专利名称：酒曲霉菌中蛋白水解酶的增强表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及可增强表达蛋白水解酶的酒曲霉菌的遗传突变。
领域阐述水解的蛋白，广泛用于食品工业，可通过用酸，碱或酶水解蛋白原料得到。多种方法用酒曲霉菌(koji mold)制备食品产品，通过很多种分泌淀粉酶，蛋白酶和肽酶的作用水解。酒曲霉菌传统把是那些用于生产包括以下种属的细胞的酒曲培养物(US4308284)，例如，曲霉属，根酶属和/或主酶属的细胞，特别是酱油曲霉，米曲霉，海枣曲霉，黑曲霉，泡盛曲霉，米根霉，寡孢根霉，日本根霉，台湾根霉，卷枝毛霉，日本毛霉，灰绿青霉，和褐色青霉。根据International Code ofBotanical Nomenclature(ICBN)，的规则，曲霉属(Aspergillus)是风媒属。这意味着真正的曲霉只通过分身孢子无性繁殖。然而，典型的曲霉分身孢子形态学可在能通过子囊孢子有性繁殖的真菌中发现。有些曲霉分类学家引起混乱，由于他们不同意ICBN术语。他们试图修正分类方案以将米曲霉(米曲霉)包括在此属内，尽管其分类修正名称是Emericella nidulans (Samson,Aspergillus，生物学和工业应用，355-390页，Bennett和klich编，Boston)。
EP417481(Societe des Produits Nestle)这样描述发酵的黄豆调味剂的生产过程，其中通过混合酒曲培养物和蒸煮黄豆和烹熟的小麦的混合物制备酒曲，酒曲接着在酒曲培养物发酵时产生的酶存在的水悬液中45℃到60℃水解3到8小时，通过在水解的酒曲悬浊液中加入氯化钠制备moromi,moromi留作发酵并被挤压且获得的溶液用巴氏法消毒并澄清。
EP429760(Societe des Produits Nestle)描述了生产调味剂的过程，其中制备富含蛋白材料的水悬液，蛋白通过蛋白酶在pH6.0到11.0水解溶液得到，悬液在pH4.5到6.5热处理，且用酒曲培养物的酶催熟悬液。
类似的，EP96201923.8(Societe des Produits Nestle)描述了生产肉调味剂的过程，其中制备含有植物蛋白源和植物碳水化合物源的混合物，所述混合物含有至少45％的干物质，混合物用酒曲培养物接种且用一种或多种其它传统肉类发酵所涉及的微生物，混合物被接种直到形成肉味。
然而，另一方面，酸或碱水解会破坏水解中产生的必需氨基酸降低营养价值，而酶水解很少彻底，这样水解蛋白便含有确实量的多肽。酒曲过程的优化和进一步发展被关于水解酶本身，其调节和任何影响其表达和活性的过程因子(例如温度，pH，水活性，和盐浓度)的知识的缺乏所阻碍。
在真菌Emericella nidulans(katz等，基因，150,287-292,1994)中，发酵活性归因于至少三条基本控制路线包括碳代谢产物阻遏，氮和硫代谢阻遏。这三条调节路线使底物中的氮，碳，和硫源依照其氮，能量，硫供应依次被利用。在Emericella nidulans(Arst等分子基因遗传，26,111-141,1973)，氮代谢阻遏由areA基因产物实现，或在其它真菌中Neurospora crassa(DAvies等，美国国家科学院院刊，84,3753-3757,1987),Penicillium chrysogenum(Haas等，遗传学现状，27,150-158,1995)和啤酒酵母(Minehart等，分子细胞生物学，11,6216-6228,1991)类似基因实施类似功能。
areA基因编码正调节作用DNA结合蛋白(AREA)，属于转录因子GATA家族，为在利用除氨和L-谷氨酰胺以外的氮源时所必需。在氮脱阻遏条件下，通过细胞内高水平谷氨酰胺的信号，areA表达通过三条机制下调1)AREA蛋白失活，2)areA转录终止和3)通过3’非翻译尾序列(3’-UTS)的功能，areA mRNA降解增强(Platt等，EMBO J,15,2791-2801,1996)。缺乏功能性AREA蛋白时，只有氨和L-谷氨酰胺可用作氮源，同样的，无功能areA突变只有氨和L-谷氨酰胺可用作氮源(Arst等，1973)。
对酒曲发酵的观察提示氮代谢阻遏是酒曲发酵的主要因素。例如，高水平的L-谷氨酰胺显示可以负性影响酒曲发酵的蛋白水解活性。
进一步，还观察到高水平的蛋白水解活性和谷氨酰胺酶活性是酒曲发酵中两个相互排斥的条件(Ushijima等，农业生物化学，51,1051-1057,1997)。例如在含0.1％麦麸的基本生长培养基中加入25mM L-谷氨酰胺减少内源蛋白水解酶活性约40-50倍。这一现象可通过假定L-谷氨酰胺是诱导谷氨酰胺酶所必需的来解释。然而，L-谷氨酰胺也是氮代谢阻遏的效应剂，当谷氨酰胺酶被诱导时蛋白水解酶表达被阻遏。
至于谷氨酰胺酶相应的转化L-谷氨酰胺为谷氨酸的事实，后者是一重要天然调味剂(见WO95/31114)，有理由需要克服L-谷氨酰胺介导的蛋白水解酶阻遏，允许在酒曲霉菌中同时表达谷氨酰胺酶和蛋白水解酶。
另外，根据用于蛋白水解的蛋白和酶的性质，形成的肽可能具有特别苦的味道且是感官所不期望的。因此需要水解蛋白的方法能导致蛋白高度水解且水解产物具有优良的感官特性。
最后，对用酒曲霉菌水解的谷物中，例如麦麸，的残肽的生化分析，显示相当量的谷氨酰胺保存于含有脯氨酸的肽中(Adler-Nissen,食物蛋白的酶水解.Elsevier Applied Sciences Publishers LTD,120页，1986)。因此需要能导致大量L-谷氨酰胺释放的水解蛋白的方法。
发明简述本发明的目标是一种酒曲霉菌株，在含0.2％大豆果实蛋白的基本培养基中生长时，其每毫升上清中，它能比野生型菌株米曲霉CNCM I-1882表达至少多两倍的内切和外切蛋白酶，特别是至少30mU内切蛋白酶活性，至少30mU亮氨酸-氨基-蛋白酶活性和至少10mU脯氨酰-二肽-肽酶活性。
第二方面，本发明提供了米曲霉(Aspergillus oryzae)的DNA结合蛋白(AREA)，至少具有序列号2的从氨基酸1之氨基酸731或其功能衍生物的氨基酸序列。
第三方面，本发明提供一DNA分子，含有编码本发明DNA结合蛋白的areA基因。
第四方面，本发明提供了过表达蛋白水解酶的方法，包括在适当的培养基中在霉菌表达酶的条件下依据本发明孵育酒曲霉菌，并以浓缩形式选择性的分离酶。
另一方面，本发明提供利用本发明的酒曲霉菌水解含蛋白的材料。
最后一方面，本发明提供含有用本发明的酒曲霉菌发酵而得的含有蛋白和至少5mML-谷氨酰胺的原料获得的蛋白水解产物的食物产品。发明详述在以下描述中，如非特别说明所给百分数是重量百分数。称作“序列号”的氨基酸或核酸序列通常列于后面的序列表中。一亮氨酸氨基肽酶单位定义为每分钟37℃以亮氨酸-p-硝基苯(400nm吸收测定；ε=10’500M-1cm-1)为底物产生1μmol p-硝基苯的酶量。一脯氨酰-二肽-肽酶单位定义为每分钟37℃以丙氨酸-脯氨酸-p-硝基苯(400nm吸收测定；ε=10’500M-1cm-1)为底物产生1μmol p-硝基苯的酶量。一内切肽酶单位定义为每分钟37℃从试卤灵标记的酪蛋白底物在所述条件下(Boehringer Cat No.1080733；于574nm测定吸收)产生1μmol TCA可溶肽的酶量。
术语“酒曲”定义为用酒曲霉菌培养物发酵蛋白源和碳水化合物源的混合物所得的产物，特别是豆科植物或蒸煮的油类植物和蒸煮或焙烧的谷类植物的混合物，例如大豆或蒸煮的果实和蒸煮或焙烧的小麦或水稻的混合物。
类似的，“酶的功能衍生物”表述包括所有通过取代，删除，添加一些氨基酸，例如1-20氨基酸，形成的不同的氨基酸序列，但它们保持原有的活性或功能。功能衍生物的选择对本领域技术熟练人员是显而易见的，因为可以很容易的用本领域所熟知的稍微改进的方法获得截断的AREA蛋白(见序列号2)的突变体，例如Adams等(EP402450；Genencor)，Dunn等(蛋白工程，2,283-291,1988),Greener等(Strategies,7,32-34,1994)和或Deng等(生化年鉴，200,81,1992)描述的方法。
特别的，如果其序列和该蛋白至少85％相同，优选至少90％，特别99％，一种蛋白可以从遗传上被认为是另一蛋白的衍生物。在本发明中，通过和截断的AREA蛋白(序列号2)一致的衍生物序列的氨基酸数和所述衍生物序列的氨基酸总数之比来决定一致性。
本发明涉及任何使蛋白水解酶增强表达，导致高度蛋白水解和具有优良的感官特点的水解产物的酒曲霉菌。因此，这些酒曲霉菌表达(1)高水平的内肽酶，如这些能从酪蛋白在37℃产生TCA-可溶肽的酶，和(2)高水平的外肽酶如亮氨酸氨基肽酶消除N-末端亮氨酸(Deng等生化年鉴，200,81,1992)和脯氨酰-二肽-肽酶消除N-末端X-脯氨酸二肽，其中X可以是任何氨基酸(Barrett等，哺乳动物蛋白酶术语和书目，N.Y.Acad.Press,2,132页，1986)。
鉴于本发明的酒曲霉菌提供增强的脯氨酰-二肽-肽酶活性的事实，它们可用于释放含脯氨酸肽中保留的L-谷氨酰胺。
提供以下蛋白水解酶增强表达的酒曲霉菌特别适用于本发明的目的至少约30mU/ml*，优选至少约50mU/ml*内肽酶活性；至少约30mU/ml*，优选至少约50mU/ml*亮氨酸氨基肽酶活性；和至少10mU/ml*，优选至少月15mU/ml*脯氨酰-二肽-肽酶活性(*当于含0.2％大豆果实蛋白的基本培养基中生长的每毫升上清)。
另外，克服L-谷氨酰胺介导的蛋白水解酶阻遏，允许谷氨酰胺酶和蛋白水解酶同时表达的酒曲霉菌，也是本发明的一部分。这些酒曲霉菌在，例如含0.2％大豆果实蛋白和至少5mML-谷氨酰胺(0.073％w/w)的基本培养基中生长时，可表达上述提到的蛋白水解酶活性。
本发明的酒曲霉菌可通过随机U.V和/或化学突变获得，然后筛选提供所需表型特点的突变酒曲霉菌。
筛选特别是含有不被阻遏的areA基因突变的突变酒曲霉菌，当突变霉菌在含阻遏量的L-谷氨酰胺的基本培养基中生长时，可适合于本发明的需要。为此，areA突变株可通过经典随机突变选择(UV，化学的)并在，例如，含约100mM氯化甲基铵和0.2％大豆蛋白的平板上筛选。
已有报道，脯氨酰-二肽-肽酶的活性并非由areA基因表达天然控制，当areA基因脱阻遏后，其活性出人意料的增强。由于脯氨酰-二肽-肽酶活性的表达由肽诱导(未发表结果)，这种AREA依赖的活性增强可能是有在areA控制下的内切蛋白酶的所导致肽释放的增强引起。
鉴于随机U.V和/或化学突变费时的事实，用重组技术构建本发明的酒曲霉菌更合适。因此，本发明的酒曲霉菌优选含有重组的areA基因，它如截断的AREA蛋白那样截断但保留有功能，当霉菌在含阻遏量的L-谷氨酰胺的基本培养基中生长时并不被阻遏。已有报道这种截断也导致一种对mRNA降解次敏感的areA mRNA。
截断可通过切除天然areA基因的预定区实现，及通过引入终止区以允许截断的areA mRNA转录。截断优选在编码AREA DNA结合区序列的下游实现，通过17个氨基酸环结合两对半胱氨酸残基很容易识别。更恰好的，截断可在编码保守氨基酸结构半胱氨酸-2X-半胱氨酸-17X-半胱氨酸-2X-半胱氨酸序列的下游实现，其中X是任何氨基酸且数字2和17指氨基酸数目(Caddick等Antonie vanleeuwenhoek,65,169-177,1994)。此截断特别可在编码DNA结合区的areA序列后100氨基酸进行。
任何有功能的真菌areA基因可用于本发明中，特别是在严格条件下能和具有从序列号1核苷酸1189至核苷酸3846或其依据遗传密码的简并性所得的功能衍生物的核酸序列的米曲霉的areA基因杂交的有功能的areA基因。
有功能的areA基因可通过用以下实施例中描述的方法从Aspergillus菌株中纯化并获得。或者，一种areA基因可被(1)从其它种属真菌中用衍生白核苷酸序列1的DNA探针通过严格的杂交方法检测到，并(2)用合适的衍生自序列号1包括areA基因的引物通过熟知的逆转录-PCR方法获得。进一方面，areA基因可以体外合成然后利用，例如，聚合酶链反应放大。
合适的截断的areA基因特别包括，例如，序列号1(序列号1含有一内含子)核苷酸1189-1604和1704-3480限定的核苷酸序列或依据遗传密码的简并性获得的功能性衍生物。此截断的基因编码具有序列号2的氨基酸1至氨基酸731的氨基酸序列的米曲霉.的AREADNA蛋白结合区，这是利用除氨和L-谷氨酰胺以外氢源所必需的。
截断的areA基因可引入一个载体，例如一可复制质粒或一可整合环状或线性非复制质粒，并可被连接于在所述生物体中调节不同基因的或在其它生物体中调节不同基因的调节序列(启动子和或终止子)，例如，天然调节序列外的调节序列可通过其高效率或期望特性选取，如，启动子的可诱导性或高表达能力。
如果优选异源表达，指本发明的基因在另一生物而非初始宿主中表达(株，种，种，属，科，目，纲或门)调节序列优选衍生白和表达宿主相似或相同的生物。例如，若表达宿主是曲霉属，调节序列将衍生自曲霉属。持续表达合适的启动子，优选在真菌宿主中，可以是以下基因的启动子；例如甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶，磷酸甘油酯激酶，磷酸丙糖异构酶和乙酰胺酶。
适合可诱导表达启动子，优选在真菌宿主中，可以是来自以下基因的启动子内切木聚糖酶IIA，葡糖胺酶A，纤维素二糖水解酶，淀粉酶，转化酶，乙醇脱氢酶和淀粉葡糖苷酶。选择合适的调节序列连接于本发明的序列并能指导所述核苷酸序列的表达对本领域技术熟练人员是明显的。
载体也可包括一选择性标记以从不包含所述重组原料的细胞中辨认已被导入重组DNA材料的宿主细胞。这样的标记基因是，例如，优选真菌表达时熟知的ga-2,pyrG,pyr4,pyrA,trpC,amdS,或argB基因。DNA分子也可包括至少一个合适的复制的起始点。合适的转化方法和具有合适转录启动子，合适转录终止信号和选择转化细胞的合适标记基因的合适的表达载体对许多生物是文献中已知的，包括不同的曲霉，根霉和主霉。在需要真菌表达时，EP278355(Novartis)描述的表达系统是特别合适的。
重组酒曲霉菌可通过使外源DNA进入细胞的方法获得。这样的方法包括转化，电穿孔，或本领域技术熟练人员所熟知的其它技术。
在本发明中，酒曲霉菌是传统用作制备包括真菌，Aspergillus(ICBN分类学)，Rhizopus和Mucor细胞的酒曲培养物。这些当中，以下种可被使用，包括以下菌种，酱油曲霉，米曲霉(ATCC 20386)，海枣曲霉(ATCC 14332)，黑曲霉(ATCC 1004)，泡盛曲霉(ATCC14331)，寡孢根霉(ATCC 22959)，日本根霉(ATCC 8466)，台湾根霉，卷枝毛霉(ATCC 15242)，日本毛霉，灰绿青霉，和褐色青霉(ATCC 10447)。
带有ATCC号的菌株可以从American Type Culture Collection,Rockville,Maryland20852,US获得。本发明并不被这些描述限制，而是使本领域技术熟练人员能实施本发明。
本发明的重组细胞可包括稳定整合于染色体或在可复制质粒上的截断的areA基因。在本发明创造的所有重组细胞中，本发明特别获得菌株米曲霉(A.oryzae)CNCM I-1881,CNCM I-1883和CNCM I-1884。
优选的只有一个功能性截断的areA基因被整合入染色体，并在宿主生物天然的调节序列控制下。
为稳定整合入真核细胞染色体一个功能性截断的areA基因，它被融合于宿主生物天然的启动子和终止子。本发明的DNA分子可通过稍微修改Ruiter-Jacobs等(遗传学现状，16,159-163,1989)的方法整合，即(1)通过连接截断的areA基因制备非复制DNA片段，它被连接于宿主生物天然的启动子和终止子，于编码必需基因的核苷酸序列的下游，所述基因通过至少一处突变和/或一处缺失(此必需基因可以是任何涉及RNA合成的基因，如米曲霉中pyrG基因)被失活；(2)选择含有被另一突变或删除失活的必需基因的宿主生物；(3)用非复制DNA片段转化所述宿主生物；(4)鉴定整合转化子，其中DNA片段被整合而恢复了必需基因的天然功能；(5)选择只有一个DNA片段被整合的整合转化子。
AREA DNA结合蛋白的过表达可通过在表达宿主中掺入截断的areA基因获得，所述areA基因被可操作的连接于一个或多个调节序列，此序列用于增加本发明的AREA蛋白的表达水平。
过表达可通过引入(复制质粒)或整合(基因组整合)多拷贝本发明功能性截断的areA基因进一步获得。如酒曲霉菌实施例中含有多拷贝的功能性截断的areA基因，转化株米曲霉A(见实施例1)，米曲霉xprD1(见实施例3)和米曲霉NF1含pNFF68(见实施例4)按布达佩斯条约的贮藏，其存放号分别为CNCM I-1881,CNCM I-1883和CNCM I-1884。
本发明也涉及过表达蛋白水解酶的过程，提供本发明的酒曲霉菌于合适熟知培养基中，在霉菌表达蛋白水解酶的条件下，以浓缩形式分离酶，例如通过用离心或过滤从发酵肉汤中去除固体。合适培养基的选择基于表达宿主的选择和/或基于DNA重组材料调节的要求。这样的培养基是本领域所熟知的。发酵后，霉菌可通过离心或过滤从发酵肉汤中去除。
霉菌在液体系统中水解达到的典型的L-谷氨酰胺浓度可为，例如，0.5-1％ w/w。本酒曲霉菌特别适合于水解含有蛋白的材料，特别是含有大量L-谷氨酰胺(超过5mM)的情况。这些含蛋白材料可以是蛋白源和碳水化合物源的混合物，特别是豆科植物或蒸煮的油类植物和蒸煮或焙烧的谷类植物的混合物，例如大豆和蒸煮或焙烧的小麦或水稻的混合物。
含有麦麸的组合物特别适用于本发明的目的，当麦麸被传统酒曲培养物水解时大量L-谷氨酰胺在含脯氨酸肽中保留。
在用酒曲霉菌水解过程中或结束后，人们可能尝试进一步释放尽可能多的连接于脯氨酸残基的L-谷氨酰胺，本发明提供了一方法，其中本发明的酒曲霉菌结合至少一种酶或提供脯氨酸酶活性的微生物使用，也就是说对X-脯氨酸型二肽有高特异性的酶(Ezespla等，Ap.Env.Microb.,63,314-316,1997；此类酶也可从Sigma获得E.C.3.4.13.9)。
另外，本发明的酒曲霉菌特别适合于含有至少5mML-谷氨酰胺的含蛋白材料，允许形成重要的天然味觉增强剂L-谷氨酸和具有优良感官特性的蛋白高度水解产物。
另一方面，本发明涉及含有提供本发明的酒曲霉菌发酵从含蛋白材料和至少5mM L-谷氨酰胺中获得的蛋白水解产物的食物产品。这样的食物含有大量的L谷氨酸(和/或L-谷氨酸)和有优良感官特性的高度蛋白水解产物，可引起非苦味和比未水解蛋白显著降低的免疫原性。
本发明的重要的食物产物是婴儿母乳替代物的成分，或水解植物蛋白成分。乳品替代物可进一步用此类产物的前述文献描述的方法阐明(EP96202475.8)。
本发明并不局限于此处描述的特殊实施方案的范围。事实上，本发明的不同修饰，除了此处描述的，和前述描述及附图对本领域技术熟练人员是清楚的。这些修饰被认为在权利要求的范围内。不同的出版物在此全文引用至理解本发明所需的程度。DNA提取，克隆，和转化细菌细胞，除非特别指出，均按Sambrook等(分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版，U.S.A.1989)的方法进行。实施例之前是附图简述。菌株米曲霉TK3，米曲霉A(实施例1)，米曲霉NF2(实施例2)，米曲霉xprD1(实施例3)和米曲霉NF1含pNFF68(实施例4)安布达佩斯条约，保藏在Collection Nationale de Culture deMicroorganismes(CNCM),25 rue du docteur Roux,75724 ParisFrance,1997,6月24日，它们分别接受保存号CNCM I-1882,CNCMI-1881,CNCM-1885,CNCM I-1884,CNCM I-1883。所有获得这些保存物的限制一旦本申请或要求先于本申请受益的另一申请被公布将被撤销。
图-
图1显示含有截断的E.nidulans areA基因和pkiA启动子和终止子的pNFF21的限制性图谱。
-图2显示米曲霉TK3(野生型)，包括pyrG基因的pNFF28转化的米曲霉(对照pyr+)，破坏突变米曲霉areA(对照areA-；见实施例2)，和用pNFF28和pNFF21转化的米曲霉NF13突变株的相对Endo,LAPhe DPPIV活性。
-图3显示质粒pNFF5的4.6kb EcorⅠ-HindⅢ插入的限制性图谱，弥补了Emericella nidulans G332中的areA19突变；包括编码区的两个外显子用黑箭头表示。
-图4显示areA破坏构建物pNFF44含有两个E.nidulans pyrG基因的外显子(pyr1和pyr2)，米曲霉areA基因的两个外显子(areA1和areA2)和细菌卡那霉素抗性基因(kanaR)。
-图5显示米曲霉areA基因的位点特异突变；突变引物和野生型areA序列的错配表示如下终止密码子(TAA)是斜体，AflⅡ位点下划双线且引入的EcoRⅤ位点用粗体标记并下划线。
-图6显示A.oryzaeTK3(野生型)和用脱阻遏的areA扩增产物和pyrG扩增产物共转化的A.oryzae NF1 9突变株，转化株用葡萄糖和谷氨酰胺在MM上筛选，的相对Endo,LAP和DPPIV活性。菌株和质粒-E.nidulans G191(pyrG89,fwnA1,pabaA1,yuA1),E.nidulansG353(areA1,biA1)和E.nidulans G332(pabaA1,yA2,xprD1)从GlasgowGenetic Stocj Center通过A.J.Cluterbuck博士获得。其它野生型Emericella nidulans菌株也可用于以下实施例。
-米曲霉TK3从Nestle菌株保藏中心获得。
-米曲霉NF1(pyrG1)是米曲霉TK3的尿嘧啶营养缺陷衍生物，其中pyrG基因，编码乳清酸核苷5’-磷酸脱羧酶，被定点破坏失活。
-大肠杆菌BZ234(Collection from Biozenter,Basel大学，Basel,瑞士)用作质粒繁殖宿主。大肠杆菌株JMl09(endA1,recA1,GyrA96,hsdR17(rk-,mk+),relA1,SupE44,λ-,Δ(lac-proAB),[F’,traD36,proA+B+,lacIqZΔM15])和EM1301(lacZ53,mutS201∷Tn5,ThyA36,rha-5,metB1,deoC,IN(rrnD-rrNE))用于位点特异突变。
-质粒pHELP1用于在Emericella nidulans中直接克隆(Gems和Clutterburk，遗传学现状，24,520-524,1993；GenBank号X78051)。
-质粒pNFF28含有米曲霉TK3pyrG基因(GenBank好Y13811)。
-质粒pFNBY182，含有作为在黑曲霉pkiA启动子和终止子控制下EcoRⅰ-XbaⅠ片段的pepB基因，通过Gabor Jarai博士获得自Novartis，瑞士，(GenBank号S38698)。
-质粒pNEB193(New Englang Biolabs),pALterl(Promega),pBluescriptSK-(Stratagene),pHSS19和pGEM-T(Promega)，和pK18(genBank号M17626)用于亚克隆。培养基真菌氮源(FNB)包括无氨基酸1×Yeast Nitrogen Base(YNB)和(NH4)2SO4(Difco)和50mM葡萄糖作碳源和10mMNaNO3作氮源。对于E.nidulansG353(areA1,biA1),10mM谷氨酰胺加入作为氮源。生长实验在MM(含1.5gKH2PO4,0.5gMgSO4.7H2O,0.5gKcl,potecorvo,1953)上进行，10mM NaNO3作为单一氮源。蛋白酶培养皿测定在含0.2％大豆蛋白作为单一碳源和氮源的MM上测定。对定量研究，250ml烧瓶装80ml含0.2％大豆蛋白，作为单一碳源和氮源，的MM，接种106分身孢子/ml并在30℃不振摇孵育5天。实施例1 E.nidulans截断的areA基因的过表达为测定通过调节areA表达增加蛋白水解酶表达的可能性，我们决定在米曲霉中过表达Emericella nidulans基因。
为此，扩增Emericella nidulans G191的areA基因的编码区并通过以下将PCR产物克隆入表达载体pFBY182用寡核苷酸序列号3和序列号4，扩增Emericella nidulans G191的基因组DNA中含有areA编码区的2009-4168,2.174bp的片段。同时在5’末端加入EcoRⅠ位点并在3’末端加入XbaⅠ位点，并定向克隆入EcoRⅰ-XbaⅠ消化的真菌表达载体pFBY182中以产生pNFF21(见图1)。在pNFF21中，areA转录在A.niger pkiA启动子和终止子控制下(Graaff，遗传学现状，22,21-27,1992)，由此在阻遏条件下通过天然3’UTS作用阻遏下调。
pNFF21通过和含有A.oryzae pyrG基因的pNFF28共转化进入米曲霉NF1(pyrG1)。然后米曲霉NF1在含0.1％酵母抽提物(Difco),50mM葡萄糖和5mM谷氨酰胺的MM中生长。菌丝体通过无菌过滤收获，用无菌双蒸水和K0.8MC(20mM MES-HCl pH5.8,0.8M KCl,50mMCaCl2)各洗一遍。1.5克菌丝体重悬于20ml过滤除菌的5mg/mlNovozyme234的K0.8MC溶液中。菌丝体悬液在30℃轻摇(120rpm)孵育2小时。通过用滴管轻轻吸打使原生质体从菌丝体中释放，用20mlS1.0TC(10m MTris-HCl pH7.5,1M山梨醇，50mMCaCl2)洗两遍并以终浓度108/ml重悬于S1.0TC。20ml DNA和200μl原生质体混合并加入50μl 25％PEG6000的10mM Tris-HCl pH7.5,50mMCaCl2溶液，在冰上孵育20分钟。在此混合物中加入2ml含25％PEG6000(BDH)的10mM Tris-HCl pH7.5,50mMCaCl2溶液，轻轻混合并在室温孵育5分钟。加入4ml S1.0TC且1ml等份和5ml 2％OFNB(渗透压稳定的真菌氮源)中的低熔点琼脂糖混合(Sigma)并铺于含50mM葡萄糖和10mM NaNO3的OFNB琼脂上(Difco)。米曲霉NF1转化物铺于含1M蔗糖，50mM葡萄糖和5mM谷氨酰胺的MM琼脂上。
所得转化物在含2％大豆蛋白的MM上筛选。在筛选的20转化物中，通过30℃孵育36小时后克隆周围的晕的大小判断，三个显示增强的蛋白酶分泌活性(转化子A,B和C)。这三个转化子在含2％大豆蛋白的MM液体培养物中30℃孵育5天并用合适对照分析蛋白水解活性。
为此，这三株分身孢子(106/ml)用于接种含0.2％大豆蛋白为单一氮源和碳源的80ml液体MM中。此培养物不振摇在30℃培养5天。过滤去除菌丝体后，培养基测定内切蛋白酶活性(Endo)，亮氨酸氨基肽酶活性(Lap)，脯氨酰-二肽-肽酶活性(DPPIV)。内切肽酶活性测定用试卤灵标记的酪蛋白根据Boehringer法所述及其底物(试卤灵标记的酪蛋白，Cat No.1080733)测定。亮氨酸氨基肽酶及二肽-肽酶Ⅳ活性用UV分光光度计通过合成底物亮氨酸-pNa和丙氨酸-脯氨酸-pNa(Bachem，瑞士)，分别根据Sarath等(蛋白水解酶的蛋白酶测定方法实验方法，Beynon R.J.,Bond J.S.,编，IRL Press,Oxford)测定。二甲基亚砜(DMSO)中的10mM底物储存液用100mM磷酸钠缓冲液，pH7.0稀释至终浓度0.5mM。加入20-100μ培养基悬液且反应在37℃进行60分钟。对照用空白底物和空白上清平行测定。释放的显色基团4-硝基苯(ε=10’500M-1cm-1)在400nm处测定且活性用mU/ml(nmol/min/ml)表示。
相对蛋白水解活性在图2中显示。在areA破坏突变株中，内切蛋白酶活性(Endo)和亮氨酸氨基肽酶活性(Lap)比TK3和pyr+对照菌株明显减低，而脯氨酰-二肽-肽酶活性(DPPIV)不受影响。显然，脯氨酰二肽肽酶表达不受areA控制。多拷贝pkiA表达信号控制下的E.nidulansareA导入米曲霉NF1导致内切蛋白酶，亮氨酸氨基肽酶和脯氨酰-二肽-肽酶活性的过表达。实施例2在米曲霉中过表达截断的areA基因1)米曲霉areA基因的克隆通过用瞬时文库法补充E.nidulans的相应areA基因克隆米曲霉areA基因(Gems等1993)。
首先，根据Raeder和Broda(let.appl.microbiol.,1,17-20,1985)描述的方法的改进程序分离基因组DNA。过滤收集菌丝体，立即在液氮中速冻并冻干。接着用研钵研为粉末。200mg粉末菌丝体重悬于2.5ml浸出缓冲液(200mM Tris-HCl pH 8.5 150mM NaCl,25mMEDTA,0.5％SDS)且溶液用1.75ml浸出缓冲液平衡的酚和0.75ml的氯仿/异戊醇(24∶1 v/v)抽提。混合物离心(20分钟，3000g)。水相回收并用125μlRNAse A(Boehringer)溶液(10mg/ml)37℃孵育10分钟。加入1.25ml 2-丙醇(Merck).沉淀用70％乙醇洗并最后重悬于500TE缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0,1mMEDTA)。向样品中加入500ml 2×QBT(1.5M NaCl,100mM Mops,30％乙醇，pH7.0)接着用于“Genomic-tip 100”(Qiagen)，按厂商推荐吸附并洗脱。
通过混合40μg BamHⅠ消化的pHELP1和100μg BamHⅠ消化或100μg Sau3A部分消化的米曲霉TK3基因组DNA获得补充克隆。或者，40μg KpnⅠ消化的pHELP1和100μgKpnⅠ消化的米曲霉TK3基因组DNA。所有三种DNA混合物导入E.nidulansG332并在NaNo3作为单一氮源的渗透稳定的FNB培养基上筛选转化子。
用Sau3A部分消化的米曲霉TK3 DNA的转化实验不产生融合转化子。而用BamHⅠ和KpnⅠ消化的米曲霉TK3 DNA分别产生14和3个转化子。这些转化子显示不规律的生长，提示补充基因定位于自主复制质粒。在一单独实验中40μg KpnⅠ消化的pHELP1和100μgKpnⅠ消化的E.nidulansG332(xprD1)基因组DNA共转化并得到一个转化子。
从三个BamHⅠ来源转化子和一个KpnⅠ来源转化子中通过转化大肠杆菌获得质粒。从来自xprD1转化子中未分离到质粒。从单个E.nidulans BamHⅠareA+转化子中可分离得到几个质粒。这些质粒的限制性分析表明它们是含有其它限制性片段的pHELP1衍生物，但并非所有这些插入都有末端BamHⅠ位点。类似的，从KpnⅠareA+转化子可获得数个pHELP1衍生物，其中没有一个有末端KpnⅠ位点插入。这些过程表明质粒的不稳定性。
一个BamHⅠ(pNFF3)和一个KpnⅠ(pNFF4)pHELP1衍生物选作进一步分析。两个克隆的插入片段都和E.nidulans areA基因的编码区杂交。这两个克隆的详细分析显示在pNFF3中，整个areA基因定位于一4.6kb的EcoRⅠ-HindⅢ片段(图3)。此4.6kb的EcoRⅠ-HindⅢ片段被亚克隆入pHSS19产生pNFF5。重导入E.nidulansG323,pNFF5恢复了其以NaNO3作为单一氮源生长能力，显示此质粒含有功能性areA基因(数据未显示)。
2)米曲霉areA基因的确定pNFF5中EcoRⅠ-HindⅢ插入的完整核苷酸序列通过部分重叠亚克隆分析两条链测定。核苷酸序列在Licor 4000型自动测序仪上测定。IRD41标记引物通过Sanger等(美国国家科学院院刊74,5463-5467,1977)的双脱氧法用作双链部分覆盖亚克隆测序。DNA序列分析用GCG计算机程序进行(Devereux等核酸研究，12,387-395,1987)。
结果显示米曲霉areA基因编码一853氨基酸残基蛋白，推测分子量为92.5kDa(见序列号2)。米曲霉areA和E.nidulans areA基因在蛋白水平具有83％且在DNA水平79％相似性。
进一步，在推测的启动子区和E.nidulans的整体DNA同源性降至43％。然而，DNA5到13bp长的七核苷酸伸展显示100％序列一致性且占据两个启动子几乎一致的位置。这些序列可代表顺式作用元件。另外，5’非翻译区含有几个推测的AREA-结合位点(GATA或TATC；Fu和Marzluf，美国国家科学院院刊，87,5351-5355,1990)，其中两个占据和E.nidulans中两个功能性AREA结合位点相同的位置。
3)米曲霉areA基因的破坏为阐明areA在蛋白酶编码基因表达中的作用，通过基因破坏产生areA无效突变。为构建这样的areA无效等位基因，两个内部SmaⅠ片段(图3)从pNFF5移去产生pNFF10。为此，通过用SmaⅠ消化含有米曲霉areA基因的pNFF5并自身连接含有片段的载体产生pNFF10。这样从pNFF5的areA基因的第二外显子删除了内部0.5和0.2kb SmaⅠ片段。
作为选择标记，包括E.nidulans pyrG基因的PCR产物，插入pNFF10单一的SmaⅠ位点产生pNFF44(图4)。同样，用寡核苷酸序列号5和序列号6扩增E.nidulans G332的pyrG基因且1.851bp PCR产物克隆入pGEM-T(Promega)以产生pNFF38和pNFF39。包含pyrG基因的EcoRⅠ片段从pNFF39中切出，用T4 DNA聚合酶补平并克隆入pNFF10的SmaⅠ位点。
此pNFF44构建物，用EcoRⅠ和NheⅠ线性化，用于转化米曲酶NF1，在含葡萄糖和谷氨酰胺分别作为碳源和氮源的渗透稳定的MM上筛选转化子。所有pyrG+转化子进一步检测其利用硝酸盐和大豆蛋白作为单一氮源的能力。四个pyrG+转化子显示在硝酸盐MM上大大减缓或不生长且三个在含0.2％大豆蛋白作为单一氮源和碳源的MM上生长两天未形成晕(数据未显示)。这四个SmaⅠ消化的基因组DNA和其它六个pyrG+转化子用SmaⅠ消化并用4.6kb pNFF5的EcoRⅠ-HindⅢ插入片段作探针进行Southern印迹。只有一个转化子中areA基因的两内部SmaⅠ片段被删除，表明此转化子为areA无效突变。此areA破坏突变称为NF2。
areA突变NF2在含0.2％大豆蛋白的80mlMM中不振摇30℃生长5天。areA突变株在含0.2％大豆蛋白的MM中生长缓慢。分析培养肉汤显示与米曲霉TK3(WT)对照(图2)相比总内切蛋白水解活性降低75％和亮氨酸氨基肽酶活性降低60％。相比较，areA突变株中脯氨酰二肽肽酶活性与野生型对照无显著不同(图2)。
4)组成型areA等位基因的构建用pNFF5共转化实验，包括野生型areA基因，不产生过表达蛋白酶的共转化株(数据未显示)。这提示米曲霉areA基因的紧密调节。
为允许蛋白水解酶组成型表达(即，有谷氨酰胺存在)，得到areA基因的截断。通过位点突变，一个终止密码子(TAA)，一个AflⅡ和一个EcoRⅤ位点引入4.6kb EcoRⅠ-HindⅢ areA片段，在氨基酸残基752后截断AREA蛋白(见图5)。
为此，pNFF5的EcoRⅠ-HindⅢ插入片段被连入pALTER1并导入大肠杆菌JM109以产生pNFF49。通过用辅助噬菌体M13KO7感染，从pNFF49产生单链DNA用于利用Altered Sites Ⅱ试剂盒(Promega)定点突变程序。接着0.05pmol单链pNFF49和0.25pmol氨苄修复的寡核苷酸序列号7,0.25pmol四环素剔除的寡核苷酸序列号8和1.25pmolareA/xprD1突变寡核苷酸序列号9，在20ml 20mM Tris-HCl pH7.5,10mM MgCl2和50mMNACl在Perkin Elmer Thermocycler中退火，程序为加热退火混合物至75℃ 5分钟接着以1℃/分钟的速度降至45℃。从45℃至20℃的冷却速度为1.5℃/分钟。接着加入3ml 100mMTris-HCl pH7.5,5mM dNTPs,10mM ATP和20mMDTT。混合物在37℃和5U T4聚合酶及1UT4 DNA连接酶孵育90分钟。3ml反应混合物的液体通过电穿孔导入大肠杆菌ES1301且转化株在含125mg/ml氨苄的LB中筛选。突变质粒从ES1301中复苏并导入BZ234。
3.5kb EcoRⅠ-EcoRⅤ片段进一步克隆入pBLUESKIPT以产生pNFF58。为功能性实验PNFF58导入米曲霉NF2(见上)且转化株在含NaNO3作为单一氮源的OFNB上筛选。pNFF58，获得1.5转化子/μg，而对照pNFF5为6转化子/μg。这些数据证明pNFF58仍含有功能性areA基因。pNFF58转化子在含0.2％大豆蛋白的MM上和含0.2％大豆蛋白与10mM谷氨酰胺的MM上筛选。在0.2％大豆蛋白上几个转化子产生比野生型对照(A.orzae TK3)大的晕，提示过表达导致增强的蛋白水解酶分泌。多数转化子在两种培养基上产生晕，提示蛋白水解酶的脱阻遏表达(数据未显示)。实施例3蛋白酶过表达酒曲霉菌株的构建。
为产生潜在生产性酒曲霉菌菌株，至少一个脱阻遏areA等位基因的附加拷贝需导入米曲霉TK3衍生NF1。由于合理原因，进行时不能带入细菌序列，特别是抗生素抗性基因。为此，pNFF28和pNFF58的插入区通过PCR用pfuⅠ DNA聚合酶和磷酸化的寡核苷酸序列号10和序列号11扩增。扩增产物自连并纯化。10μg pNFF58扩增产物和10μgpNFF28扩增产物被导入米曲霉NF1转化子，在含50mM葡萄糖和5mM谷氨酰胺的渗透稳定的MM上筛选。10μg pNFF28导入作为对照。质粒pNFF28产生30转化子/μg，pNFF28PCR产生6转化子/μg且pNFF28/pNFF58PCR产生16转化子/μg。
潜在的共转化用于在含0.2％大豆蛋白的MM和含0.2％大豆蛋白和10mM L-谷氨酰胺的MM上筛选增强的蛋白酶活性。通过其产生的增大的晕表明十二个转化子在两种培养基上产生更多的蛋白酶活性。为定量过表达，其中9株在80ml含0.2％大豆蛋白的MM中30℃不振摇培养5天。培养基测定蛋白水解活性(图6)。
对在A.niger pkiA表达信号(图2)控制下的E.nidulan areA基因，测定的所有三类蛋白水解比米曲霉TK3野生型和米曲霉NF1的pyrG+衍生株活性高。蛋白酶过表达菌株的Southern分析表明所有的共转化含有2到4个脱阻遏areA基因功能性整合拷贝的。
比较观察到的蛋白酶过表达水平和脱阻遏areA基因功能性整合拷贝数，未观察到明显的联系。转化株xprD1产生最高水平的蛋白水解活性并含有多拷贝的功能性整合xorD1.然而，转化株xprD12含有少的多的功能性整合xorD1拷贝但却具有几乎和转化株xprD1类似的活性。进一步，xprD6和xprD7的杂交方式很相似，但xprD6过表达所有检测的活性1.5倍而xprD7只过表达脯氨酰二肽肽酶。实施例4具有米曲霉dppⅣ基因启动子和终止子的米曲xprD1等位基因的表达实施例2的共转化实验导致有多拷贝整合于基因组的pNFF58的菌株并比野生型TK3菌株过表达2至3倍的蛋白水解活性。作为对照，有单拷贝pNFF21(实施例1)的菌株，其中E.nidulasn areA在强糖酵解启动子控制下导致6倍的过表达。这些结果提示天然areA启动子是弱启动子且功能性截断的areA在强启动子控制下表达有更好结果。
为此，米曲霉TK3的dppⅣ基因通过PCR用pfuⅠ DNA聚合酶和磷酸化的寡核苷酸序列号12和序列号13扩增。PCR产物用ApaⅠ和EcoRⅤ酶消化。消化的ApaⅠ-EcoRⅤ 4.8kb片段亚克隆入pALTER1(Promega)以产生pNFF61。接着pNFF61根据Deng等过得方法(生化年鉴，200,81,1992)进行位点特异的突变得到pNFF62，利用5’磷酸化的突变寡核苷酸序列号14和序列号15根据Altered Sites Ⅱ试剂盒(Promega)的说明进行。利用聚合酶PfuⅠ和寡核苷酸序列号16和序列号17，从含米曲霉xprD1等位基因的pNFF58中通过PCR扩增xprD1等位基因，为一3.4kb EcoRⅠ-EcorⅤ片段。2294bp xprD1扩增产物磷酸化并克隆入SmaⅠ消化的pK19(Pridmore等，基因，56,309-312,1987)以产生pNFF64。最后pNFF64的NotⅠ-EclⅠ36Ⅲ片段被插入pNFF62 BotⅠ-HpaⅠ产生含有融合于dppⅣ启动子和终止子的xprD1等位基因的pNFF68。
通过和pNFF28共转化，pNFF68被导入米曲霉NF1，并在含0.2％大豆蛋白的MM上筛选具有增强蛋白酶活性的初始转化株。35个转化子中的5个显示比米曲霉TK3增大的晕。在选得的5转化株中，一个储存于CNCM的Budapest Treaty，获得的储存号为CNCM I-1883。
将共转化过表达蛋白酶和野生型对照铺于含0.2％大豆蛋白和5mML-谷氨酰胺的MM培养皿上。所有选择的共转化株在5mM谷氨酰胺存在下仍产生晕，而野生型没有，表明蛋白水解活性的脱阻遏表达。
为定量过表达，转化株在含0.2％大豆蛋白的80ml MM中不振摇30℃培养5天。培养基测定蛋白水解活性。结果显示比野生型TK3菌株过表达至少6倍蛋白水解活性。实施例5为制备发酵大豆调味剂，通过混合米曲霉CNCM I-1883酒曲培养物和蒸煮大豆或焙烧小麦的混合物制备酒曲，酒曲在水悬液中被米曲霉CNCM I-1培养物发酵过程中产生的酶45℃到60℃水解3到8小时，通过在水解酒曲悬液中加入适量的氯化钠制备moromi,moromi留作发酵并被挤压且所得的液体用巴氏法消毒并被澄清。实施例6为产生调味剂，制备蒸煮大豆和焙烧小麦的混合物的水悬液，通过用蛋白酶在pH6.0到11.0水解悬液使蛋白溶解，悬液在pH4.6至6.5加热处理，且悬液用Sigema的氨基酰脯氨酸肽酶和分离自米曲霉CNCM I-1881发酵的液体培养基的蛋白水解酶使之成熟。
序列列表(1)一般信息(ⅰ)申请者(ⅱ)(A)姓名SOCIETE DES PRODUITS NESTLE(B)街道AVENUE NESTLE 55(C)城市VEVEY(D)STATE:VAUD(E)国家SWITZERLAND(F)邮政编码(ZIP):1500(ⅱ)发明题目酒曲霉菌中蛋白水解酶的增强表达(ⅲ)序列数目17(ⅳ)计算机可读类型(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统(D)软件(2)SEQ ID NO:1信息(ⅰ)序列特征(A)长度4657碱基对(B)类型核酸(C)链类型双链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅸ)特征(A)名字/关键词外显子(B)位置1189-1604
(ⅸ)特征(A)名字/关键词内含子(B)位置1605-1703(ⅸ)特征(A)名字/关键词外显子(B)位置1704-3846(ⅸ)特征(A)名字/关键词misc-feature(B)位置1189-3480(D)其它信息/标记=截断的AREA/注释=“AREA是截断的编码一DNA结合区的下游序列”(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:1:GAATTCTCGA CACCCTTAGT ATTGTGGTCC TTGGACTTGG TGCTGCTATA TATTAGCTAA 60TACACTAGTT AGACTCACAG AAACTTACGC AGCTCGCTTG CGCTTCTTGG TAGGAGTCGG 120GGTTGGGAGA ACAGTGCCTT CAAACAAGCC TTCATACCAT GCTACTTGAC TAGTCAGGGA 180CTAGTCACCA AGTAATCTAG ATAGGACTTG CCTTTGGCCT CCATCAGTTC CTTCATAGTG 240GGAGGTCCAT TGTGCAATGT AAACTCCATG CCGTGGGAGT TCTTGTCCTT CAAGTGCTTG 300ACCAATATGT TTCTGTTGGC AGAGGGAACC TGTCAACTAG TTAATAACTA GTCAGAAACT 360AGTATAGCAG TAGACTCACT GTACGCTTGA GGCCCCTCTC TCTCTTTGCA CTGACTGTCA 420GCCATACCAT AGTATCATCC CGGAATTAAG AAAAAAAAAA AAAAAAAGAA AAAGAAATTA 480TTCTACCCCC GATCTGGACA AATTATAACC AGGAGAAAAT CAAGCGAAAG AGGGGCAAAG 540GAGGAGACAC CATTAAAATT GGGTCTGGCT TGATTCATGA CATACATTCG TCGTCTTGAA 600TTTCAATAGG TACGGACTGA TGCATTCCAC TCGAGCCTTT TTAGCTGCGT GTCCGTCTCC 660AATCGCACTT CTTTTCTTAT TTCCTTGTGG GATAAATTGA TTATTTACCG TTTCGTTTTC 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NO:5信息(ⅰ)序列特征(A)长度23碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”
(xⅰ)序列的详细情况SEO ID NO:5:GAATTCCATG GTGTCCTCGT CGG(2)SEQ ID NO:6信息(ⅰ)序列特征(A)长度24碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:6:GAATTCGAGC CGTCAGTGAG GCTC(2)SEQ ID NO:7信息(ⅰ)序列特征(A)长度27碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:7:GTTGCCATTG CTGCAGGCAT CGTGGTG(2)SEQ ID NO:8信息(ⅰ)序列特征(A)长度27碱基对(B)类核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性
(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:8:GCCGGGCCTC TTGCGGGCGT CCATTCC(2)SEQ ID NO:9信息(ⅰ)序列特征(A)长度32碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:9:CATCCGTCAC GACTTAAGAT ATCAAGCCGC GC(2)SEQ ID NO:10信息(ⅰ)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:10:CACAGGAAAC AGTCACGAC(2)SEQ ID NO:11信息(ⅰ)序列特征(A)长度18碱基对
(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:11:CGTTTTCCCA GTCACGAC(2)SEQ ID NO:12信息(ⅰ)序列特征(A)长度22碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:12:GGGCCCGGTA CCCAATTCGC CC(2)SEQ ID NO:13信息(ⅰ)序列特征(A)长度21碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:13:GATATCGGTT TATTGTGGCC G(2)SEQ ID NO:14信息(ⅰ)序列特征(A)长度38碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:14:GGTTTTTTCC ACCATGCGGC CGCAAGGTAC GTCAATTC(2)SEQ ID NO:15信息(ⅰ)序列特征(A)长度32碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:15:GACTTGGAGG AGTAGTTAAC GGCACATCAT TC(2)SEQ ID NO:16信息(ⅰ)序列特征(A)长度29碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性
(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:16:ATGCGGCCGC TAACCCTCGG GCGAGGCCC(2)SEQ ID NO:17信息(ⅰ)序列特征(A)长度22碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:17:TTAAGTCGTG ACGGATGCTT GC
权利要求
1．一种酒曲霉菌，能表达至少比野生型米曲霉CNCM I-1882多2倍的内和外肽酶。
2．权利要求1的酒曲霉菌，其在含0.2％大豆果实蛋白的基本培养基中生长时，每ml上清表达至少30mU内切肽酶活性，至少30mU亮氨酸-氨基-肽酶活性和至少10mU脯氨酰-二肽-肽酶活性。
3．权利要求1的酒曲霉菌，在5mML-谷氨酰胺存在下能表达蛋白水解活性。
4．权利要求1的酒曲霉菌，含有areA基因当霉菌在含阻遏量的L-谷氨酰胺的基本培养基中生长时不被阻遏。
5．权利要求4的酒曲霉菌，其中areA基因被截断导致C-末端截断的AREA蛋白保持功能，但当霉菌在含阻遏量的L-谷氨酰胺的基本培养基中生长时不被阻遏。
6．权利要求4的酒曲霉菌，含有整合的多拷贝areA基因。
7．权利要求5的酒曲霉菌，其中areA基因可操作的连接于至少一个能指导areA基因过表达的调节序列。
8．权利要求5或6的酒曲霉菌，其中areA基因具有有序列号11189-1604和1704-3480核苷酸或其依据遗传密码的简并性产生的功能性衍生物限定的核苷酸序列。
9．上述权利要求1-8的任何一条的酒曲霉菌，选自曲霉(Aspergillus)，根霉(Rhizopus)或毛霉(Mucor)属。
10．权利要求9的酒曲霉菌，选自菌株米曲霉CNCM I-1881,CNCM I-1883和CNCM I-1884。
11．米曲霉的一个DNA结合蛋白(AREA)，至少具有序列号2的从氨基酸1到氨基酸731或其功能衍生物的氨基酸序列。
12．含有areA基因编码权利要求11的蛋白的DNA分子。
13．权利要求12的DNA分子，是含有areA基因的载体。
14．权利要求12的DNA分子，其中areA基因可操作的连接于至少一个能指导所述基因表达的调节序列。
15．权利要求12的DNA分子，其中areA基因至少具有序列号11189-1604和1704-3480核苷酸或其依据遗传密码的简并性产生的功能性衍生物限定的核苷酸序列。
16．过量产生蛋白水解酶的方法，包括在合适的生长培养基中在合适条件下培养权利要求1-10的酒曲霉菌使霉菌表达酶，并以浓缩形式任意地分离酶。
17．利用权利要求1-10的酒曲霉菌在水解含蛋白材料中的应用。
18．权利要求17的用途，与酶和/或提供氨酰基脯氨酸酶活性的微生物相结合。
19．权利要求17或18的用途，其中含蛋白材料包括至少5mM L-谷氨酰胺。
20．包括用权利要求1-10的酒曲霉菌发酵含有蛋白和至少5mM L-谷氨酰胺的材料得到的蛋白水解产物的食物产品。
全文摘要
本发明为获得一种酒曲霉菌,能表达至少比野生型米曲霉CNCMI－1882多2倍的内切和外切肽酶,特别是在含0.2%大豆果实蛋白的基本培养基中生长时,每ml上清表达至少30mU内切肽酶活性,至少30mU亮氨酸－氨基－肽酶活性和至少10mU脯氨酰－二肽－肽酶活性。本发明也提供一种米曲霉的DNA结合蛋白(AREA),具有至少序列号2的从氨基酸1到氨基酸731或其功能衍生物的氨基酸序列。本发明包括含有编码本发明的DNA结合蛋白的areA基因的DNA分子。第四方面,本发明提供过量产生蛋白水解酶的方法,包括在合适的生长培养基中在合适条件下培养本发明的酒曲霉菌使霉菌表达酶,并以浓缩形式选择分离酶。另一方面,本发明提供利用本发明的酒曲霉菌水解含蛋白材料。最后一方面,本发明提供包括用权利要求1－10的酒曲霉菌发酵含有蛋白和至少5mM L－谷氨酰胺的材料得到的蛋白水解产物的食物产品。
文档编号C12N1/14GK1237205SQ98801287
公开日1999年12月1日 申请日期1998年5月1日 优先权日1997年7月5日
发明者P·范登布勒克, M·阿福尔特 申请人:雀巢制品公司