还可任选地进行基因扩增。
本发明中不同的实例为不同的应用提供了特色和便利。在最佳的实例中，在StEP中采用一种或多种确定的引物或是表现出有限随机性的确定引物(对应于模板的多核苷酸或侧接在模板多核苷酸的5′和3′末端)，以产生可形成新的全长序列的基因片段。这种简单的方法不需模板序列的信息。
在另一个较佳的实例中，采用了多种确定的引物或是有有限随机性的确定引物，以生成可重装配成全长基因的短基因片段。多种确定引物的采用使体外重组频率产生偏性。如果可以获得序列信息，则可以设计引物以形成重叠重组盒从而增加特定位置的重组体频率。在其它特征中，本方法能灵活地利用已获得的结构和功能信息以及在前几代诱变和选择(或筛选)中积累的信息。
除了重组外，以引物为基础的重组方法的不同实例会产生点突变。这期望能够知道并控制该点突变比例，因为这可通过控制DNA合成和基因重装配的条件来实现。采用确定引物的方法中，通过采用诱变引物也可将特定的点突变定向到序列的特定位置上。
本发明的各种引物为基础的重组方法已经表现出可在较宽的pH范围内、在有机溶剂存在下增强犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis)ECB脱酰酶的活性，并可改善枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)枯草杆菌蛋白酶E.(subtilisin E.)的热稳定性。DNA测序确认了点突变以及重组在新序列产生中的作用。发现这些过程均是简单可行的。
通过结合附图参看下列详述能更好地理解上述的以及其它许多特征和伴随的优点。
附图简述
图1示出了根据本发明采用随机下列的引物和基因重装配的重组方法。步骤如下a)用中温或嗜热聚合酶以随机序列的寡核苷酸作为引物(引物未示出)来合成单链DNA片段；b)除去模板；c)用嗜热DNA聚合酶进行重装配；d)用热稳定聚合酶扩增；e)克隆和筛选(任选步骤)；和f)选择基因重复上述步骤(任选步骤)。
图2示出了根据本发明采用确定引物的重组方法。方法对两个基因的重组进行描述，其中X=突变。步骤如下在分次(每次反应2个引物)或组合(每次反应多个引物)的PCR反应中采用确定引物来引导基因；c)生成最初产物直至耗尽确定的引物。除去模板(任选)；d)不加入外部引物，在PCR再循环中使最初的片段自身引导并延伸。继续装配直至形成全长基因；e)(任选)在PCR反应中用外部引物扩增全长基因；f)(任选)对所选的基因，重复上述方法。
图3示出了根据本发明采用两种确定的侧翼引物和StEP的重组方法。这里只用一个引物和来自两个模板的两个单链来描述重组方法。主要步骤如下a)在变性后，用一个确定引物来引导模板基因；b)通过引物在短时间内的延伸获得短片段；c)在StEP下次循环中，使片段随机地作为模板的引物并进一步延伸；d)重复变性和退火/延伸，直至形成全长基因(在琼脂糖凝胶上可见)；e)在PCR反应中用外部引物纯化或扩增全长基因(任选)；f)对选出的基因重复上述方法(任选)。
图4是根据本发明采用两个侧翼引物和交错延伸的重组结果的示意图。图中示出了从重组文库中选出的5个基因的DNA序列，其中X是亲代基因中存在的突变，三角表示新的点突变。
图5是实施例3中描述的pNB酯酶基因序列的示意图。模板基因2-13和5-B12用确定引物方法来重组。引物的位置用箭头表示，X表示亲代序列间互不相同的位置。新的点突变用三角表示。图中示出了这些重组基因中确定的突变(只显示了与亲代序列不同的位置)。6E6和6H1均为该模板基因的重组产物。
图6示出了四种确定的内部引物的位置和序列，所述内部引物可以通过散布引物为基础的重组方法来从模板基因R1和R2形成重组基因。引物P50F含有一个突变(A变为T，碱基598处)，它在消除了HindⅢ限制性立点的同时增加的新的独特的NheⅠ位点。基因R2也含有一个突变(A变为G，在同一位置)，它消除了HindⅢ位点。
图7是显示40个克隆中质粒的限制性消化结果的电泳凝胶图。
图8显示了对来自确定引物为基的重组文库中的10个基因的测序结果。划线表示986个碱基的枯草杆菌蛋白酶E基因，该基因包括前导序列的45个核苷酸、整个成熟序列和终止密码子后的113个核苷酸。交叉表示来自亲代基因R1和R2的突变位置，而三角表示在重组过程中引入的新的点突变位置。圆圈表示诱变引物P50F引入的突变。
图9表示将随机序列引物重组方法用于犹他游动放线菌ECB脱酰酶基因的结果。(a)从琼脂糖凝胶中纯化获得2.4kb的ECB脱酰酶基因。(b)随机引导物的大小在100-500碱基范围内。(c)分离获得小于300碱基的片段。(d)将纯化后的片段重装配成成片条带背景的全长基因。(e)在用两个位于脱酰酶基因起始和终止区的引物进行常规的PCR反应后，获得与ECB脱酰酶基因大小相同的单个PCR产物。(f)在用XhoⅠ和PshAⅠ消化PCR产物后，将产物克隆入经修饰的pIJ702载体中，以形成突变体文库。(g)将该文库引入淡紫链霉菌(Streptomyces lividans)TK23中，获得的克隆中约71％能生成有活性ECB脱酰酶。
图10显示了野生型ECB脱酰酶和根据本发明获得的突变株M16的比活。
图11显示了野生型ECB脱酰酶和根据本发明获得的突变株M16的活性的pH曲线。
图12显示了从Klenow文库随机选出的10个克隆的DNA序列分析。划线表示986个碱基的枯草杆菌蛋白酶E基因，该基因包括前导序列的45个核苷酸、整个成熟序列和终止密码子后的113个核苷酸。交叉表示来自R1和R2的突变位置，而三角表示在随机引导重组方法中引入的新的点突变位置。
图13是从5个文库中筛选出的克隆的热稳定性指数曲线，这些文库用不同的聚合酶来生成a)Klenow文库，b)T4文库，c)Sequenase文库，d)Stoffel文库和e)Pfu文库。用在65℃下培育的标准化残余活性(Ar/Ai)作为酶热稳定性的指数。数据以下降的次序来分类并绘图。
发明详述在本发明的一个优选的实例中，将一组含有有所有可能的核苷酸序列组合(dp(N)L，其中L=引物长度)的引物用于引物为基础的重组中。很多年前就已知道，不同长度的寡脱氧核苷酸可作为引物，用于通过大肠杆菌聚合酶Ⅰ的Klenow片段来引发单链模板上的DNA合成(21)。尽管它们比普通PCR引物短(即小于13个碱基)，但是短达六核苷酸的寡聚物就足以引导反应，而且它经常用于标记反应(22)。图1中显示了根据本发明用随机引物来形成基因片段库，然后进行基因重装配。步骤包括通过随机引导从单链多核苷酸模板中产生不同的“繁殖块”，在DNA聚合酶和核苷酸存在下通过进行热循环来从生成的新生DNA短片段重装配获得全长DNA，用常规PCR对重装配产物中所需的基因进行扩增以用于进一步的克隆和筛选。在该过程中，新的突变主要是在引导步骤引入，但是也在其它步骤中引入。这些新的突变和模板序列中已经存在的突变在重装配时重新组合，形成新的DNA序列的文库。如果需要，该方法可对选出的序列重复进行。
为了实现随机引导，模板可以是线形或闭合环形的单链或变性双链多核苷酸。模板可等摩尔混合，或根据分析它们功能作用来混合。由于在至少一些例子中，模板基因被克隆入不应引入其它突变的载体，因此它们通常首先是用限制性内切核酸酶来断裂然后从载体中纯化获得。将获得的线形DNA分子煮沸变性，退火成随机序列的寡脱氧核苷酸，并在合适量的dNTP存在下与DNA聚合酶一起培育。六核苷酸的引物是较佳的，但是也可采用较长的随机引物(可高达24碱基)，这由DNA聚合酶和随机引导合成时采用的条件来决定。这样，寡核苷酸在不同的位置上沿着整个靶区域引导感兴趣的DNA，并延伸形成与模板DNA每个链互补的DNA短片段。由于碱基的错插入和错引导，这些DNA短片段中也含有点突变。在已建立的常规反应条件下，DNA短片段可根据同源性相互引导，并且可通过热稳定DNA聚合酶存在下的重复热循环来重装配成全长基因。获得的全长基因会有不同的序列，然而它们中大多数仍与原始的模板DNA相同。这些序列可通过常规的PCR进一步扩增，并克隆入载体中进行表达。对表达出的突变株进行筛选或选择应形成功能有所改进甚至有新功能的变种。这些变种可立即用作实践问题的部分解决手段，或它们可作为新的起始点以进一步进行定向进化循环。
与用于蛋白质优化的其它技术(如组合盒和寡核苷酸定向诱变(24、25、26)、易错PCR(27、28)或DNA改组(17、18、19))相比，用于蛋白质体外进化的以随机引物为基础的过程的一些优点归纳如下1．用于随机引导合成的模板可以是单链或双链多核苷酸。相反，易错PCR和DNA改组的重组方法(17、18、19)只能采用双链多核苷酸。通过采用本文描述的技术，用不同的DNA依赖型DNA聚合酶可在DNA水平上引入突变和/交换，或者甚至可以通过采用不同的RNA依赖型DNA聚合酶来直接从mRNA引入。重组可用单链DNA模板来进行。
2．与DNA改组的方法(该方法需要双链DNA模板的片段来产生随机的片段(通常靠DNA酶Ⅰ来实现))相反，本文所述的技术采用随机引导合成来获得大小可控的DNA片段，以作为进一步重装配的“繁殖块”(图1)。一个明显的优点是消除了两种核酸酶(DNA酶Ⅰ和5′-3′外切核酸酶)的活性来源，这使得更容易控制最终重装配的大小以及基因片段的扩增。
3．由于随机引物是一群在每个位置含有所有四种碱基的合成寡核苷酸，因此它们在长度上是均匀的，并且没有序列偏性。序列不均一性使得它们在许多部位都与模板DNA链形成杂交体，这样，模板的每个核苷酸(5′端的核苷酸可能除外)应以相同的频率拷贝入产物中。通过这种方式，可发生比例如易错PCR或DNA改组更随机的突变和交换。
4．随机引导的DNA合成是以六核苷酸的化合物杂交形成DNA模板为基础的，互补链是通过随机六核苷酸引物的3′OH端用聚合酶和四种三磷酸脱氧核苷酸来形成的。因此，反应与DNA模板的长度无关。长度为200碱基的DNA片段的引导与线型质粒或λDNA有同样好的效果(29)。这对于象工程肽是特别适用的。
5．由于DNA酶Ⅰ是一种倾向于在嘧啶核苷酸相邻位点上水解双链DNA的内切核酸酶，因此其在DNA改组中的应用会在模板基因消化步骤中产生偏性(尤其是对于GC或AT高含量的基因)。这种潜在的偏性对于整个突变比例和重组频率的影响可通过采用随机引导方法来加以避免。通过在随机寡核苷酸文库中增加A和T的含量，就可克服随机引导中由于与模板DNA的GC区域择优杂交而产出的偏性。
实践本发明的一个重要部分是在随机引导过程中控制合成的新生单链DNA的平均大小。该步骤已经由其它人进行了详细地研究，Hodgson和Fisk(30)发现，合成的单链DNA的平均大小与引物浓度成反函数
其中Pc是引物浓度。引物浓度与获得的DNA片段大小间的反比关系可能是由于空间位阻的缘故。根据这一指导思想，对于不同长度的单个基因很容易确定随机引导合成的合适条件。
由于目前可获得数十种聚合酶，因此新生DNA短片段的合成可通过各种方式来实现。例如，可用噬菌体T4 DNA聚合酶(23)或T7测序酶2.0版DNA聚合酶(31、32)来进行随机引导合成。
对于单链多核苷酸模板(尤其是RNA模板)来说，逆转录酶对于随机引导合成是较佳的。由于该酶缺少3′至5′的外切核酸酶活性，因此它很容易发生差错。在高浓度的dNTP和Mn2+存在下，大约每500个碱基中会错掺入1个碱基(29)。
通过改变反应条件，可调节PCR使其适用于采用热稳定聚合酶来随机引导合成新生DNA短片段。一个重要的考虑因素是用常规实验来确证随机短引物退火到模板上并能在较高的温度下提供足够的DNA扩增物的反应条件。我们已经发现，短达dp(N)12的随机引物可与PCR一同使用，以生成延伸的引物。通过使PCR适应随机引导合成，可提供一种方便地制备新生DNA短片段的简便方法，并使得这种随机引导的重组技术非常可靠。
在许多进化方案中，重组应在至少一些模板序列的序列信息已知的寡核苷酸序列间进行。在这些方案中，通常可以确定并合成一系列散布在不同突变间的引物。在采用确定引物时，它们的长度可以是6-100个碱基。本发明发现，通过使这些确定引物引发一系列重叠引物延伸反应(可通过热循环来实现)，就可以生成重组盒，每个盒含有一个或多个模板间等位或同种型差别积累的突变。通过采用能在DNA聚合反应中形成重叠延伸产物的确定引物，可获得的引物的耗尽会使引物延伸产物形成渐进交叉杂交，直至生成全部基因产物。退火、延伸和变性的重复循环保证了每个重叠的盒相互重组。
本发明的一个较佳的实例是方法中采用一系列确定的引物来引导DNA合成。图2描述了本发明中采用确定引物的典型方案。寡核苷酸引物的仔细设计和定位能生成非随机延伸的重组引物，并能确定沿同源模板长度上的主要的重组(共同分离)行为。
本发明的另一个实例是在模板存在下引物为基础的基因重装配和重组的一种变化方案。如图3所述，在本发明包括的重组方法中，在变性前使酶催化的DNA聚合反应简短进行(通过缩短时间和降低延伸步骤的温度)。在延伸片段随机退火到模板序列上并继续部分延伸后进行变性。根据引物和模板的浓度重复该方法多次，直至生成全长序列。该方法称为交错延伸或StEP。尽管随机引物也可用于StEP，但是基因合成不如采用确定引物那样有效。因此确定引物是较佳的。
在该方法中，简短的退火/延伸步骤用来生成部分延伸的引物。典型的退火/延伸步骤是在引物退火忠实性较高(T退火大于Tm-25)，但将聚合/延伸限定在不大于几秒(或平均延伸小于300碱基)的条件下进行的。最小的延伸宜约为20-50碱基。已经证实，热稳定DNA聚合酶在最优温度下通常有最大的聚合速度(100-150核苷酸/秒/酶分子)，但是在温度接近最优温度(T最优)时近似按Arrhenius动力学变化。因此，在55℃时，热稳定聚合酶的速度只有72℃时处于稳态的聚合反应速度的20-25％(24核苷酸/秒)(40)。在37℃和22℃时，据报道Taq聚合酶的延伸活性分别为1.5和0.25核苷酸/秒(24)。时间和温度均可根据所需的重组行为和对聚合酶基础动力学和生物化学的了解程度来作常规的变化。
通过在引物延伸的不同时间点处从反应管中取出等份并用琼脂糖凝胶电泳来分离DNA片段，可监测交错延伸方法的过程。从过程早期的低分子量“成片条带”随循环次数的增加而分子量增加的现象可以看出，引物延伸是有效的。
与基因扩增过程(该过程呈指数型生成新的DNA)不同，StEP在其早期循环中是以添加的形式生成新的DNA片段的，该DNA片段含有对应于不同模板基因的区段。在非扩增的条件下，StEP循环20次将产生最大约为原始模板浓度40倍的DNA摩尔得率。相比较而言，理想的聚合酶链反应来扩增基因的过程具有成倍增加的活性，在相同次数的步骤内它能提供最大约为1×106倍的摩尔得率。在实践中，两种过程的区别可通过PCR来观察，当以模板浓度低于1ng/μl和引物10-500倍过量作为开始时在几次(小于10)循环后发现有一条清晰的“条带”(与基因扩增典型的106倍相比)。在相同的反应条件下，预计StEP会形成不清晰的“成片条带”，该成片条带的分子量会随循环次数的增加而增加。当显著量的引物延伸的DNA分子开始超过全长基因的1/2长度时，分子量会迅速阶跃，因为延伸一半的正向链和反向链开始交叉杂交生成片段，该片段的大小接近在过程中该点处的大小的2倍。在这时，通过使DNA继续受StEP作用，或是改变热循环使引导的DNA完全延伸以推动基因的指数型扩增，成片条带会迅速合成分散的有合适分子量的条带。
在基因装配(如果需要可转变成双链形式)后，对重组的基因进行扩增(任选)，用合适的限制性酶进行消化，并连接入表达载体中以筛选表达的基因产物。如果需要可重复上述过程，以积累序列变化以使所需功能进化。
交错延伸和同源基因装配方法(StEP)是一种以随机或偏性方式重组相似基因的有效而灵活的方法。通过控制引物的替换和退火/延伸步骤采用的时间，该方法可用来侧重于已知一系列序列的特异性区域内或其外部的重组。它也可用来重组单独或在一个反应内生成的同源性遗传信息的特异性盒。该方法也适用于重组遗传信息未知但可制得功能性5′和3′扩增引物的基因。与其它重组方法不同，交错延伸过程可一个试管中通过常规步骤获得，而不需要复杂的分离或纯化步骤。
本发明的确定引物实例的一些优点归纳如下1．StEP方法不要求将亲代分子从装配产物中分离出来。
2．确定引物可用来偏性重组发生的位置。
3．StEP可通过改变延伸时间来调节重组频率。
4．重组过程可在一个试管中进行，5．过程可在单链或双链多核苷酸上进行。
6．过程避免了DAN酶Ⅰ或其它内切核酸酶引入的偏性。
7．可采用通用引物。
8．有限随机性的确定引物可用来在所选的基因区域内提高突变频率。
如本领域技术人员所了解的，本发明的几个实例是可行的。典型的实例包括1．相关基因的重组和点突变，只采用确定侧翼引物和交错延伸。
2．相关基因的重组和突变，用浓度足够低的侧翼引物和一系列内部引物(浓度低得足以使引物会在热循环期间耗尽)，使重叠基因片段交叉杂交并延伸，直至生成重组的合成基因。
3．基因的重组和突变，采用高浓度随机序列引物，以生或可重装配成新基因的DNA短片段库。
4．基因的重组和突变，采用一系列确定引物，生成可重装配成新基因的DNA片段库。
5．单链多核苷酸的重组和突变，采用一种或多种确定引物和交错延伸，生成新基因。
6．重组，在引物内超过30％或60％的核苷酸位置上采用有限随机性的确定引物。
表示引物为基础的重组方法的实施例如下。
实施例1采用确定的侧翼引物和交错延伸来重组并增强枯草杆菌蛋白酶E的热稳定性本实施例显示了确定引物重组方法是怎样通过重组两个已知编码热稳定性超过野生型枯草杆菌蛋白酶E的枯草杆菌蛋白酶E变种的基因来增强枯草杆菌蛋白酶E的热稳定性。本实施例表述了图3中所述的采用仅两个对应于模板5′端和3′端的引物的总的方法。
如图3所示，首先通过交错延伸过程(StEP)(该过程包括变性以及随后极短退火/延伸步骤的重复循环)生成延伸的重组引物。通过在DNA聚合酶存在下热循环辅助的同源基因装配可将延伸片段重新装配成全长基因，然后进行任选的基因扩增步骤。
用两种热稳定枯草杆菌蛋白酶E突变株R1和R2来测试采用交错延伸的确定引物为基础的重组技术。表1中显示了两种基因互不相同的位置。在R1和R2互不相同的10个核苷酸位置中，只有那些导致氨基酸取代(Asn181-Asp(N181D)和Asn218-Ser(N218S))的突变会赋予热稳定性(33)。单个变种N181D和N218S在65℃下的半寿期分别约比野生型枯草杆菌蛋白酶E大3倍和2倍，它们的解链温度Tm分别比野生型酶高3.7℃和3.2℃。获得含有这两个功能性突变的随机重组将使得酶在65℃下的半寿期约比野生型枯草杆菌蛋白酶E高8倍，只要在重组过程中这些基因中没有引入新的破坏性突变。而且，重组过程的总体点诱变比例可以根据重组变种文库中少量样品的催化活性曲线来估计。如果点诱变比例为0，则种群的25％应表现出类似野生型的活性，25％应有双倍的类似突变株的活性，而其余50％应有类似单突变株(N181D或N218S)的活性。有限的点诱变增加了文库中编码类似野生型活性(或更低)的酶部分。这一部分可用来估算点诱变比例。
表1热稳定枯草杆菌蛋白酶E突变株R1和R2中的DNA和氨基酸取代
所示的突变是相对780处碱基取代的野生型枯草杆菌蛋白酶E。
材料和方法采用两个侧翼引物的确定引物为基础的重组步骤将两个确定引物(分别对应于5′和3′侧翼引物)，P5N(5′-CCGAG CGTTGCATAT GTGGA AG-3′(SEQ ID NO:1)，有下划线的序列是NdeⅠ限制性位点)和P3B(5′-CGACT CTAGA GGATC CGATT C-3′(SEQ ID NO:2)，有下划线的序列是BamHⅠ限制性位点)用于重组。条件(100μl最终体积)是将0.15pmol含有基因R1和R2(1∶1混合)的质粒DNA用作模板，每种侧翼引物各15pmol,1份Taq缓冲液，每种dNTP各0.2mM,1.5mM MgCl2和0.25U Taq聚合酶。步骤是95℃下5分钟，循环80次的94℃30秒、55℃5秒。在电泳后将有正确大小(约1kb)的产物从0.8％琼脂糖凝胶上切下，并用QIAEXⅡ凝胶抽提试剂盒纯化。该纯化后的产物用NdeⅠh BamHⅠ消化，并亚克隆入pBE3穿梭载体中。使该基因文库在大肠杆菌HB101中扩增，并转移入枯草芽胞杆菌DB428感受态细胞中进行表达和筛选(如其它文献中所述(35))。
DNA测序用QIAprep自旋质粒少量制备试剂盒纯化基因，获得测序级的DNA。在ABI373 DNA测序系统上用Dye Terminator Cycle Sequencing试剂盒(Perkin-Elmer,Branchburg,NJ)进行测序。
结果通过在引物延伸过程的不同时间点时从反应试管中取出等份(10μl)并用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段来监测交错延伸的进展情况。引物延伸反应的凝胶电泳结果揭示了在55℃退火/延伸反应5秒会形成接近100bp(20次循环后)、400bp(40次循环后)、800bp(60次循环后)的成片条带，最终该成片条带中有明显的约1kb的条带。用凝胶纯化该条带(重装配产物的混合物)，用限制性酶BamHⅠ和NdeⅠ对其进行消化，并与BamHⅠ-NdeⅠ消化大肠杆菌/枯草芽胞杆菌pBE3穿梭载体产生的载体连接。使该基因文库在大肠杆菌HB101中扩增，并转移入枯草芽胞杆菌DB428感受态细胞中进行表达和筛选(35)。
如前所述(33)在96孔板形式中测定酶变种的热稳定性。筛选约200个克隆，约25％保留有枯草杆菌蛋白酶活性。在这些活性克隆中，类似双倍突变株表型(高的热稳定性)的频率约为23％，单一的突变株类似表型约为42％，而野生型表型约为34％。这一分布与两个热稳定突变株N218S和N181D可相互完全自由地重新组合时预计的数值非常接近。
从大肠杆菌HB101基因文库中随机挑选出20个克隆。分离出它们的质粒DNA并用NdeⅠ和BamHⅠ消化。20个中有9个(45％)有大小正确(约1kb)的插入片段。因此上述文库中约55％没有活性，因为它们缺失正确的枯草杆菌蛋白酶E基因。这些克隆并不是枯草杆菌蛋白酶文库的成员，并应从我们的统计中排除。考虑到这一因素，我们发现文库中55％(45％的插入片段大小正确的克隆中有25％克隆有活性)保留了枯草杆菌蛋白酶活性。这一活性曲线表明，点诱变比例小于2个突变/基因(36)。对5个有正确大小的插入片段的克隆进行测序。结果归纳在图4中。所有的5个基因是有最小交换(从1变为4)的重组产物。在这5个基因中只发现有一个新的点突变。
实施例2采用确定的侧翼引物和交错延伸来重组pNB酯酶突变株用于本实施例pNB酯酶的二引物重组方法与实施例1中对于枯草杆菌蛋白酶E所述的方法相似。采用两个模板pNB酯酶突变基因，其中有14个碱基处不同。两个模板(61C7和4G4)均以质粒形式使用。两个靶基因在延伸反应中的浓度为1ng/μl。侧翼引物(RM1A和RM2A，表2)加入至最终浓度为2n/gμl(约超过模板的200倍)。
表2pNB酯酶基因重组中采用的引物引物 序列RM1AGAG CAC ATC AGA TCT ATT AAC(SEQ ID NO:3)RM2AGGA GTG GCT CAC AGT CGG TGG(SEQ ID NO:4)根据克隆61C7在有机溶剂中的活性来分离克隆61C7，它相对于野生型序列含有13处DNA突变。从热稳定性分离获得克隆4G4，与野生型相比，它含有17处DNA突变。由于有相同的祖先，它们中有8处相同的突变。4G4的基因产物明显比61C7的基因产物更具热稳定性。因此，基因间重组的一种测定方法是高溶剂活性和高稳定性的共同分离或重组基因中两种性质均丧失。另外，重组频率和诱变比例可通过对随机克隆进行测序来确定。
对于pNB酯酶，引物延伸通过90次循环的延伸以94℃下30秒然后55℃下15秒的热循环来进行。在经20、40、60、70、80和90次循环后取出等份样品(10μl)。琼脂糖凝胶电泳揭示了在循环20次时形成低分子量的“成片条带”，该条带的平均大小和总体密度在随后的每次样品点中增大。在循环90次时，条带明显从0.5kb延伸至4kb，并表现出最大信号密度约为2kb(全长基因的长度)。从半长跃至全长在循环60-70次间发生。
用6次聚合酶链反应对密集的成片条带进行扩增，以更清晰的地确定全长重组的基因群。另外也用侧翼引物对负引物(minus-primer)对照进行扩增，以确定由于反应混合物中由于残余的模板而引起的背景值。引物延伸基因群的条带密度比对照大10多倍，这表明，扩增的非重组模板只含有少部分的扩增基因群。
用用限制性酶XbaⅠ和BamHⅠ来消化扩增重组基因库并连接入pNB106R表达载体中(如Zock等所述(35))。用共知的氯化钙转化方法将连接后的DNA转化入大肠杆菌株系TG1中。在含有20μg/ml四环素的LB/琼脂板挑取转化的菌落。
通过测定表达活性酯酶的克隆的百分数来确定该过程的诱变比例。另外，对随机挑取的菌落进行测序，并用来确定该方法的诱变频率和重组效率。
实施例3用散布于内部的确定引物和交错延伸来重组pNB酯酶基因本实施例证明了散布的确定引物的重组方法可通过在亲代序列存在下点诱变和突变体重组来生成新的序列。
实验设计和背景信息用确定引物重组技术来重组两个pNB酯酶基因(2-13和5-B12)。经测定，2-13和5-B12的基因产物比野生型对热更加稳定。基因2-13含有9个野生型序列中原来不存在的突变，而基因5-B12含有14个。图5中显示了这两个基因互不相同的位置。
表3显示了本实施例中采用的8个引物的序列。表中示出了和模板基因少量退火的位置(在模板基因的5’端)，以及引物的取向(F表示正向引物，R表示反向引物)。这些引物在图5中以沿着基因2-13的箭头表示。
表3本实施例采用的引物的序列名称 取向 位置 序列RM1A F -76 GAGC ACAT CAGAT CTAT TAAC(SEQ ID NO:3)RM2A R +454GGAG TGGC TCACA GTCG GTGG(SEQ ID NO:4)S2 F 400 TTGA ACTAT CGGC TGGG GCGG(SEQ ID NO:5)S5 F 1000TTAC TAGGG AAGCC GCTG GCA(SEQ ID NO:6)S7 F 1400TCAG AGATT ACGAT CGAA AAC(SEQ ID NO:7)S8 R 1280GGATT GTATC GTGTG AGAAAG(SEQ ID NO:8)S10 R 880 AATGC CGGAA GCAGC CCCTTC(SEQ ID NO:9)S13 R 280 CACGAC AGGAAG ATTTT GACT(SEQ ID NO:10)材料和方法确定引物为基础的重组1．制备待重组的基因。用Qiaprep试剂盒(Qiagen,chatsworth,CA)从转化的TG1细胞中纯化出含有待重组基因的质粒。用UV吸收对质粒定量并1∶1混合至最终浓度为50ng/ul。
2．交错延伸PCR和重装配。将100μl标准反应液(1.5mM MgCl2、50mMKCl、10mM Tris-HCl、pH9.0、0.1％Triton X-100、0.2mM dTNTP、0.25U Taq聚合酶(Promega,Madison,WI))中的4μl质粒混合物用作模板，反应液中还含有各12.5ng的8个引物。另外也进行不含引物的对照反应。通过100次94℃30秒、55℃15秒的热循环来进行反应。此时在琼脂糖凝胶上检查等份反应液，结果显示产物是较大的成片条带(无引物对照中没有可见的产物)。
3．模板的DpnⅠ消化。然后用DpnⅠ消化1μl装配反应液，以除去模板质粒。10μl DpnⅠ消化液含有1份NEBuffer 4和5U DpnⅠ(两者均购自New EnglandBiolabs,Beverly,MA)，它在37℃下培育45分钟，然后在10分钟下培育70℃以杀灭酶。
4．重装配产物的PCR扩增。将10μl消化液加入90μl标准PCR反应液(如步骤2所述)，反应液中含有0.4μM对基因末端有特异性的引物5b(ACTTA ATCTAGAGGG TATTA(SEQ ID NO:11))和3b(AGCCT CGCGG GATCC CCGGG(SEQ IDNO:12))。在标准PCR(94℃,30秒；48℃,30秒；72℃,1分钟)循环20次后，在琼脂糖凝胶上检查反应液时可见到大小正确(2kb)的明显条带，而在无引物对照的泳道中只看到有非常模糊的条带。纯化产物条带，通过电穿孔入TG1细胞来克隆回表达质粒pNB106R中并进行转化。
结果对从该转化获得的菌落进行4次96孔板测定，以测定pNB酯酶的初活性和热稳定性。约60％的克隆表现出有初活性和热稳定性，其中20％有亲代基因的数值。非常少(10％)的克隆是无活性的(小于亲代最初活性数值的10％)。这些结果表明诱变比例较低。对四个热稳定性数值最高的突变体进行测序。两个克隆(6E6和6H1)是亲代基因重组的结果(图5)。其余两个克隆中的一个含有新的点突变，而另一个与亲代5B12没有差别。突变体6E6中突变T99C和C204T的组合表明这两个位点间有重组发生。另外，突变体6H1缺少突变A1072G(但保留突变C1038T和T1310C)，这是两个重组行为的证据(一个为位点1028和1072间的重组，另一个为1072和1310间的重组)。在四个测序的基因中发现总共有5种新的点突变。
实施例4用内部确定引物和交错延伸来重组两种热稳定的枯草杆菌蛋白酶E变种本实施例证明了确定引物重组技术可生成含有亲代序列中突变的新组合的新序列。它还证明了采用确定引物重组技术可使酶性能(这里指热稳定性)得到进一步改进。本实施例还表明确定引物可使重组偏性，使得重组在引物确定的序列部分中(在引物内)更经常地出现。而且，本实施例表明通过采用含有所需突变的合适的确定引物序列，可将特定的突变引入重组序列中。
用内部引物通过确定引物重组过程来重组实施例1中编码两种热稳定枯草杆菌蛋白酶E变种(R1和R2)的基因。图6显示了用于从本实施例的模板基因R1和R2来生成重组子代基因的四种确定的内部引物。引物P50F含有1个突变(A变为T，碱基598处)，它消除了HindⅢ限制性位点，同时增加了新的独特的NheⅠ位点。该引物用来证明，通过特别设计确定引物，也可将特定突变引入重组序列群中。基因R2在该碱基位置也有突变(A变为G)，该突变消除了HindⅢ位点。因此，对从重组文库中取样出的随机克隆进行限制性酶切分析(用NheⅠ和HindⅢ进行切割)能表明重组效率和通过诱变引物引入特定突变的效率。对随机选取(未筛选)的克隆进行序列分析可进一步提供在确定引物为基础的重组中发生的重组和诱变行为的信息。
材料和方法确定引物为基础的重组进行图2中所描述的确定引物为基础的重组，并结合StEP。
1．待重组基因的制备。用NdeⅠ和BamHⅠ(各30U)50μl在1份缓冲液B(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)中在37℃下对约10ug含有R1和R2的质粒进行消化1小时。用QIAEXⅡ凝胶抽提试剂盒从0.8％制备型琼脂糖凝胶中纯化出约1kb的插入片段。将DNA插入片段溶解在10mM Tris-HCl(pH7.4)中。预测DNA浓度并以1∶1混合至浓度为50ng/ul。
2．交错延伸PCR和重装配。条件(最终体积为100ul)是将100ng插入片段作为模板，4种侧翼引物各50ng,1份Taq缓冲液，每种dNTP各0.2mM,1.5mMMgCl2和.25U Taq聚合酶。步骤是94℃下30秒和55℃下15秒循环7次，然后94℃下30秒、55℃下15秒和72℃下5秒循环10次(交错延伸)，然后94℃下30秒、55℃下15秒和72℃下1分钟循环53次(基因装配)。
3．模板的DpnⅠ消化。用单蒸馏水将1μl该反应液稀释至9.5μl，然后加入0.5μl DpnⅠ限制性酶消化DNA模板45分钟，再在70℃下培育10分钟，然后将该10μl用作10次循环PCR反应的模板。
4．重装配产物的PCR扩增。PCR条件为(最终体积为100μl)外侧引物P5N和P3B各30pmol,1份Taq缓冲液，每种dNTP各0.2mM，和2.5U Taq聚合酶。PCR步骤是94℃下30秒、55℃下30秒和72℃下1分钟循环10次。该过程产生了大小正确的一条带。纯化该产物并亚克隆入pBE3穿梭载体中。使该基因文库在大肠杆菌HB101中扩增并转移入枯草芽胞杆菌DB428感受态细胞中进行表达和筛选(如其它文献中所述(35))。在前述(33)的96孔板中测定酶变种的热稳定性。
DNA测序选出大肠杆菌HB101转化体以进行测序。用QIAprep自旋质粒少量制备试剂盒纯化基因，获得测序级的DNA。在ABI 373 DNA测序系统上用DyeTerminator Cycle Sequencing试剂盒(Perkin-elmer,Branchburg,NJ)进行测序。
结果1)限制性分析从重组文库中随机挑选出40个克隆，用限制性酶NheⅠ和BamHⅠ进行消化。在另一个实验中，用HindⅢ和BamHⅠ对同样的40个质粒进行消化。用凝胶电泳分析这些反应产物。如图7所示，40个克隆中有8个(约20％)含有新引入的NheⅠ限制性位点，这证明了诱变引物实际上能够将指定的突变引入基因片段群中。
2)DNA序列分析对首先10个随机挑选的克隆进行序列分析，其结果显示在图8中。10个基因中最少有6个已经历了重组。在这6个基因中，基因R1和R2件的最小交换事件(重组)在1-4之间。所有可见的交换发生在四个引物确定区域内。该区域外的突变很少有重组，这可从碱基484和520处的两个突变间没有重组的事实看出。这些结果表明，确定引物可使重组偏性，使得重组更经常地在引物确定的序列部分中(在引物内)出现。非常接近的突变也易保留在一起(例如碱基取代731和745以及碱基取代1141和1153总是成对保留)。然而，克隆7的序列显示，相隔近达33碱基的两个突变可以重组(碱基1107和1141)。
在该过程中10个基因中引入了23个新的点突变。差错比例0.23％对应于每个基因有2-3个新的点突变，该比例已经被认为是酶定向进化中生成突变体文库时的最优比例(15)。突变类型列在表4中。突变主要是碱基转换，这在基因中是均匀分布的。
表410个重组基因中鉴定出的新的点突变
总共对9860个碱基进行测序。突变比例为0.23％。
4)表型分析选出约450个枯草芽胞杆菌DB428克隆，使它们在96孔板上在补加有20ug/ml卡那霉素的SG培养基中生长。约56％的克隆表达出活性酶。从以前的实验我们可以得知，这样的灭活水平表明突变比例约为每个基因上有2-3个突变(35)。约5％的克隆表现出有类似双倍突变体(N181D+N218S)的表型(它低于随机重组单单主要由于点诱变而引起的25％预计值)。(DNA测序表明，10个随机挑选克隆中的两个克隆7和8均含有N218S和N181D突变)。
实施例6用随机引导重组的方法来优化犹他游动放线菌ECB脱酰酶在本实施例中，用该方法来从变性、线形、双链DNA(如凝胶电泳纯化获得的限制性片段；22)生成DNA短片段。使与摩尔过量引物混合的纯化DNA煮沸变性，然后用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段进行分析。该酶缺少5′到3’的外切核酸酶活性，因此，随机引导的产物仅仅是由引物延伸来合成的，而并没有被外切核酸酶降解。反应在pH6.6下进行，在该pH下酶的3’至5’外切核酸酶活性被大大降低(36)。这些条件有利于合成的随机引发。
过程包括下列步骤1．用合适的限制性内切核酸酶切割感兴趣的DNA，并通过凝胶电泳用Wizard PCR Prep试剂盒(Promega,Madison,WI)来纯化感兴趣的DNA片段。一个实例是，将犹他游动放线菌ECB脱酰酶基因断裂成2.4kb长的重组质粒pSHP100的XhoⅠ-Psh AⅠ片段。为了后续的变性步骤，必须使DNA线形化。通过凝胶电泳用Wizard PCR Prep试剂盒(Promega,Madison,WI)来纯化片段(图9，步骤(a))。为了从DNA中除去限制性内切核酸酶缓冲液，也必须进行凝胶纯化，因为Mg2+使得下步中DNA的变性很难。
2．使溶解在H2O中的400ng(约0.51pmol)双链DNA与2.75μg(约1.39nmol)的dp(N)6随机引物混合。在浸在沸水中3分钟后，立即将混合物放在冰/乙醇浴中。
随机引导产物的大小与引物的浓度成反比例函数(33)。认为高浓度引物的存在将导致空间位阻。在本文所述的反应条件下，随机引导产物的大小经通过碱性琼脂糖凝胶电泳测定约为200-400bp(图9步骤b)。
3．在变性的样品中加入10μl10倍反应浓度反应缓冲液(10倍反应浓度缓冲液900mM HEPES，pH6.6；0.1M氯化镁，10mM二硫苏糖醇和dATP、dCTP、dGTP和dTTP各5mM)，加入水使反应混合物的总体积为95μl。
4．加入10个单位(约5μl)的大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段。轻敲试管外部，使所有组分混合，然后在微型离心机中12000g下离心1-2秒，以使所有液体移动到管底部。反应在22℃下进行35分钟。
延伸速度由模板和四种核苷酸前体的浓度来确定。由于反应在使外切核苷酸消化程度最小的条件下进行，因此没有检测到新合成的产物有降解。
5．在22℃下35分钟后，在0℃冰上冷却样品来中止反应。在反应混合物中加入100μl冰冷的水。
6．使全部反应混合物先后通过Centricon-100(以除去模板和蛋白质)和Centricon-10滤膜(以除去引物和小于50碱基的片段)。Centricon滤膜购自Amicon Inc(Berverly,MA)。从Centricon-10滤膜上回收得到保留部分(体积约85μl)。该部分含有所需的随机引导产物(图9步骤c)，将其用于全部基因重装配。
全部基因的重装配通过下列步骤来实现1．对于PCR重装配，使5μg来自Centricon-10的随机引导DNA片段、20μl2倍反应浓度PCR预混物(5倍稀释的克隆的Pfu缓冲液，每种dNTP各0.5mM,0.1 U/ul克隆的Pfu聚合酶(Stratagene,La Jolla,CA))、8μl 30％(v/v)甘油和7μl水在冰上混合。由于用来重装配的随机引导DNA片段的浓度是最为重要的变量，因此建立不同浓度的各个独立的反应来确定较佳的浓度是有用的。
2．在96℃下培育6分钟后，进行40次热循环，每次循环为95℃下1.5分钟、55℃下1.0分钟和72℃下1.5分钟加上5秒/循环，最后一次循环的延伸步骤在72℃下进行10分钟，循环在DNA Engine PTC-200(MJ Research Inc.,Watertown,MA)装置中进行，不加入任何矿物油。
3．在循环20、30和40次时从反应混合物中取出3μl等份试样，用琼脂糖凝胶电泳进行分析。在循环40次的重装配PCR产物在大小较大和较小的成片条带中有正确大小的产物(参加图9，步骤d)。
使第一次PCR的正确重装配产物在含有与模板DNA末端互补的PCR引物的第二次PCR反应进行进一步扩增。扩增步骤如下1．用100μl标准PCR反应液中的2.0μl PCR重装配等份作为模板，PCR反应液中还含有各0.2mM的引物xhoF28(5’GGTAG AGCCA GTCTC GAGGGGGAGA TGC 3’)(SEQ ID NO:13)和引物pshR22(5’AGCCG GCGTG ACGTGGGTC AGC 3’)(SEQ ID NO:14)、1.5mM MgCl2、10mM Tris-HCl(pH9.0)、50mM KCl、四种dNTP各200μm、6％(v/v)甘油、2.5U Taq聚合酶(Promega,Madison,WI)和2.5U Pfu聚合酶(Stratagene,La Jolla,CA)。
2．在96℃下培育5分钟后，进行15次热循环，每次循环为95℃下1.5分钟、55℃下1.0分钟和72℃下1.5分钟，然后再附加15次热循环，每次为95℃下1.5分钟、55℃下1.0分钟和72℃下1.5分钟+5秒/循环，最后一次循环的延伸步骤在72℃下进行10分钟，循环在DNA Engine PTC-200(MJ ResearchInc.,Watertown,MA)装置中进行，不加入任何矿物油。
3．扩增生成大量PCR产物，其中有正确大小的ECB脱酰酶全长基因(图9，步骤e)。
克隆用以下步骤来扩增1．用XhoⅠ和Psh AⅠ限制性酶来消化ECB脱酰酶基因的PCR产物，并将其克隆入经修饰的pIJ702载体中。
2．将上述连接混合物转化入S.lividans TK23原生质体中，以形成突变体文库。
原位筛选ECB脱酰酶突变体用原位平板测定法以ECB为底物对上述获得的S.lividans TK23文库中的每个转化体进行筛选，以筛选出脱酰酶活性。使转化的原生质体在R2YE琼脂平板上在30℃培育24小时，并在硫链丝菌肽存在下再培育48-72小时使其发育，使其再生。当菌落长至合适大小时，将6ml 45℃纯化的琼脂糖(Sigma)溶液(溶液在0.1M乙酸钠缓冲液(pH5.5)中含有0.5mg/ml ECB)倾倒在每个R2YE-琼脂板上，使其在37℃下再发育18-24小时。被澄清区域包围的菌落比含有野生型重组质粒pSHP150-2的菌落大，这表明由于酶性能的改进或酶表达和分泌水平的改进而使ECB水解更有效，将该菌落选为潜在正性突变体。然后挑取这些菌落以进行随后的保藏和操作。
ECB脱酰酶突变体的HPLC测定将单个正性转化体接种入含有5μg/ml硫链丝菌肽的20ml发酵培养基中，并使其在30℃下生长48小时。在这一步骤时，用HPLC以ECB为底物对所有的培养物进行测定。在0.1M NaAc(pH5.5)、10％(v/v)MeOH和200μg/mIECB底物存在下，使100μl完全肉汤在30℃下进行HPLC反应30分钟。将每一反应混合物20μl装在PolyLC聚羟乙基天冬酰胺柱(4.6×100mm)上，以2.2ml/min的流速用乙腈梯度洗脱。在225nm下检测ECB-母核活性。
ECB脱酰酶突变体的纯化在HPLC测定后，将2.0ml含所有潜在正性突变体的预培养物接种入50ml发酵培养基中，使其在30℃、280rpm下生长96小时。然后使这些50ml培养物在7000g下离心10分钟。再使上清液在16000g下离心20分钟。将含有ECB脱酰酶突变体酶的上清液保藏在-20℃下。
用Amicon过滤单元以10kD的截断分子量将正性突变体的上清液进一步浓缩至原始体积的1/30。用等体积的50mM KH2PO4(pH6.0)缓冲液稀释获得的酶样品，将其中1.0ml加样到Hi-Trap离子交换柱上。结合缓冲液是50mMKH2PO4(pH6.0)，洗脱缓冲液是50mM KH2PO4和1.0M NaCl。采用0-1.0M的NaCl线性梯度洗脱至8倍柱体积，流速为2.7ml/min。ECB脱酰酶突变体级分在0.3MNaCl处洗脱，将该级分浓缩并在Amicon Centricon-10单元中缓冲液更换到50mMKH2PO4(pH6.0)中。用SDS-PAGE鉴定酶的纯度，用Bio-Rad蛋白质分析法来测定浓度。
ECB脱酰酶突变体的比活测定将每一经纯化的ECB脱酰酶突变体4.0μg用于活性测定，活性测定在0.1MNaAc(pH5.5)、10％(v/v)MeOH和200μg/ml ECB底物存在下在30℃下进行0-60分钟。将每一反应混合物20μl上样在PolyLC聚羟乙基天冬酰胺柱(4.6×100mm)上，以2.2ml/min的流速用乙腈梯度洗脱。在225nm下检测反应产物活性并记录在IBM PC数据获取系统中。对ECB细胞核峰值进行数值积分并用来计算每一突变体的比活。
如图10所示，在仅对野生型ECB脱酰酶基因采用一次随机引导为基的技术后，发现2012个原始转化体中有一个突变体(M16)具有野生型酶的2.4倍比活。图11显示了M16的活性在较宽的pH范围内比野生型酶的活性有所提高。
实施例7用随机序列引物重组方法来改进枯草芽胞杆菌枯草杆菌蛋白酶E.的热稳定性本实施例证明了各种DNA聚合酶在引物为基础的重组中的应用。它还证明了通过重组可使枯草杆菌蛋白酶E稳定。
选择实施例1中所述的编码两种热稳定枯草杆菌蛋白酶E变种的基因R1和R2作为重组的模板。
(1)靶基因的制备对枯草杆菌蛋白酶E热稳定突变基因R1和R2(图11)进行随机引导DNA合成。通过用BamHⅠ和NdeⅠ对质粒pBE3进行双酶消化，然后用Wizard PCR Prep试剂盒(Promega,Madison,WI)从0.8％琼脂糖凝胶中纯化出986个碱基的片段，该片段包括前导序列的45个核苷酸、整个成熟序列和终止密码子后的113个核苷酸。为了后续的变性步骤，必须使DNA线形化。凝胶纯化也是必须的，以从DNA中除去限制性内切核酸酶缓冲液，因为Mg2+离子会使下步的DNA变性很困难。
(2)随机引导DNA合成采用随机引导DNA合成方法来从变性的线形双链DNA生成DNA短片段。通过沸腾使与摩尔过量的引物混合的经纯化枯草芽胞杆菌枯草杆菌蛋白酶E突变体基因变性，然后采用下列聚合酶中的一种来进行合成大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段，噬菌体T4 DNA聚合酶和T7测序酶2.0版DNA聚合酶。
在噬菌体T4 DNA聚合酶性能最优的条件下，它的合成结果与Klenow片段相同。在采用T7测序酶2.0版DNA聚合酶时(31、32)，合成的DNA片段长度通常较长。合成中必须有一定量的MnCl2，以控制合成片段的长度在50-400碱基内。
新生DNA短片段也可采用Taq DNA聚合酶的Stoffel片段或Pfu DNA聚合酶通过PCR来产生。一个重要的考虑因素是用常规实验来确定可保证随机短引物退火到模板上并能在较高温度下提供足量DNA扩增物的反应条件。我们已经发现，短达dp(N)12的随机引物可与PCR一同使用来生成片段。
2.1用Klenow片段随机引导DNA合成大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段缺少5’到3’的外切核酸酶活性，因此，随机引导的产物仅仅是由引物延伸来合成的，而并没有被外切核酸酶降解。反应在pH6.6下进行，在该pH下酶的3’至5’外切核酸酶活性被大大降低(36)。这些条件有利于合成的随机引发。
1．使溶解在水中的200ng(约0.7pmol)R1 DNA和等量的R2 DNA与13.25μg(约6.7nmol)dp(N)6随机引物混合。在浸在沸水中5分钟后，立即将混合物放在冰/乙醇浴中。
随机引导产物的大小与引物的浓度成反比例函数(30)。认为高浓度引物的存在将导致空间位阻。在本文所述的反应条件下，随机引导产物的大小经琼脂糖凝胶电泳测定约为50-500bp。
2．在变性样品中加入10μl10倍反应浓度反应缓冲液(10倍反应浓度缓冲液900mM HEPES,pH6.6；0.1M氯化镁，20mM二硫苏糖醇和dATP、dCTP、dGTP和dTTP各5mM)，加入水使反应混合物的总体积为95μl。
3．加入10个单位(约5μl)的大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)。轻敲试管外部，使所有组分混合，然后在微型离心机中12000g下离心1-2秒，以使所有液体移动到管底部。反应在22℃下进行3小时。
延伸速度由模板和四种核苷酸前体的浓度来确定。由于反应在使外切核苷酸消化程度最小的条件下进行，因此没有检测到有新合成的产物被降解。
4．在22℃下3小时后，在0℃冰上冷却样品来中止反应。在反应混合物中加入100μl冰冷的水。
5．使全部反应混合物先后通过Microcon-100(Amicon,Beverly MA)(以除去模板和蛋白质)和Microcon-10滤膜(以除去引物和小于40碱基的片段)来纯化随机引导的产物。从Microcon-10滤膜上回收得到保留部分(体积约65μl)。该部分含有所需的随机引导产物，通过新的Microcon-10滤膜用PCR反应缓冲液对该部分进行缓冲离子交换以用于全部基因重装配。
2.2用噬菌体T4 DNA聚合酶随机引导DNA合成噬菌体T4 DNA聚合酶和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段一样具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切核酸酶活性。噬菌体T4 DNA聚合酶的外切核酸酶活性比Klenow片段高出200倍。由于它不会从单链DNA模板上取代寡核苷酸短引物(23)，因此诱变效率与Klenow片段不同。
1．使溶解在水中的200ng(约0.7 pmol)R1 DNA和等量的R2 DNA与13.25μg(约6.7nmol)dp(N)6随机引物混合。在浸在沸水中5分钟后，立即将混合物放在冰/乙醇浴中。认为高浓度引物的存在将导致空间位阻。
2．在变性样品中加入10μl10倍反应浓度反应缓冲液(10倍反应浓度缓冲液500mM Tris-HCl,pH8.8；150mM(NH4)2SO4；70mM氯化镁，100mM 2-巯基乙醇，0.2mg/ml牛血清白蛋白和dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2mM)，加入水使反应混合物的总体积为90μl。
3．加入10个单位(约10μl)的T4 DNA聚合酶Ⅰ(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)。轻敲试管外部，使所有组分混合，然后在微型离心机中12000g下离心1-2秒，以使所有液体移动到管底部。反应在37℃下进行30分钟。在这里所述的反应条件下，随机引导产物的大小约为50-500碱基。
4．在37℃下30分钟后，在0℃冰上冷却样品来中止反应。在反应混合物中加入100μl冰冷的水。
5．使全部反应混合物先后通过Microcon-100(以除去模板和蛋白质)和Microcon-10滤膜(以除去引物和小于40碱基的片段)来纯化随机引导的产物。从Microcon-10滤膜上回收得到保留部分(体积约65μl)。该部分含有所需的随机引导产物，通过新的Microcon-10滤膜用PCR反应缓冲液对该部分进行缓冲离子交换以用于全部基因重装配。
2.3用T7测序酶2.0版DNA聚合酶来随机引导DNA合成由于T7测序酶2.0版DNA聚合酶缺少外切核酸酶活性并有高度持续合成能力，因此其合成的DNA的平均长度大于Klenow片段或T4 DNA聚合酶合成的DNA长度。但是当反应中存在合适量的MnCl2时，可将合成片段的大小控制在小于400碱基。
1．使溶解在水中的200ng(约0.7pmol)R1 DNA和等量的R2 DNA与13.25μg(约6.7nmol)dp(N)6随机引物混合。在浸在沸水中5分钟后，立即将混合物放在冰/乙醇浴中。认为高浓度引物的存在将导致空间位阻。
2．在变性样品中加入10μl10倍反应浓度反应缓冲液(10倍反应浓度缓冲液400mM Tris-HCl,pH7.5；200mM氯化镁，500mM NaCl,3mM MnCl2，和dATP、dCTP、dGTP和dTTP各3mM)，加入水使反应混合物的总体积为99.2μl。
3．加入10个单位(约0.8μl)的T7测序酶2.0版(Amersham Life Science,cleveland,Ohio)。轻敲试管外部，使所有组分混合，然后在微型离心机中12000g下离心1-2秒，以使所有液体移动到管底部。反应在22℃下进行15分钟。在这里所述的反应条件下，随机引导产物的大小约为50-400碱基。
4．在22℃下15分钟后，在0℃冰上冷却样品来中止反应。在反应混合物中加入1001μl冰冷的水。
5．使全部反应混合物先后通过Microcon-100(以除去模板和蛋白质)和Microcon-10滤膜(以除去引物和小于40碱基的片段)来纯化随机引导的产物。从Microcon-10滤膜上回收得到保留部分(体积约65μl)。该部分含有所需的随机引导产物，通过新的Microcon-10滤膜用PCR反应缓冲液对该部分进行缓冲离子交换以用于全部基因重装配。
2.4用Taq DNA聚合酶的Stoffel片段通过PCR来随机引导DNA合成与大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段一样，Taq DNA聚合酶的Stoffel片段业没有5’到3’的外切核酸酶活性。而且它比Taq DNA聚合酶更加热稳定。Stoffel片段的持续合成能力较差，在其解离前它只能使引物延伸平均5-10个核苷酸。由于它的持续合成能力较低，因此它也可以有改进的忠实性。
1．将溶解在水中的50ng(约0.175pmol)R1 DNA和等量的R2 DNA与6.13μg(约1.7nmol)dp(N)12随机引物混合。
2．加入10μl10倍反应浓度反应预混物(10倍反应浓度预混物100mMTris-HCl,pH8.3；30mM氯化镁，100mM KCl，和dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2mM)，加入水使反应混合物的总体积为99.0μl。
3．在96℃下培育5分钟后，加入2.5个单位(约1.0μl)Taq DNA聚合酶的Stoffel片段(Perkin-Elmer Corp.,Norwalk,CT)。在DNA Engine PTC-200(MJResearch Inc.,Watertown,MA)装置上进行35次热循环，每次循环为95℃下60秒，55℃下60秒和72℃下50秒，最后一次循环不进行延伸步骤。在这里所述的反应条件下，随机引导产物的大小约为50-500碱基。
4．在0℃冰上冷却样品来中止反应。在反应混合物中加入100μl冰冷的水。
5．使全部反应混合物先后通过Microcon-100(以除去模板和蛋白质)和Microcon-10滤膜(以除去引物和小于40碱基的片段)来纯化随机引导的产物。从Microcon-10滤膜上回收得到保留部分(体积约65μl)。该部分含有所需的随机引导产物，通过新的Microcon-10滤膜用PCR反应缓冲液对该部分进行缓冲离子交换以用于全部基因重装配。
2.5用Pfu DNA聚合酶随机引导DNA合成Pfu DNA是非常热稳定的，该酶具有3’至5’的外切核酸酶活性，但没有5’到3’的外切核酸酶活性。预计它的碱基替换忠实性为2×10-6。
1．将溶解在水中的50ng(约0.175pmol)R1 DNA和等量的R2 DNA与6.13mg(约1.7nmol)dp(N)12随机引物混合。
2．加入50μl 2倍反应浓度反应预混物(2倍反应浓度反应预混物稀释5倍的克隆的pfu缓冲液(Stratagene,La Jolla,CA)，每种dNTP各0.4mM)，加入水使反应混合物的总体积为99.0μl。
3．在96℃下培育5分钟后，加入2.5个单位(约1.0μl)Pfu DNA聚合酶(Stratagene,La Jolla,CA)。在DNA Engine PTC-200(MJ Research Inc.,Watertown,MA)装置上进行35次热循环，每次循环为95℃下60秒，55℃下60秒和72℃下50秒，最后一次循环不进行延伸步骤。在这里所述的反应条件下，主要的随机引导产物的大小约为50-500碱基。
4．在0℃冰上冷却样品来中止反应。在反应混合物中加入100μl冰冷的水。
5．使全部反应混合物先后通过Microcon-100(以除去模板和蛋白质)和Microcon-10滤膜(以除去引物和小于40碱基的片段)来纯化随机引导的产物。从Microcon-10滤膜上回收得到保留部分(体积约65μl)。该部分含有所需的随机引导产物，通过新的Microcon-10滤膜用PCR反应缓冲液对该部分进行缓冲离子交换以用于全部基因重装配。
(3)全部基因的重装配1．对于PCR重装配，使10μl来自Microcon-10的随机引导DNA片段、20μl2倍反应浓度PCR预混物(5倍稀释的克隆的Pfu缓冲液，每种dNTP各0.5mM，0.1 U/ul克隆的Pfu聚合酶(Stratagene,La Jolla,CA))、15μl水在冰上混合。
2．在96℃下培育3分钟后，进行40次热循环，每次循环为95℃下1.0分钟、55℃下1.0分钟和72℃下1.0分钟+5秒/循环，最后一次循环的延伸步骤在72℃下进行10分钟，循环在DNA Engine PTC-200(MJ Research Inc.,Watertown,MA)装置中进行，不加入任何矿物油。
3．在循环20、30和40次时从反应混合物中取出3μl等份试样，用琼脂糖凝胶电泳进行分析。在循环40次的重装配PCR产物在较大和较小的成片条带中有正确大小的产物。
(4)扩增使第一次PCR的正确重装配产物在含有与模板DNA末端互补的PCR引物的第二次PCR反应中进行进一步扩增。
1．用100μl标准PCR反应液中的2.0μl PCR重装配等份作为模板，PCR反应液中还含有各0.3mM的引物Pl(5’CCGAG CGTTGC ATATGT GGAAG3’)(SEQ ID NO:15)和引物P2(5’CGACT CTGAG GGATC CGATTC 3’)(SEQ IDNO:16)、1.5mM MgCl2、10mM Tris-HCl(pH9.0)、50mM KCl、四种dNTP各200μm、2.5U Taq聚合酶(Promega,Madison,WI,USA)和2.5U Pfu聚合酶(Stratagene,La Jolla,CA)。
2．在96℃下培育3分钟后，进行15次热循环，每次循环为95℃下60秒、55℃下60秒和72℃下50秒，然后再附加15次热循环，每次为95℃下60秒、55℃下60秒和72℃下50秒+5秒/循环，最后一次循环的延伸步骤在72℃下进行10分钟，循环在DNA Engine PTC-200(MJ Research Inc.,Watertown,MA)装置中进行，不加入任何矿物油。
3．扩增生成大量PCR产物，其中有正确大小的枯草杆菌蛋白酶E全部基因。
(5)克隆由于DNA短片段是由5种不同的DNA聚合酶生成的，因此有5个最终PCR扩增的重装配产物库。每个DNA库均用来构建相应的枯草杆菌蛋白酶E突变体文库。
1．用Wizard DNA-CleanUp试剂盒(Promega,Madison,WI)对PCR扩增的重装配产物进行纯化，用BamHⅠ和NdeⅠ消化，并在0.8％琼脂糖凝胶上走电泳。将986碱基的产物从凝胶上切下，并用Wizard PCR Prep试剂盒(Promega,Madison,WI)进行纯化。将产物连接入pBE3穿梭载体通过Bam HⅠ-NdeⅠ消化产生的载体中。
2．将上述连接混合物转化入大肠杆菌HB101感受态细胞中形成突变体文库。该文库中集中有约4000个转化体，从该库中分离出重组质粒混合物。
3．将上述分离出的质粒混合物转化入枯草芽胞杆菌DB428感受态细胞中，形成另一枯草杆菌蛋白酶E变种的文库。
4．根据随机引导生成新生DNA短片段的DNA聚合酶，这里构建成的5个文库分别成为Klenow文库、T4文库、Sequenase文库、Stoffel文库和Pfu文库。在每个文库中随机挑取约400个转化体，进行热稳定性筛选(见步骤7)。
(6)随机克隆测序从枯草芽胞杆菌DB428Klenow文库中选出10个随机克隆进行DNA测序。用QIAprep自旋质粒少量制备试剂盒(QIAGEN)(P1缓冲液中加入2mg/ml溶菌酶)从枯草芽胞杆菌DB428中分别纯化获得重组体质粒，使细胞在37℃下培育5分钟，再次转化入感受态大肠杆菌HB101中，并再次用QlAprep自旋质粒少量制备试剂盒获得测序级DNA。在ABI 373 DNA测序系统上用Dye Terminator CycleSequencing试剂盒(Perkin-elmer,Norwalk,CT)进行测序。
(7)筛选热稳定性对来自步骤(4)所述的5个文库的约400个转化体进行筛选。筛选根据前述测定方法进行(33,35)，采用琥珀酰基-Ala-Ala-Pro-Phe-对-硝基酰苯胺(SEQ IDNO:25)作为底物。使含有质粒文库的枯草芽胞杆菌DB428在LB/卡那霉素(20μg/ml)平板上生长。在37℃下18小时后，将单菌落挑入96孔板中(每个孔内含有100μl SG/卡那霉素培养基)。振荡这些板，在37℃下培育24小时以使细胞长至饱和。将细胞刮下，取上清液样品进行热稳定性测定。对于每一生长平板，重复三组平行的96孔板测定，每个孔中含有10ml上清液。然后加入100ml活性测定溶液(0.2mM琥珀酰基-Ala-Ala-Pro-Phe-对-硝基酰苯胺(SEQ ID NO:25)、100mM Tris-HCl、10mM CaCl2、pH8.0、37℃)测定枯草杆菌蛋白酶活性。在ThermoMax微型板读数器(Molecular Devices,Sunnyvale CA)中405nm下1.0分钟内测定反应速度。用室温下测得的活性来计算活性克隆的部分(活性低于野生型的10％的克隆计为无活性)。在将100μl预先温热(37℃)的测定溶液(0.2mM琥珀酰基-Ala-Ala-Pro-Phe-对-硝基酰苯胺(SEQ ID NO:25)、100mM Tris-HCl、pH8.0、10mM CaCl2)加入每个孔中后立即使测定平板在65℃下培育10分钟，以测定初活性(Ai)。在培育40分钟后测定残余活性(Ar)。
(8)序列分析在筛选后，重新将Klenow文库的400个转化体中的热稳定性最高的克隆划线到LB/卡那霉素琼脂糖平板上，并将从该板获得的单个菌落接种入试管培养物中，用来甘油储存和质粒制备。重组体用QIAprep自旋质粒微量制备试剂盒(QIAGEN)进行纯化，只是采用P1缓冲液中加入2mg/ml溶菌酶的改进方案，使细胞在37℃下培育5分钟，转化入感受态大肠杆菌HB101，并再次用QlAprep自旋质粒微量制备试剂盒纯化，以获得测序级DNA。测序在ABI 373 DNA测序系统上用Dye Terminator Cycle Sequencing试剂盒(Perkin-elmer,Branchburg,NJ)进行。
结果1．随机序列重组的重组频率和效率如上所述进行随机引导方法。该方法在图1中有所描述。从突变体Klenow文库中随机选出10个克隆，并进行测序。如图12和表5中所归纳的，所有的克隆于亲代基因不同。重组基因中来自亲代R1或R2的特定点突变发生频率在40％-70％间(在预定值50％周围波动)。这表明用随机引物技术，两亲代基因几乎是随机重组的。图12也表明所有的10个突变可被重组或剖分，即使是那些只相隔12个碱基的突变。
然后，我们通过对步骤(5)构建的5个文库的每一个中400个随机的克隆进行分析来测定枯草杆菌蛋白酶在65℃下的热灭活。图13中按照下降的次序显示了一个96孔板获得的热稳定性。约有21％的克隆表现出与有N181D和N218S双突变的突变体相当的热稳定性。这表明，来自RC2的N181D突变和来自RC1的N218S突变被随机重组。对Klenow文库中筛选的400个转化体中热稳定性最高的克隆进行序列分析，结果显示突变N181D和N218S均存在。
2．在随机引导过程中新引入突变的频率从5个枯草芽胞杆菌DB428文库(见步骤(5))的每个文库中挑取约400个转化体，使它们在96孔板中补充有20μg/ml卡那霉素的SG培养基中生长，并对枯草杆菌蛋白酶E活性进行筛选。约77-84％的克隆表达出活性酶，而16-23％的转化体被灭活，估计这是由于引入新突变的结果。从前述实验我们可以指导，这一灭活比例表明突变比例约为每个基因1-2个突变(35)。
如图12所示，在该过程中引入18个新的点突变。差错比例0.18％与每个基因有1-2个新的点突变对应，该比例可从灭活曲线测得。突变几乎是沿基因随机分布的。
表5在Klenow文库的10个随机的克隆中DNA和氨基酸残基的取代
突变类型列在表5中。很明显突变方向并不是随机的。例如，A变成G比变成T或C更经常。所有转换，尤其是T-C和A-G，比颠换更经常发生。一些核苷酸比其它核苷酸更易变。在10个测序克隆中发现有一次G→C、一次C→G和一次C→A颠换。在枯草杆菌蛋白酶的易错PCR诱变中这些突变的产生很少(37)。随机引导方法可以获得比PCR为基的点诱变更广的氨基酸取代。
值得注意的是，在随机克隆C#6中亲代R1和R2中646-667位置处的短序列(5′C GGT ACG CAT GTA GCC GGT ACG 3′(SEQ ID NO:16))变成5′C GGT ACGATT GCC GCC GGT ACG 3′(SEQ ID NO:17)。由于该短序列在两端均有两段短的重复序列，因此新引入的突变可能是由于滑动链(splipped-strand)的错配而不是仅仅由于点突变造成的。由于没有读框移位，因此这类滑动可用于结构域转换。
3．随机引导过程中不同DNA聚合物忠实性的比较。
在随机引导重组中，同源DNA序列几乎是随机重组的，并也会引入新的点突变。尽管这些点突变可为一些体外进化应用提供有用的多样性，但它们是已经鉴定的有利突变的悬而未决的重组，尤其当突变比例如此高时。在随机引导过程中控制差错比例对于用该技术来成功解决体外进化问题是非常重要的。通过选择不同的DNA聚合酶和改变反应条件，就可调节随机引导分子繁殖技术来生成差错比例不同的突变体文库。
对大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段、噬菌体T4 DNA聚合酶、T7测序酶2.0版DNA聚合酶、Taq聚合酶Stoffel片段、Pfu聚合酶进行新生DNA片段合成测试。获得的5个群体(见步骤(5))的活性曲线显示在图13中。为了获得这些曲线，以下降的次序对96孔板筛选测定方法中测得的单个克隆的活性进行绘图。Stoffel文库和Klenow文库中含有的野生型或灭活枯草杆菌蛋白酶E克隆比Pfu文库中的多。在所有5个群体中，野生型和灭活克隆的比例为17-30％。
实施例8用确定侧翼引物和交错延伸来重组单链DNA本实施例表述了确定引物重组方法和交错延伸在单链DNA重组中的应用。
方法描述单链DNA可用各种方法制得，最简便地是用辅助噬菌体从质粒制得。目前采用许多载体是从丝状噬菌体衍生获得的，如M13mp衍生体。在将这些载体转化入细胞中后，它们可生成新的双链环和从载体双链中的一条链衍生获得的单链环。单链环可被包装入噬菌体颗粒中，从细胞中分泌出，并很容易从培养物上清液中纯化获得。
这里可用两个确定的引物(例如与模板的5′和3′端杂交的引物)来重组单链基因。在最终PCR扩增前只需要一个引物。首先通过交错延伸方法(StEP)来生成延伸重组引物，其中交错延伸包括重复循环进行的变性随后极短退火/延伸步骤。然后通过DNA聚合酶存在下的热循环辅助同源基因装配，将延伸的片段重装配成全长基因，然后再进行基因扩增。
交错延伸过程通过在引物延伸的不同时间点处从反应试管(初始体积为100μl)中取出等份(10μl)然后用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段来监测的。从过程早期的低分子量“成片条带”随循环次数增加而分子量增加的现象可以看出，引物延伸是有效的。初始反应条件设定为使模板变性(例如94℃下变性30秒)，然后简短退火/延伸(如55℃下1-15秒)，在反应物取样前如此逐渐重复5-20次循环。通常，需要20-200次循环的交错延伸来生成大小大于全部基因长度的单链DNA“成片条带”。
实验设计如实施例1所述。通过EcoRⅠ和BamHⅠ的限制性消化将两种热稳定的枯草杆菌蛋白酶E突变体R1和R2亚克隆入载体M13mp18中。如前所述(39)制备单链DNA。
以两个侧翼引物为基础的重组将两个确定引物(分别对应于5′和3′侧翼引物)，P5N(5′-CCGAG CGTTGCATAT GTGGA AG-3′(SEQ ID NO:18)，有下划线的序列是NdeⅠ限制性位点)和P3B(5′-CGACT CTAGA GGATC CGATT C-3′(SEQ ID NO:19)，有下划线的序列是BamHⅠ限制性位点)用于重组。条件(100μl最终体积)是将0.15pmol含有基因R1和R2(1∶1混合)的单链DNA用作模板，每种侧翼引物(P5N或P3B)各15pmol，1份Taq缓冲液，每种dNTP各0.2mM,1.5mM MgCl2和0.25U Taq聚合酶。步骤是95℃下5分钟，循环80-200次的94℃30秒、55℃5秒。在电泳后将有正确大小(约1kb)的产物从0.8％琼脂糖凝胶上切下，并用QIAEXⅡ凝胶抽提试剂盒纯化。对该纯化后的产物进行常规PCR扩增。条件(最终体积为100ul)是取1-10ng作为模板，每种侧翼引物各30pmol,1份Taq缓冲液，每种dNTP各0.2mM,1.5mMMgCl2和0.25U Taq聚合酶。步骤是95℃下5分钟，循环20次94℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟。纯化PCR产物，用NdeⅠ和BamHⅠ消化，并亚克隆入pBE3改组基因中。使该基因文库在大肠杆菌HB101中扩增，并转移入枯草芽胞杆菌DB428感受态细胞中进行表达和筛选(如其它文献中所述(35))。如前所述(33)在96孔板形式中测定酶变种的热稳定性。
该过程导致新序列的产生，该序列含有来自亲代序列的突变和新的点突变的新组合。筛选能够鉴定比亲代酶更具热稳定性的酶变种(如实施例1所述)。
从上述实施例可以明显看出，引物为基础的重组方法可用来发掘广泛应用中大量潜在有用的催化剂的最优性能，并能开发或演变出新的酶以用于基础结构-功能的研究。
尽管本发明说明书描述了采用DNA依赖型DNA聚合酶和单链DNA作为模板，但是采用单链RNA作为模板的变化方案也是可行的。通过采用特定蛋白质的mRNA作为模板，RNA依赖型RNA聚合酶(逆转录酶)作为催化剂，本文描述的方法也可改为用来将突变和交换引入cDNA克隆，并直接在mRNA水平上形成分子多样性，以实现蛋白质功能的优化。这将大大简化用来发现新催化剂的ETS方法(表达标记策略)。
除了上述外，本发明也可用来探测来自专性胞内病原体或感兴趣的细胞不能增殖的其它系统中的蛋白质。
通过本发明典型例的描述，本领域技术人员应当注意，所公开的内容只是典型的，而在本发明范围内可作其它各种变化、适合和改动。因此本发明的范围不局限于这里所述的特定例子，而只是有下列权利要求来确定。
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序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人Frances H.ArnoldZhixin ShaoJosph A.AffholterHuimin ZhaoLori Giver(ⅱ)发明名称用随机或确定的引物来重组多核苷酸序列(ⅲ)序列数目25(ⅳ)通信地址(A)收信人Oppenheimer Poms Smith(B)街道2029 Century Park East,Suite 3800(C)城市Los Angeles(D)州CA(E)国家USA(F)邮编90067(ⅴ)计算机可读形式(A)记录介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容型(C)操作系统WINDOWS(D)软件Microsoft Word 6.0(ⅵ)本申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类
(ⅶ)在先申请资料(A)申请号60/041,666(B)申请日1997年3月25日(C)申请号60/045,211(D)申请日1997年4月30日(E)申请号60/046,256(F)申请日1997年5月12日(ⅷ)律师/代理人信息(A)姓名Oldenkamp,David J.
(B)登记号29,421(C)参考/案卷号330187-84(ⅸ)通讯信息(A)电话(310)788-5000(B)电传(310)277-1297(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度22核苷酸(B)类型核苷酸(C)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:CCG AGC GTT GCA TAT GTG GAA G 22(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度21核苷酸
(B)类型核苷酸(C)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:CGA CTC TAG AGG ATC CGA TT C21(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度21核苷酸(B)类型核苷酸(C)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:GAG CAC ATC AGA TCT ATT AAC 21(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度21核苷酸(B)类型核苷酸(C)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:GGA GTG GCT CAC AGT CGG TGG 21(2)SEQ ID NO:5的信息
(ⅰ)序列特征(A)长度21核苷酸(B)类型核苷酸(C)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:TTG AAC TAT CGG CTG GGG CGG 21(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度21核苷酸(B)类型核苷酸(C)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:TTA CTA GGG AAG CCG CTG GCA 21(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度21核苷酸(B)类型核苷酸(C)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:TCA GAG ATT ACG ATC GAA AAC 21(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)长度21核苷酸(B)类型核苷酸(C)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:GGA TTG TAT CGT GTG AGA AAG 21(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)长度21核苷酸(B)类型核苷酸(C)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:AAT GCC GGA AGC AGC CCC TTC 21(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)长度21核苷酸(B)类型核苷酸(C)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:CAC GAC AGG AAG ATT TTG ACT 21(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20核苷酸(B)类型核苷酸(C)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:ACT TAA TCT AGA GGG TAT TA 20(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20核苷酸(B)类型核苷酸(C)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:AGC CTC GCG GGA TCC CCG GG 20(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征(A)长度28核苷酸(B)类型核苷酸(C)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:GGT AGA GCG AGT CTC GAG GGG GAG ATG C 28(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)长度22核苷酸(B)类型核苷酸(C)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:AGC CGG CGT GAC GTG GGT CAG C 22(2)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特征(A)长度22核苷酸(B)类型核苷酸(C)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:CCG AGC GTT GCA TAT GTG GAA G 22(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)长度21核苷酸(B)类型核苷酸(C)拓扑结构线性
(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:CGA CTC TAG AGG ATC CGA TTC 21(2)SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)序列特征(A)长度22核苷酸(B)类型核苷酸(C)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:CGG TAC GCA TGT AGC CGG TAG G 22(2)SEQ ID NO:1 8的信息(ⅰ)序列特征(A)长度22核苷酸(B)类型核苷酸(C)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:CGG TAC GAT TGC CGC CGG TAC G 22(2)SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)序列特征(A)长度22核苷酸(B)类型核苷酸(C)拓扑结构线性
(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19:CCG AGC GTT GCA TAT GTG GAA G22(2)SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)序列特征(A)长度21核苷酸(B)类型核苷酸(C)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20:CGA CTC TAG AGG ATC CGA TTC 21(2)SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)序列特征(A)长度18核苷酸(B)类型核苷酸(C)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21:GGC GGA GCT AGC TTC GTA 18(2)SEQ ID NO:22的信息(ⅰ)序列特征(A)长度18核苷酸(B)类型核苷酸
(C)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:22:GAT GTG ATG GCT CCT GGC 18(2)SEQ ID NO:23的信息(ⅰ)序列特征(A)长度18核苷酸(B)类型核苷酸(C)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:23:CGA AAC ACC GAT TGA GTT 18(2)SEQ ID NO:24的信息(ⅰ)序列特征(A)长度18核苷酸(B)类型核苷酸(C)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:AGT GCT TTC TAA ACG ATC 18(2)SEQ ID NO:25的信息(ⅰ)序列特征(A)长度4氨基酸
(B)类型肽(C)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:25:Ala Ala Pro Phe
权利要求
1．一种从至少一个模板多核苷酸制备诱变的双链多核苷酸的方法，其中所述诱变的多核苷酸中至少含有一个核苷酸与所述模板多核苷酸相同位置处的核苷酸不同，所述方法包括a)在所述模板多核苷酸存在下用随机序列或确定序列引物来进行酶催化的DNA聚合合成，以生成包含多核苷酸短片段和所述模板多核苷酸的DNA库；b)将所述DNA库变性成单链片段库；c)在退火条件下使所述单链片段退火，以生成退火片段库；d)使所述退火片段库与聚合酶在使得所述双链片段延伸的条件下培育，以生成含有延伸的单链片段的片段库；e)重复步骤b)至d)，直至所述片段库含有所述诱变的多核苷酸。
2．根据权利要求1所述的制备诱变的双链多核苷酸的方法，其中所述单链片段有互补区，其中所述退火片段库的所述培育步骤是在一定条件下进行的，该条件下所述退火片段中的每个多核苷酸短链或延伸的多核苷酸短链相互引导形成所述片段库。
3．根据权利要求1所述的制备诱变的双链多核苷酸的方法，其中所述退火片段库的所述培育步骤在所述模板多核苷酸存在下进行，以随机引导所述单链多核苷酸和所述模板多核苷酸。
4．根据权利要求1所述的制备诱变的双链多核苷酸的方法，其中所述引物中至少有一个是有确定序列的引物。
5．根据权利要求2所述的制备诱变的双链多核苷酸的方法，其中所述引物中至少有一个是有确定序列的引物。
6．根据权利要求3所述的制备诱变的双链多核苷酸的方法，其中所述引物中至少有一个是有确定序列的引物。
7．根据权利要求4所述的制备诱变的双链多核苷酸的方法，其中所述引物含有6-100个核苷酸。
8．根据权利要求5所述的制备诱变的双链多核苷酸的方法，其中所述引物含有6-100个核苷酸。
9．根据权利要求6所述的制备诱变的双链多核苷酸的方法，其中所述引物含有6-100个核苷酸。
10．根据权利要求4所述的制备诱变的双链多核苷酸的方法，其中采用至少一个确定的末端引物。
11．根据权利要求5所述的制备诱变的双链多核苷酸的方法，其中采用至少一个确定的末端引物。
12．根据权利要求6所述的制备诱变的双链多核苷酸的方法，其中采用至少一个确定的末端引物。
13．根据权利要求1所述的制备诱变的双链多核苷酸的方法，其中所述引物是确定序列的引物，引物中一个或多个核苷酸位置上表现出有限的随机性。
14．根据权利要求13所述的制备诱变的双链多核苷酸的方法，其中所述引物含有6-100个碱基。
15．根据权利要求13所述的制备诱变的双链多核苷酸的方法，其中采用两个或多个确定的针对对于模板任何区域有特异性的引物。
16．根据权利要求1所述的制备诱变的双链多核苷酸的方法，其中所述引物是有确定序列的引物，引物内30％以上的核苷酸位置上表现出有限的随机性。
17．根据权利要求16所述的制备诱变的双链多核苷酸的方法，其中所述引物含有6-100个核苷酸。
18．根据权利要求16所述的制备诱变的双链多核苷酸的方法，其中采用两个或多个确定的针对模板任何区域有特异性的引物。
19．根据权利要求1所述的制备诱变的双链多核苷酸的方法，其中所述引物是有确定序列的引物，引物内60％以上的核苷酸位置上表现出有限的随机性。
20．根据权利要求19所述的制备诱变的双链多核苷酸的方法，其中所述引物含有6-100个核苷酸。
21．根据权利要求19所述的制备诱变的双链多核苷酸的方法，其中采用两个获得多个确定的针对模板任何区域有特异性的引物。
22．根据权利要求1所述的制备诱变的双链多核苷酸的方法，其中所述引物是有随机序列的引物。
23．根据权利要求22所述的制备诱变的双链多核苷酸的方法，其中所述引物的长度为6-24个核苷酸。
24．根据权利要求22所述的制备诱变的双链多核苷酸的方法，其中在所述多核苷酸短片段生成后从所述DNA库中除去所述模板多核苷酸。
25．根据权利要求1所述的制备诱变的双链多核苷酸的方法，还包括从所述DNA库中分离出所述诱变的双链多核苷酸并对所述诱变的双链多核苷酸进行扩增的附加步骤。
26．根据权利要求25所述的制备诱变的双链多核苷酸的方法，其中所述诱变的双链多核苷酸用聚合酶链反应来扩增。
27．一种制备酶的方法，包括下列步骤a)将根据权利要求1制得的诱变的双链多核苷酸插入载体中形成表达载体，所述诱变的多核苷酸可编码一种酶；b)将所述表达载体转化入宿主细胞中；和c)表达所述诱变的多核苷酸编码的酶。
28．一种从至少一个模板多核苷酸制备诱变的双链多核苷酸的方法，所述诱变多核苷酸中至少有一个核苷酸与所述模板多核苷酸中相应位置的核苷酸不同，其中所述方法包括(a)在所述模板多核苷酸存在下用随机序列或确定序列引物来进行酶催化的DNA聚合，以生成包含多核苷酸短片段和所述模板多核苷酸的DNA库；(b)使所述DNA库变性成既有单链片段多核苷酸又有单链模板多核苷酸的库；(c)在退火条件下使所述库中的单链多核苷酸退火，以生成退火的双链多核苷酸库；(d)使所述退火的多核苷酸库与DNA聚合酶在使所述双链多核苷酸延伸的条件下一起培育，以生成含有延伸双链多核苷酸的DNA库；(e)重复步骤b)至d)，直至所述含有延伸双链多核苷酸的DNA库含有所述诱变的多核苷酸。
29．根据权利要求28所述的方法，其中所述单链片段多核苷酸和单链模板多核苷酸库中含有的单链片段多核苷酸的区域与所述库中其它单链片段多核苷酸的区域互补，从而使这些片段多核苷酸在步骤(c)中相互退火，并在步骤(d)中相互引导。
30．根据权利要求28所述的方法，其中所述单链模板多核苷酸在步骤(c)中退火到至少一些单链片段多核苷酸上，从而在步骤(d)中使得所述单链片段多核苷酸重新随机引导。
31．一种从至少两种模板多核苷酸来制备诱变的双链多核苷酸的方法，所述模板多核苷酸包括互不相同的一个第一模板多核苷酸和一个第二模板多核苷酸，所述诱变的多核苷酸中至少有一个核苷酸与所述第一模板多核苷酸相应位置上的核苷酸不同，且至少有另一个核苷酸与所述第二模板多核苷酸相应位置上的核苷酸不同，其中所述方法包括(a)在标准DNA聚合条件或导致部分延伸的条件下，使一系列随机序列引物或至少一个确定序列引物在所述模板多核苷酸上进行酶催化DNA聚合，以生成含有多核苷酸片段和所述模板多核苷酸的DNA库；(b)使所述DNA库变性成既有单链片段多核苷酸又有单链模板多核苷酸的库；(c)在退火条件下使所述库中的单链多核苷酸退火，以生成退火的双链多核苷酸库；(d)使所述退火的多核苷酸库与DNA聚合酶在使所述双链多核苷酸全部或部分延伸的条件下一起培育，以生成含有延伸双链多核苷酸的DNA库；(e)重复步骤(b)至(d)，直至所述含有延伸双链多核苷酸的DNA库含有所述诱变的多核苷酸；当(1)步骤(b)中采用标准的DNA聚合条件或(2)步骤(d)的结果为全部延伸时，如果采用至少一个确定序列的引物，则至少一个这样的引物必须是非末端的引物。
32．根据权利要求31所述的方法，其中所述第一模板多核苷酸在至少两个碱基对上与所述第二模板多核苷酸不同。
33．根据权利要求32所述的方法，其中所述两个碱基对相互分开。
34．根据权利要求33所述的方法，其中所述两个碱基对相互隔开至少15个碱基对。
全文摘要
公开了一种以聚合酶催化引物寡核苷酸延伸为基础的多核苷酸序列体外诱变和重组方法。该方法包括用随机序列或确定序列的引物来引导模板多核苷酸生成低水平点突变的DNA短片段。将DNA片段变性,然后进行退火用酶催化DNA聚合。重复该步骤足够次数,以生成包含原始模板多核苷酸突变体的全长基因。这些基因可用聚合酶链反应来进一步扩增并克隆入载体中以表达所编码的蛋白质。
文档编号C12N15/10GK1230990SQ98800350
公开日1999年10月6日 申请日期1998年3月25日 优先权日1997年3月25日
发明者F·H·阿诺德, Z·邵, J·A·阿福霍尔特, H·赵, L·J·吉夫尔 申请人:加利福尼亚技术学院