专利名称：蛋白质激酶及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码钙依赖性蛋白质激酶的核酸、从该核酸所生成的多肽及表达该核酸的转基因植物。
背景技术：
在植物中，对真菌性、细菌性和病毒性病原体的疾病抗性与称为过敏性反应(HR)的植物反应相关。在HR中，植物内潜在的植物病原体侵入位点经历局部细胞死亡，假定这种局部的植物细胞死亡含有侵入的微生物或病毒，则保护了植物的剩余部分。其它的植物防御反应包括植物抗毒素的生成，能防止病原体内移的裂解酶的生成和修饰细胞壁以加强其对物理及/或酶性攻击的抵抗力。
植物的HR可包括作为对入侵微生物的部分反应的植物抗毒素的生成。例如，作为对微生物侵入者，例如黄瓜角斑病假单胞菌的反应，烟草(Nicotina tabacum)产生倍半萜类。
多种组合物可用作植物中植物抗毒素合成的诱导剂。其中包括一种或多种毒性离子，例如，汞离子、其它化学上确定的组合物、代谢抑制剂、细胞壁聚糖、某些糖蛋白、某些酶、真菌孢子、脱乙酰壳多糖、某些脂肪酸和来自植物细胞壁的某些寡糖。参见，例如，Sequeira,L.(1983)微生物学年鉴，37:51-79及本文引用的参考文献。某些疫霉属类的细胞壁片断和来自绿色木霉的纤维素酶而不是日本曲霉的溶果胶酶也可诱导HR。其它植物病原体或无毒性的相关菌株的攻击也可诱导HR。
诱导素是由植物病原体和潜在的植物病原体产生的蛋白质。诱导素可诱导植物中的HR。一般来说(但未必如此)，局部细胞死亡是被感染(或被攻击)的植物组织中诱导素诱导的反应导致的。这些反应介导了对侵入的、潜在的植物病原微生物的破坏性感染的全部或部分抗性。已公开了寄生疫霉诱导素的氨基酸和核苷酸编码序列。Kamoun等(1993)，分子植物-微生物相互作用，6:573-581。
包括但不限于烟草花叶病毒的植物致病性病毒在被感染植物中诱导HR。感染植物的细菌也可诱导HR从而产生疾病抗性；诱导HR的代表性细菌包括，例如，黄单胞菌属种类和丁香假单胞菌。植物致病性真菌在攻击宿主植物后(例如，寄生疫霉和烟草霜霉对烟草宿主的攻击)，一般不诱导HR反应，但在攻击非宿主植物后可诱导HR。
涉及疾病抗性表达的信号转导机制正在研究之中，而且，一些遗传和生化特征已被列出。例如，参见Staskawicz等，科学，268:661=667(1995)。然而，信号转导途径的许多方面和许多特定成分的作用尚不十分清楚。
长期以来，在本领域一直需要保护植物，特别是庄稼植物免遭植物病原体感染的方法。从经济和环境方面的观点出发，尤其重要的是生物学或“自然”方法而不是依靠对庄稼植物施用化学药品。在本领域中还需要增强及/或提高植物中疾病抗性的植物多核苷酸序列。
发明要旨本发明的核酸以新的钙依赖性蛋白质激酶(CDPK)基因和其相应的蛋白质为基础。这些新CDPK基困表达的诱导惊人的迅速，即，在诱导剂介导的诱导植物防御反应30分钟后即可观察到这些基因的mRNA转录。因此，本文公开的新基因属于在对显示入侵植物病原体的信号做出反应中，最快被诱导的那些基因。
本文公开了一种分离的多核苷酸，它包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列和其互补序列，以及SEQ ID NO:1的RNA类似物或其互补序列。该多核苷酸也可以是长度为至少20个核苷酸，并可在严格条件下与编码图3多肽的基因组DNA杂交的上述序列的核酸片断。该多核苷酸可包括，例如，图2中核苷酸1至170，核苷酸160至560，或核苷酸550至920。
本文所公开的核酸构建体包括本发明的多核苷酸。在该构建体中，本发明的多核苷酸可与一个或多个调节该多核苷酸转录的元件(例如为了响应诸如本文所述真菌(例如，疫霉属)，细菌(例如，假单胞菌属)，或病毒(例如，烟草花叶病毒)的植物病原体而被诱导的元件)有效连接。在其它实施方案中，这种诱导由诱导剂(例如，由真菌性和细菌性诱导剂)来介导。
本发明的另一方面内容是转基因植物细胞，植物组织和已经遗传改造而含有并表达本发明的多核苷酸(例如，编码序列或反义序列)的植物。该构建体可进一步含有有效连接到该多核苷酸上的调节元件，例如，可诱导的调节元件。该植物可以是双子叶植物，例如，茄科的成员，如烟草。该植物也可以是单子叶植物，裸子植物，或松柏类植物。
本文公开的转基因植物含有一种多核苷酸，它可表达具有大约250至大约550个氨基酸的多肽。该多肽含有与图3的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。
本文公开了一种使用多核苷酸的方法。该方法包括将上述多核苷酸与来自植物的DNA或RNA杂交的步骤。该方法可进一步包括鉴定与该多核苷酸具有大约70％以上序列相同性的植物DNA或RNA片断的多个步骤，以及克隆至少一部分所述DNA或RNA片断的步骤。被克隆部分可进一步包含具有70％以上序列相同性的该片断两侧的DNA另一方面，本发明包括一种改变植物的疾病抗性的方法。该方法包括将本发明的多核苷酸导入植物细胞；并从该植物细胞得到含有该多核苷酸的植物。该多核苷酸的表达改变了植物的疾病抗性。例如，所述的核酸构建体可进一步含有与该多核苷酸有效连接的可诱导调节元件，且当该植物与诱导剂或植物病原体接触时可由该调节元件诱导表达。
在另一方面，本发明包括一种分离的多肽，它具有大约250至大约500个氨基酸，且具有与图3基本上相同的氨基酸序列。
可诱导的调节元件是能够调节与之有效连接的多核苷酸的表达的DNA序列。例如，可将与植物防御反应(例如，过敏反应)相关的CDPK基因产物与发育调节的调节元件有效连接。该术语还包括足以在响应与疾病相关的外部信号或试剂(例如，病原体或诱导剂类诱导信号和本文所述的试剂)时使得可诱导基因表达的调节元件。该术语中还包括那些在新COPK基因两侧且涉及该新基因转录被迅速诱导的调节元件。一般来说，防御反应调节元件位于基因编码区5’端，但不限于此。
“组织特异性”是指与在另一组织(例如，韧皮部)相比，在某组织(例如，木质部组织)中能优先增强基因产物(例如，rnRNA分子或多肽)的表达。“细胞特异性”是指与在另一细胞(例如，表皮细胞)相比，在一种细胞(例如，薄壁组织细胞)中能优先增强基因产物(例如，mRNA分子或多肽)的表达。
“病原体”指一种感染活植物组织细胞或与其相接触时可引起疾病的生物。“诱导剂”是能引发植物防御反应的任何分子。诱导剂的例子包括但不限于一种或多种毒性离子(例如，汞离子)，其它化学上确定的组合物、代谢抑制剂、细胞壁聚糖、某些糖蛋白、某些酶、真菌孢子、脱乙酰壳多糖、某些脂肪酸和来自植物细胞壁的某些寡糖，还有诱导素(例如，harpin、cryptogein和parasiticein)。
“有效连接”是指两个多核苷酸的连接方式使得这两个多核苷酸实现所需的功能活性，例如，将可诱导的调节序列与编码序列连接，从而在存在合适的诱导剂分子时获得基因的表达。
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语其意义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同。尽管在本发明的实施或试验中可使用相似于或相当于本文的那些方法和材料，但合适的方法和材料如下文所述。本文提及的所有出版物、专利中请、专利和其它参考文献以其全文作为参考文献引用。如有抵触，本说明书(包括定义)将会解决。另外，材料、方法和实施例仅仅是说明性的而不是限定性的。
本发明的其它特征和优点通过下面对其优选实施方案的描述及其后的权利要求书而变得显而易见。
附图简述
图1表示引物FokinB和RecalⅣ的核苷酸序列。
图2表示由烟草品种KYI4外植体产生的细胞悬浮培养物在诱导素parasiticein存在下生长后，从中分离的部分cDNA克隆的DNA序列(SEQ IDNO:1)。
图3表示从图2的DNA序列推断的氨基酸序列，使用标准单字母氨基酸代码。
图4是图3的氨基酸序列与大豆CDPK的氨基酸序列的比较图示本发明的详细说明本发明涉及在植物细胞内在响应潜在植物病原体的侵入和/或用诱导剂或模拟诱导剂类化学信号处理时被诱导的分离的多核苷酸(核酸)。该核酸总是编码钙依赖性蛋白质激酶(CDPK)多肽或CDPK相关性多肽。本文公开的新多核苷酸的诱导在时间上与植物防御反应基因的相对应，而其它CDPK基因的诱导似乎并不如此迅速。该新基因的表达的诱导比植物内涉及发育调节过程(例如，诸如花发育之类发育调节过程)基因的表达诱导更迅速。本文公开的新CDPK基因的诱导也比涉及应激反应(例如盐或水应激)的许多基因的诱导更迅速。
本发明的多核苷酸可以是RNA形式或DNA形式的，包括cDNA，合成DNA或基因组DNA。所述的DNA可以是双链或单链的，如果是单链，可以是编码链或非编码链。SEQ ID NO:1的RNA类似物可以是，例如，mRNA或是核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的组合物。
本发明的多核苷酸可编码含有与图3的氨基酸序列基本上相似或相同的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，多核苷酸可以是SEQ ID NO:1所示核酸的变体，例如，可因遗传密码子的简并性具有不同的核苷酸序但编码与图3多肽相同的氨基酸序列。
本发明的多核苷酸可进一步包括其它核酸序列。例如，编码分泌或前导氨基酸序列的核酸片断可在读码框内融合至含有图3氨基酸序列的多肽的氨基末端。本领域已知还有其它的核酸片段，可用于在阅读码框内融合到本文公开的CDPK多肽上。参见，例如美国专利5,629,193。多核苷酸可进一步包括有效连接到本文公开的CDPK多核苷酸上的一个和多个调节元件。
本发明也包括选择性地与本文公开的CDPK多核苷酸序列杂交的多核苷酸。杂交可使用Southern分析(Southern印迹)，该方法鉴定靶核酸混合物中DNA序列的存在是通过其与标记的寡核苷酸或DNA片断探针的杂交。Southern分析总是包括DNA消化产物在琼脂糖凝胶上的电泳分离，在电电泳分离后的DNA变性以及将DNA转移到硝酸纤维素、尼龙或其它合适的膜支持物上，以便如Sambrook等，(1989)分子克隆，第2版，第9.37-9.52章节(冷泉港实验室，Plainview,NY.)所述，以放射标记、生物素标记或酶标记的探针来进行分析。
多核苷酸可在中等严格条件或在高度严格条件下与本文公开的多核苷酸杂交。高度严格条件用于鉴定与探针具有高度同源性或序列相同性的核酸。高度严格条什包括在杂交中使用诸如甲酰胺的变性剂，例如，50％的甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM pH6.5的磷酸钠缓冲液(内含750mM NaCl和75mM柠檬酸钠)，42℃。另一例子使用42℃,50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl,0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt氏溶液、超声处理的鱼精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS，和10％的硫酸葡聚糖，在42℃下以0.2×的SSC和0.1％SDS洗涤。或者，也可采用低离子强度和高温来洗涤，例如，0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠(0.1×的SSC)；0.1％十二烷基硫酸钠(SDS),65℃下进行。
中等严格条件是用于鉴定与在高度严格条件下鉴定的核酸相比与探针的同源性或相同性较小的核酸的杂交条件。中等严格条件可包括使用与用与高度严格杂交所用的的离子强度和温度相比，更高的离子强度和/或更低的温度来洗涤杂交膜，例如，可在50℃下使用含有0.060MNaCl/0.0060M柠撩酸钠(4×SSC)和0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)的洗涤溶液，最后在1x的SSC中，于65℃洗涤一次。或者，可在37℃下，在用1xSSC中进行杂交洗涤。
杂交也可用Northern分析(Northern印迹)进行，该方法用于鉴定与探针杂交的RNA。探针以放射性同位素(例如32P)标记，以生物素标记或以酶标记。待分析的RNA可在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上经电泳分离，转移到硝酸纤维素，尼龙或其它合适的膜上，然后使用本领域熟知的标准技术(诸如Sambrook等，同上，第7.39-7.52章节中所述)与探针杂交。
一般来说，优选使用至少长约20个核苷酸的探针，以至少长约50个核苷酸的为佳，至少长约100个核甘酸的更好。如果要使用相对较短的探针，所述探针的核苷酸序列宜避免植物CDPK基因中的保守区域(蛋白质激酶结构域和钙结合区)，以便更容易将本文公开的迅速诱导的CDPK基因与诱导迟缓的CDPK基因、组成型CDPK基因或低水平的组成型CDPK基因相区分。然而，只有在探针中存在足够的对本文公开的新多核苷酸具有更大特异性的非保守性区域时，才能使用含该保守区域的探针。
本发明多核苷酸与SEQ ID NO:1具有至少约70％的序列相同性，以至少约80％的序列相同性为佳，至少约90％的序列相同性更好。序列相同性可被测定，例如，通过设计来完成单个和多个序列排列对齐的计算机程序来测定。在本发明中包括与SEQ ID NO:1多核苷酸具有至少约70％核苷酸序列相同性的多核苷酸，而且它们可经过在中等严格条件下杂交来鉴定。与SEQ ID NO:1的多核苷酸具有至少约80％序列相同性，或至少约90％序列相同性，或至少约95％序列相同性的多核苷酸可经过高度严格杂交来鉴定。
本发明的多核苷酸可经过化学合成、从植物基因组DNA中分离并克隆，或本领域已知的其它方法(包括使用与SEQ ID NO:1某些部分对应的寡核苷酸进行的聚合酶链反应(PCR)技术)来获得。PCR指这样一种过程或技术，在其中，靶核酸序列以类似于美国专利号4,683,95(本文引用以供参考)所述的方式，以及后来对其中所述程序的修改被扩增。一般来说，采用来自感兴趣区域的两端或之外的序列信息来设计与待扩增的模板的相反链序列相同或相似的寡核苷酸引物。PCR可用于从总基因DNA、和从总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等中扩增特异性RNA序列、特异性DNA序列。或者，预期，可使用来白图3所示CDPK序列内亲水区的肽序列制备CDPK特异性抗体，用所述抗体和本领域已知的技术来筛选cDNA文库(在表达载体内)。
几乎可在所有植物中发现本发明的新多核苷酸，包括豆科的成员(例如，大豆)、茄科的成员(例如，烟草)、芸苔科的成员(例如，拟南芥)和禾本科(Graminaceae)的成员(例如，玉米)。优造的是，本发明的多核苷酸选自茄科。
在一些实施方案中，根据核苷酸序列同源性，以及根据在经诱导剂或病原体处理后表达的迅速被诱导，从植物中鉴定并分离得到本发明的多核苷酸。例如，在中等至高度严格条件下，使用本文公开的多核苷酸探针进行的DNA:DNA杂交可从其它植物种类鉴定到相应的基因。使用在诱导防御反应后较短时间内从某组织制备的靶核酸(例如，cDNA)有利于分离出本文公开的新多核苷酸，因为该多核苷酸一般比其它CDPK基因更迅速地被诱导。
核酸构建体体包含本文公开的多核苷酸，并且一般与另一不同的多核苷酸相连。例如，全长CDPK编码序列可在读码框中有效连接到一核酸片断上，该核酸片段编码先导序列、分泌序列或其它可有效连接到多肽和肽片断上的其它氨基酸序列。
在一些实施方案中，核酸构建体包括以有义或反义方向有效连接到至少一个合适的调节序列上的本发明多核苷酸。调节序列本身一般不编码基因产物。但是，调节序列影响编码序列的表达水平。调节序列的例子在本领域是已知的，且包括但不限于最小启动子和响应诱导剂而被诱导的基因的启动子。本领域的技术人员可容易地分离得到本文公开的多核苷酸序列的天然调节并用于本发明的构建体中。合适的调节序列的其它例子包括增强子或增强子类元件、内含子、诸如聚A列的3’端非编码区，以及本文讨论的其它调节序列。用于制备这类嵌合基因分子的生物学技术在本领域是已知的。
本发明的多肽具有约250至约500个氨基酸，例如，约300个氨基酸至约508个氨基酸，或约308个氨基酸至约500个氨基酸。本发明的多肽一般含有蛋白质激酶结构域以及钙结合位点结构域。该结构域包括，例如，图3的氨基酸2至7、42至49、191至202、227至238、264至274以及297至307。
所述多肽的氨基酸序列可包括图3的推断氨基酸序列。在另一实施方案中，本发明的多肽包括与图3氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列，例如，约80％以上的序列相同性，或约90％以上的序列相同性，或约95％以上的序列相同性。一般来说，可保守性氨基酸取代或似氨基酸取代是可以耐受相，并不影响蛋白质能。相似氨基酸指那些大小或带电特征相似的氨基酸。例如，异亮氨酸和缬氨酸是相似氨基酸。在本领域中已经以许多方式评价了氨基酸对之间的相似性。例如，Dayhoff等(1978)在，蛋白质序列和结构图表集，Vol.5，增刊3,pp.345-352中提供了可用作衡量氨基酸相似性的氨基酸取代频率表。蛋白质激酶结构域和钙结合位点结构域可通过保守性取代而改变，但一般予以保留而不改变其氨基酸序列。
“分离的”多肽以不同于该多肽天然表达和生成的方式和环境而表达和生成。例如，当某多肽在细菌或真菌中表达和生成时，该多肽是分离的。同样的，当某多肽的编码基因有效连接到嵌合调节元件上并在不会天然表达该多肽的组织或种类中表达时，该多肽是分离的。另外，当某多肽的编码基因有效连接到嵌合调节元件上并在天然表达该多肽的组织中以更高的水平表达时，该多肽是分离的。本发明的多肽也可用标准纯化方法分离获得，使其具有约80％以上的纯度，或约90％以上的纯度，或约95％以上的纯度。
在一些实施方案中，本发明的多肽是含有图3推断氨基酸序列的多肽的类似物或变异体。该类似物或变异体包括基本上不改变该多肽功能的例如天然存在的等位变异体、非天然存在的等位变异体、缺失变异体和插入变异体。
本发明的多肽可包含图3所示的序列以及侧翼氨基末端和羧基末端序列，编码氨基末端和羧基末端序列的基因与含有SEQ ID NO:1核苷酸序列的基因相同。或者，嵌合多肽可如此来生成，该基因将第一CDPK基因5’区的核苷酸与第二CDPK基因3’区的核苷酸在读码框中连接，从而形成编码嵌合多肽的嵌合基因。嵌合CDPK多肽的一个说明性的例子是由如下多核苷酸表达的多肽，该多核苷酸编码大豆CDPK基因氨基末端区氨基酸1至156(图4)，后接图3的氨基酸序列，再后接同一大豆CDPK基因羧基末端区氨基酸465至508(以上全部以读码框内形式融合)。
本发明的转基因植物含有本文所述的核酸构建体。该构建体被导入植物细胞并获得至少一种转基因植物。从该转基因植物得到的种子可生长并自花授粉(或异型杂交或自花授粉)以获得该构建体纯合的植物。可分析种子以鉴定具有所需构建体表达的那些纯合子。转基因植物可列入育种计划，例如，以增加种子，将新构建体渐渗入其它品系或种类，或用于进一步选择其它所需特性。或者，转基因植物可通过对转化的植物细胞进行无性繁殖来获得，当然，这仅对于那些适用于该技术的种类而言。
本文的转基因植物也指起始转基因植物后代。后代包括特定植物或植物品系的后代，例如，在瞬间植物(instant plant)上形成的种子。瞬间植物(instant plant)的后代也包括在F1、F2、F3、及其子代植物上形成的种子，或在BC1、BC2、BC3及子代植物上形成的种子。
在一些实施方案中，转基因植物含有一个构建体，该构建体含有以有义方向有效速接到合适调节元件上的本发明的多核苷酸，从而产生有义mRNA。如果需要，为了有利于鉴定转化细胞或组织，可将可选择的标记基因插入该构建体中。
在植物中抑制新的CDPK基因也是有用的。例如，在种子庄稼收获前不久抑制CDPK基因表达可使植物病原体更容易侵入植物营养组织，从而减少对获取种子的机制造成干扰的植物生物量。CDPK基因表达的受控抑制可通过将本发明的多核苷酸以反义方向有效连接到合适的可诱导调节序列上来实现。参见，例如，美国专利5,453,566的。通过共抑制可实现同样的效果，即，新CDPK基因整个和部分编码序列在以有义方向表达可抑制相应的内源性CDPK基因。例如，参见，WO94/11516。
在一些安施方案中，核酸构建体包括有效连按到最小启动子上的本文公开的多核苷酸。当该构建体被导入植物并在其中表达时，该构建体可提供多核苷酸低水平的组成型表达，导致植物的系统防御反应增强。最小启动子含有RNA聚合酶结合和转录起动所必须的DNA序列信号。一般来说，在植物组织内，最小启动子指导的转录较少，且不对环境或发育性信号发生阳性或阴性的反应。适用于植物的最小启动子的例子是截短的CaMV35S启动子，它含35S转录单元的-90到+8区域。
可用转录调节序列来控制悬浮培养物中的基因表达。例如，含有转录起始信号、可诱导转录调节元件和转录增强元件的EAS4启动子可用来在转基因植物或悬浮细胞培养物中介导本发明所公开的编码序列的诱导型表达。参见美国专利申请系列号08/577,483。需要时，感兴趣的编码序列的表达可通过应用诱导剂或其它诱导信号来诱导。
用于本发明的转基因技术包括但不限于土壤杆菌介导的转化、电穿孔和粒子枪转化。转化技术的说明性例子可参见美国专利5,204,253(粒子枪)和美国专利5,188,958(土壤杆菌)。利用土壤杆菌种类的Ti和Ri质粒的转化方法通常使用双重型载体。Walkerpeach,C.等，植物分子生物学手册，S.Gelvin和R.Schilperoort编辑，Kluwei Dordrecht,C1:1-19(1994)。
在一些实施方案中，可诱导的转录调节序列可偶联到在植物中有功能的启动子序列上，两者都与本发明的多核苷酸有效连接。当，所述的调节元件偶联到启动子上时，通常使用载短的(或最小)启动子，例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)d截短的S3启动子。也可使用其它组成型启动子的截短式，例如，根癌土壤杆菌T-DNA基因(如，nos、cos)。
将DNA导入单子叶和双子叶植物的技术是本领域众所周知的，培养这些植物组织和再生这些组织的技术也是如此。已成功转化和再生的单子叶植物包括小麦、玉米、黑麦、水稻和芦笋。参见，例如，美国专利5,484,956和5,550,318。已制备了转基因白杨(aspen)组织且再生了转基植物。并已转化了白杨(poplar)。处理，转化和再生裸子植物的技术也是已知的。参见，例如，美国专利号5,122,466和5,041,382。
根据本发明的方法包括将核酸构建体导入植物细胞，并从这种被转化的细胞生成植物。存在于构建体内的多核苷酸的表达改变了植物的疾病抗性表型，例如，赋予植物新的疾病抗性表型或增强已有的疾病抗性表型。
疾病抗性表型涉及转基因植物中宿主防御反应的水平和时间。表明疾病抗性的试验已被改变成一般包括对转基因植物应用可常规诱导防御反应的化合物，以及平行地给对照植物应用相同化合物。对照植物一般与导入新核酸构建体的植物来自相同的亲本品系。当转基因植物中的抗性水平高于对照植物中的相应抗性时，本发明的多核苷酸的表达增强了或赋予了植物疾病抗性。参考具体病原体，例如，疫霉属种类，可测量疾病抗性。也可参考数种病原体类测量疾病抗性以鉴定系统防御反应的增强。
如果需要诱导转基因植物表达与诱导介导的调节元件有效连接的CDPK编码序列，诱导剂一般必须穿透植物的外皮以产生诱导效果。可使植物组织受伤来利于或允许诱导剂被吸收进植物组织。许多种类的诱导组合物，包括诱导剂和其它化学信号(例如乙烯和茉莉酮酸甲醋的组合物)可有效用于诱导表达。
使用本发明的多核苷酸的方法包括将该多核苷酸与来自植物的DNA或RNA杂交的步骤。杂交可如前文所述进行。该方法可进一步包含鉴定与该多核苷酸具有显著程度的序列相同性(例如，70％的序列相同性，以80％序列相同性、90％妁序列相同性或95％的序列相同性为佳)的植物DNA或RNA片断的步骤。通过电泳分离植物DNA或RNA，并使用经标记的多核苷酸探针，导致在同源片断位置产生可见带，如此可鉴定该片断。片断可通过例如物理剪切或经限制性核酸内切酶消化来产生。片断长度可短至100bp(核苷酸)，但典型的片断至少为1000bp,且可以是10,000bp以上。
该方法可进一步包括克隆至少部分DNA或RNA片断的步骤(包括但不限于同源片断的侧翼DNA)。该侧翼DNA可包括启动子、增强子、转录调节元件和聚A序列。侧翼DNA可以在同源片断的5’末端或者3’末端，且宜包括编码序列前的300或600，或1000bp的DNA，因为调节元件一般存在于这一范围内。
本文公开的新多核苷酸侧翼的启动子和其它诱导剂或病原体反应性调节元件特别有用，因为在用病原体和诱导剂处理后，这些元件非常迅速地诱导基因的表达。这些调节元件可有效连接到有用的基因上，从而迅速生成所需的化合物。例如，该调节元件可用于启动编码抗体、血液凝集因子、抗原肽、病毒复制酶或衣壳蛋白，和涉及次级代谢物合成(例如类异戊二烯的生物合成)的酶的基因的表达。参见，例如，美国专利5612487美国专利杓5484719；和1995年12月22日申请的美国专利08/577483。
将具有诱导剂或病原体反应元件的嵌合基因导入植物后，可用合适的病原体或诱导剂诱导嵌合基因产物的表达。于是，迅速生成所需的基因产物(或其酶促终产物)，然后可获得所需产物。
下面的实施例将进一步描述本发明，但它不会限制权利要求书所限定的本发明范围。
实施例下面的实施例在植物组织重组DNA的操作中，在转基因植物的培养和再生中使用了许多分子生物学领域技术人员熟知且理解的技术。酶从商业来源获得并根据制造商的建议或本领域已知的其它变化使用。试剂、缓冲液和培养条件也是本领域已知的。所用的缩写和命名在本领域是标准的，且常用于专业杂志中，例如本文所引用的那些杂志中。
实施例1烟草CDPK cDNA的克隆通过在大肠杆茵细胞中表达疫霉属parA1基因和从壁膜间隙分离基因产物制备诱导剂parasiticein。
基本上按照Xu,J.等，遗传学动态10:226-227(1994)所述，从菌丝体分离疫霉属O族的基因组DNA。剪切DNA并用作PCR扩增parA1基因的模板，使用根据Kamoun,S.等，分子植物-微生物相互作用，6:573-581(1993)报导的parA1序列设计的引物。将parA1 PCR产物克隆进pBluescript(Stratagene,San Diego,CA)，并使用双脱链终止法经过双链DNA测序确定该产物的序列。
利用PCR扩增pBluescript内的parA1插入片段，该PCR使用产生N端组氨酸标记和基因5’末端的蛋白质位点的引物。将PCR产物连接到表达载体pET28b(Novagen,Madison,WI)中，在证实parA1融合物的DNA序列后，将pET28b构建体转化进大肠杆菌BL21内。
含有parA1融合物的BL21培养物在卡那霉素存在下，于37℃生长至OD600值达0.3。加入IPTG(1mM)，培养物再在27℃培养5小时。
基本上按照Ausubel,P.等在分子生物学常用方法，John Wiley&Sons,NewYork(1989)所述，利用渗透休克制备周质蛋白。离心收获细胞(1.5ml)，重悬于500μl的50mM Tris-HCl,pH8.0,20％蔗糖、1mM EDTA中，并在室温下振荡培养10分钟。离心后，沉淀重悬于200μl冰冷的MgSO4中，并在4℃振荡培养10分钟。离心混合物，所得上清液(含周质蛋白质)上样在Ni++柱上。根据厂家说明书，从柱中纯化parA1蛋白质。以Bradford方法测定parA1提取物中的蛋白质浓度。
在迅速生长期，以2μg/ml终浓度的parasiticein处理烟草变种(Nicotianatabacum L.cv.)KY14细胞悬浮培养物，以诱导应激反应基因。未用parasiticein处理的平行悬浮细胞培养物用作对照。加入诱导剂后0、30、60和120秒后经温和的真空抽滤收集细胞。
从处理的和未处理的烟草细胞分离总RNA，并用作靶向区别展示逆转录酶PCR(TDDR-PCR)的模板。用来自Invitrogen的cDNA循环试剂盒(San Diego,CA)产生第一链cDNA。然后将第一链cDNA用作PCR的模板。除使用58℃的退火温度外，使用在PCR方法方法和应用指南，Innis,M.,Gelfand,D.,Sminsky,J.和White,T.编辑，学术出版公司，San Diego,CA(1990)中所述的典型条件进行PC反应。PCR引物为FokinB(GTTGACTCCCTACCCTCTT)RecalⅣ(GGTACTTAGGAAGTGTTACGGG)。参见图1。在1％(w/w)琼脂糖凝胶上电泳分离PCR产物，从处理了60分钟的培养物中得到的大于约800碱基对(bp)的产物经电洗脱到DE-81滤纸(Whatman)上而被纯化。用Klenow聚合酶补齐纯化的PCR产物末端，连接到pBluescript中的EcoRV位点，并转化进大肠杆菌TBl。
筛选氨苄青霉素抗性的TBl菌落，确认存在插入pBluescript内的≥800bp的DNA片断。根据Sanger等，(1977)美国科学院学报，74:8073-8077所述的双脱氧核苷酸链终止法，用来自美国生化公司(Cleveland,OH)的Sequennase试剂盒或自动荧光基础系统(应用生物系统，Foster City,CA)，确定了一段这类插入片段的序列。在两条链上测定了载体中插入片的序列。含有该插入片断的质粒命名为pCDPK-1。
pCDPK-1中插入片断的核苷酸序列显示在图2中，该插入片断的推断氨基酸序列显示在图3中。将推断氨基酸序列与GenBank,EMBL和瑞士Prot数据库中的植物基因的氨基酸序列进行了比较。发现与植物CDPK多肽(包括来自橹豆、拟南芥、Vigna radiaia、玉米和西葫芦的多肽具有同源性。
使用BLASTP程序和BLOSUM62计分模板，在多肽的氨基末端部分鉴定了与丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶结构域同源的两个区域，在多肽的羧基末端部分鉴定了与Ca++结合结构域同源的四个区域。图4显示了图3的氨基酸序列与大豆CDPK氨基酸序列(Genbank登记号NO:M64987)的比较。烟草钙结合位点的氨基酸序列与大豆CDPK中相应位点的氨基酸序列相似。然而，在该序列的其它部分有明显的区别。比较显示，大豆CDPK和CDPK-1之间存在约伯75％的总序列相同性。
BLASTN程序用于比较pCDPK-1核苷酸序列与各种数据库中的核酸序列。根据其它植物CDPK基因的核酸序列和由其编码的多肽长度，估计存在于pCDPK-1内的核酸插入片断缺少约560bp的5bp的CDPK-15’端编码序列和约130bp的CDPK-13’端编码序列。
实施例2分离全长cDNA克隆为了获得全长克隆，使用RACE(cDNA末端快速扩增法)方案，用诱导剂诱导后从烟草细胞制备的聚A+RNA作为模板。按实施例1该制备聚A+RNA。
具有序列GAC AAG GAC GGG AGT GGG TAT(引物A,CDPK-1内部)的引物和具有序列GAC TCG AGT CGA CAT CGA TTT TTT TTT TTT TTTTT(dT17衔接引物)的引物用于扩增CDPK编码序列的3’末端。逆转录酶反应在含2μl 10XRTC缓冲液、10单位RNA酶蛋白抑制剂(RNasin)(Promega Biotech)、0.5μgdT17衔接引物和10单位AMV逆转录酶(生命科学)在3.5μl的总体积中进行，如Frohman,M.，在PCR方法方法和应用指南(出处同上)，pp.28-38中所述。PCR扩增反应在5μl 10XPCR缓冲液、5μl DMSO、5μl 10X dNTPs(各为15mM)、30μl H2O、1μl衔接引物(25pmol,GAC TCG AGT CGA CAT CG)、1μl引物A和1-5μl cDNA中进行。循环次数如Frohman(出处同上)同所述。
使用10pmol引物B(AGG GGC TAC GTA GTA AGG ACT)代替dT17衔接引物，按上文所述进行逆转录来克隆CDPK偏码序列的5’端。按Frohman(出处同上)所述，使用末端转移酶和dATP延伸cDNA产物，然后用1pmole dT17衔按引物、10pmole衔接引物和10pmole引物C(ATT CTC AGG CTT AAG GTC CCT)按上文所述通过PCR来浙增。在标准条件下进行PCR(Back等，(1994)生物化学和生物物理学集刊(Arch.Biochem.Biophys.)315:523-532)。扩增的3’端和5’端产物经平端克隆进Bluescript SK(Stratagene)，并使用常规分子生物学技术与pCDPK-1插入片断组合以形成烟草CDPK编码序列的全长cDNA。
按实施例1所述，以双脱氧核苷酸链终止法测定全长cDNA的DNA序列。
实施例3在烟草悬浮培养物中诱导CDPK同源性RNA将pCDPK-1中的DNA插入片断用作探针，以跟踪响应诱导剂的基因表达的诱导。按实施例1所述，用parasiticein处理烟草变种(Nicotiana tabacum L.cv.)KY14细胞悬浮培养物0、1/2、1、2、6和12小时.分离总RNA并在1％琼脂糖凝胶上电泳。以随机引物法放射性标记pCDPK-1插入片断，并如Sambrook,J.等所述(出处同上)与凝胶分离的RNA杂交。在诱导剂处理前检测不到与CDPK-1杂交的mRNA，而在诱导剂处理后1/2、1和2小时可容易地检测到与CDPK-1杂交的mRNA。在诱导剂处理后6和12小时不能检测到与CDPK-1杂交的mRNA，表明到大约6小时时，CDPK-1)基因的表达已降低到检测不到的水平。
实施例4嵌合CDPK基因的构建用化学合成的编码图6大豆CDPK氨基酸1至156的DNA，化学合成的编码图6大豆CDPK氨基酸465-508d DNA，和pCDPK-1的CDPK插入片断构建一CDPK基因。以常规分子生物学技术连接这三段DNA以形成一嵌合CDPK编码序列，该序列在氨基末端具有大豆CDPK氨基酸1至156，在读码框内融合到烟草CDPK氨基酸1至307(图3)，后者再在读码框内融合到在大豆CDPK羧基末端的氨基酸465至508上。
将嵌合编码序列以有义方向插入含有最小35S和EA34可诱导调节元件的土壤杆菌双重载体中。通过测定连接区的DNA序列和在转基因植物中的表达来证实调节元件、启动子和编码序列的有效连接。
实施例5转基因植物的生产使用改良的根癌土壤杆菌转化方案生产转化的植物细胞系。制备含有实施例3的全长CDPK cDNA或实施例4的嵌合CDPK编码序列的核酸构建体。含有待导入植物的序列的重组构建体经过与大肠杆菌TBl(pRK201)进行三亲杂交转移进根癌土壤杆菌茵株GV3850中。将各生长阶段的烟草叶切成1cm2的小片并浸入土壤杆菌细胞悬液(约104至105个细胞/ml)中。3至10分钟后，在无菌水中洗涤叶片以去掉多余的细菌细胞，并减少因多余的细菌在经处理叶片上生长而产生的问题。经过短时间(30至60秒)干燥后，将处理过的叶片放入无抗生素的植物组织培养基的表面以促进组织感染和DNA从细菌到植物组织的转移。每升植物组织培养基含有4.31g Murashige和Skoog基础盐混合物(Sigma化学公司，St.Louis,MO)、2.5mg苄氨基嘌呤(溶于1N的NaOH内)、10ml的1mg/ml吲哚乙酸溶液、30g蔗糖、2ml Gamborg氏维生素溶液(Sigma化学公司，St.Louis,MO)和8g琼脂。用NaOH将pH调至5.5至5.9之间。2天后，将叶片转移进含300μg/ml卡那霉素、500μg/ml头孢西丁(Merck,Rahu,ay,NJ)的植物组织培养基中。卡那霉素选择转化的植物组织，头孢西丁送择抗土壤杆菌的植物组织。
如果使用病原体诱导的调节元件，在转化程序期间必须尽可能减少外植体组织与土壤杆菌细胞的接触，因为在导入植物细胞后土壤杆菌细胞本身可诱导该元件。因此，用于在可诱导的转录调节元件调节控制下导入含有细胞自杀基因的DNA的生物倾向(biolistic)技术是一种有用的可选择的转化技术，因为它不必使用土壤杆菌细胞或真菌细胞壁消化醣(对于产生用于电穿孔的原生质体是必需的)，两种酶都可在所述的调节元件控制下诱导编码序列。
基本上按Horsch等，(1985)科学227:1229-1231所述再生转基因植物。
实施例6转基因烟草中嵌合CDPK基因由诱导剂和病原体诱导的表达在用诱导剂或病原体处理的转基因烟草植物中测量实施例7的CDPK构建体的活性。作为对照，生产了在花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子控制下表达GUS报道基因的转基因烟草植物。来自再生的转基因烟草植物的F1种子在含100mg/K卡那霉素的培养基上发芽。随后将所得抗卡那霉素植物转移进土壤并在温室中生长。在诱导条件下(例如通过对转基因植物细胞间施用诱导剂或纤维素酶)，对半数植物检测了其CDPK基因的表达。诱导剂或纤维素酶用机械移液器施用。作为对照，用无纤维素酶或诱导剂的溶液模拟处埋其余植物。在有些实验中用解剖刀刺伤烟草组织以利于与诱导化合物接触。
实施例7CDPK同源序列的鉴定按Murray和Thompson(1980)在核酸研究8:4321-4325中所述分离烟草叶基因组DNA。用所需限制性内切醣消化等分试样后，经消化的DNA样品在0.8％琼脂糖凝胶上电泳，将大小分离的DNA转移至尼龙膜上。DNA印迹与经随机引物法放射性标记的实施例1的900bp CDPKcDNA插入片断杂交。杂交在66℃，0.25M磷酸钠缓冲液、pH8.0、0.7％SDS、1％牛血清白蛋白和1mMEDTA中进行。然后在45℃用2X的SSC、0.1％SDS洗涤印迹两次，并用0.2X的SSC、0.1％0SDS(1X的SSC是0.15M的NaCl,0.015M柠檬酸钠，pH7..0)洗涤两次。用图象测密计(video densitometer)(MilliGen/Biosearch,Ann Arbor,MI)从反射自显影图上估计膜上各带的相对杂交强度。
为了鉴定与烟草CDPK具有同源序列的多核苷酸，且为了确定每个基因组中这些序列的表观拷贝数，使用分离自其它植物种类的靶DNA和烟草CDPK探针进行Southern杂交实验。被限制性核酸内切醣消化的各种植物种类的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳(0.8％琼脂糖)分离，然后转移到Hybond-N+膜(AmershamCorp.,Arlington Heights,IL)上。含有pCDPK-1编码序列的放射性标记的探针片断与消化的基因组DNA杂交，基本上按照Sambrook等(i989)(出处同上)所述。使用中等严格条件(在4X的SSC、65℃下杂交，最后一次洗涤在1X的SSC,65℃下进行)。
或者，使用靶基因组DNA作模板和来自pCDPK-1编码序列高度保守区的引物进行PCR。
实施例8CDPK编码序列侧翼的基因组DNA将实施例1所述的cDNA克隆用作杂交探针来筛选在λEMBL3载体(Clontech,Palo Alto,CA)中的N.tabacum cv.NK326基因组文库。与实施例1的烟草CDPK具有70％以上序列相同性的基因组DNA克隆使用常规亚克隆方法来鉴定。使用常规DNA测序方法测定克隆的核酸插入片断的核苷酸序列。
一个基因组DNA克隆具有包含实施例1烟草CDPK编码序列的全长编码序列。该克隆还含有与实施例1的编码序列5’端毗邻的DNA。检查该克隆中5’端侧翼DNA的核苷酸序列揭示了严格推断ATG起始密码子以及一个或多个推断的在起始岔码子上游约1000bp内的调节元件。
其它实施方案应该理解，尽管结合其详细描述已描述了本发明，但上面的描述是用于说明而不是限制本发明的范围的，木发明的范围油所附请权利要求书的范围来限定。其它方面，优点和修改均属于权利要求书的范围内。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人肯塔基大学研究基金会(ⅱ)发明名称蛋白质激酶及其用途(ⅲ)序列数目11(ⅳ)通讯地址(A)地址Fish&Richardson P.C.,P.A.
(B)街道60 South Sixth Street,Suite 3300(C)城市Minneapolis(D)州MN(E)国家USA(F)邮编55402(ⅴ)计算机可读形式(A)媒质类型软盘(B)计算机IBM兼容机(C)操作系统DOS(D)软件FastSEQ for Windows Version 2.0(ⅵ)当前申请信息(A)申请号(B)申请日(C)分类(ⅶ)在先申请信息(A)申请号PCT/US98/14109(B)申请日07-JUL-1998(ⅷ)在先申请信息(A)申请号08/889,655(B)申请日08-JUL-1997(ⅷ)律师/代理人信息(A)姓名Lundquist,Ronald C(B)注册编号37,875(C)参考文献/档案编号07678/020CN1(ⅸ)电讯信息(A)电话612-335-5050(B)传真612-288-9696(C)电传(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度921碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:AGGGACCTTA AGCCTGAGAA TTTCCTTTTC AGTGCCGACG ACTTCATGGT AAAGAGTAAG 60GCCACCGACT TCGGGCTTAG TGTATTCTAT AAGCCTGGGC AAAAGTTCAC GGACATAGTA 120GGGAGTCCTT ACTACGTAGC CCCTGAGGTA CTTAGGAAGT GTTACGGGCC TGGGAGTGAC 180GTATGGAGTG CCGGGGTAAT ACTTTACACC CTTCTTTGTG GGGCCCCTCC TTTCATGGCC 240GACAGTGAGC CTGGGGTAGC CCTTCAAATA CTTCATGGGG ACCTTGACTT CAAGAGTGAC 300CCTTGGCCTA CCATAAGTGA GAGTGCCAAG GACCTTATAA GGAAGATGCT TGAGCAAGAC 360CCTAAGAGGA GGCTTACCGC CCATGAGGTA CTTAGGCATC CTTGGATAGT AGACGAGAAT 420ATAGCCCCTG ACAAGCCTCT TGGGCCTGCC GTACTTAGTA GGCTTAAGCA ATTCAGTGCC 480ATGAATAAGA TAAAGAAGAT GGCCCTTAGG GTAATAGCCG AGAGGCTTAG TGAGGAGGAG 540ATAGTAGGGC TTAAGGAGAT GTTCAAGATG GACACCGACA ATAGTGGGAC CGTAACCTTC 600TTCCATCTTA AGCAAGGGCT TAAGAGGGTA GGGAGTCAAC TTGGGGAGAG TGAGATAAAG 660GACCTTATGG ACGCCGCCGA CGTAGACAAT AGTGGGACCA TAGACTATGG GGAGTTCGTA 720ACCGCCGCCA TGCATCTTAA TAAGATAAAG AGGGAGGACC ATCTTGTAAG TGCCTTCAGT 780TATCATGACA AGGACGGGAG TGGGTATATA GAGGTAGACG AGCTTAGGCA AGCCCTTGAG 840GAGTTCGGGG TACCTGACAC CAGTCTTGAG GACATGATAA AGGAGGTAGA CACCGACAAT 900GATGGGCAAA TAGATTATGG G 921(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度307氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Phe Leu Phe Ser Ala Asp Asp Phe Met1 510 15Val Lys Ser Lys Ala Thr Asp Phe Gly Leu Ser Val Phe Tyr Lys Pro20 25 30Gly Gln Lys Phe Thr Asp Ile Val Gly Ser Pro Tyr Tyr Val Ala Pro35 40 45Glu Val Leu Arg Lys Cys Tyr Gly Pro Gly Ser Asp Val Trp Ser Ala50 55 60Gly Val Ile Leu Tyr Thr Leu Leu Cys Gly Ala Pro Pro Phe Met Ala65 70 75 80Asp Ser Glu Pro Gly Val Ala Leu Gln Ile Leu His Gly Asp Leu Asp8590 95Phe Lys Ser Asp Pro Trp Pro Thr Ile Ser Glu Ser Ala Lys Asp Leu100 105 110Ile Arg Lys Met Leu Glu Gln Asp Pro Lys Arg Arg Leu Thr Ala His115 120 125Glu Val Leu Arg His Pro Trp Ile Val Asp Glu Asn Ile Ala Pro Asp130 135 140Lys Pro Leu Gly Pro Ala Val Leu Ser Arg Leu Lys Gln Phe Ser Ala145 150 155 160Met Asn Lys Ile Lys Lys Met Ala Leu Arg Val Ile Ala Glu Arg Leu165 170 175Ser Glu Glu Glu Ile Val Gly Leu Lys Glu Met Phe Lys Met Asp Thr180 185 190Asp Asn Ser Gly Thr Val Thr Phe Phe His Leu Lys Gln Gly Leu Lys195 200205Arg Val Gly Ser Gln Leu Gly Glu Ser Glu Ile Lys Asp Leu Met Asp210 215220Ala Ala Asp Val Asp Asn Ser Gly Thr Ile Asp Tyr Gly Glu Phe Val225 230 235240Thr Ala Ala Met His Leu Asn Lys Ile Lys Arg Glu Asp His Leu Val245 250 255Ser Ala Phe Ser Tyr His Asp Lys Asp Gly Ser Gly Tyr Ile Glu Val260 265 270Asp Glu Leu Arg Gln Ala Leu Glu Glu Phe Gly Val Pro Asp Thr Ser275 280 285Leu Glu Asp Met Ile Lys Glu Val Asp Thr Asp Asn Asp Gly Gln Ile290 295 300Asp Tyr Gly305(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度22碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:GGTACTTAGG AAGTGTTACG GG 22(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:GTTGACTCCC TACCCTCTT 19(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度512氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:Met Ala Ala Lys Ser Ser Ser Ser Ser Thr Thr Thr Asn Val Val Thr1 5 10 15Leu Lys Ala Ala Trp Val Leu Pro Gln Arg Thr Gln Asn Ile Arg Glu20 25 30Val Tyr Glu Val Gly Arg Lys Leu Gly Gln Gly Gln Phe Gly Thr Thr35 40 45Phe Glu Cys Thr Arg Arg Ala Ser Gly Gly Lys Phe Ala Cys Lys Ser50 55 60Ile Pro Lys Arg Lys Leu Leu Cys Lys Glu Asp Tyr Glu Asp Val Trp65 70 75 80Arg Glu Ile Gln I1e Met His His Leu Ser Glu His Ala Asn Val Val85 90 95Arg Ile Glu Gly Thr Tyr Glu Asp Ser Thr Ala Val His Leu Val Met100 105 110Glu Leu Cys Glu Gly Gly Glu Leu Phe Asp Arg Ile Val Gln Lys Gly115120 125His Tyr Ser Glu Arg Gln Ala Ala Arg Leu Ile Lys Thr Ile Val Glu130 135 140Val Val Glu Ala Cys His Ser Leu Gly Val Met His Arg Asp Leu Lys145 150 155 160Pro Glu Asn Phe Leu Phe Asp Thr Ile Asp Glu Asp Ala Lys Leu Lys165 170 175Ala Thr Asp Phe Gly Leu Ser Val Phe Tyr Lys Pro Gly Glu Ser Phe180 185 190Cys Asp Val Val Gly Ser Pro Tyr Tyr Val Ala Pro Glu Val Leu Arg195 200 205Lys Leu Tyr Gly Pro Glu Ser Asp Val Trp Ser Ala Gly Val Ile Leu210 215 220Tyr Ile Leu Leu Ser Gly Val Pro Pro Phe Trp Ala Glu Ser Glu Pro225 230 235 240Gly Ile Phe Arg Gln Ile Leu Leu Gly Lys Leu Asp Phe His Ser Glu245 250 255Pro Trp Pro Ser Ile Ser Asp Ser Ala Lys Asp Leu Ile Arg Lys Met260 265 270Leu Asp Gln Asn Pro Lys Thr Arg Leu Thr Ala His Glu Val Leu Arg275 28O 285His Pro Trp Ile Val Asp Asp Asn Ile Ala Pro Asp Lys Pro Leu Asp290 295 300Ser Ala Val Leu Ser Arg Leu Lys Gln Phe Ser Ala Met Asn Lys Leu305 310 315 320Lys Lys Met Ala Leu Arg Val Ile Ala Glu Arg Leu Ser Glu Glu Glu325 330 335Ile Gly Gly Leu Lys Glu Leu Phe Lys Met Ile Asp Thr Asp Asn Ser340 345 350Gly Thr Ile Thr Phe Asp Glu Leu Lys Asp Gly Leu Lys Asp Gly Leu355 360 365Lys Arg Val Gly Ser Glu Leu Met Glu Ser Glu Ile Lys Asp Leu Met370 375 380Asp Ala Ala Asp Ile Asp Lys Ser Gly Thr Ile Asp Tyr Gly Glu Phe385 390 395 400Ile Ala Ala Thr Val His Leu Asn Lys Leu Glu Arg Glu Glu Asn Leu405 410 415Val Ser Ala Phe Ser Tyr Phe Asp Lys Asp Gly Ser Gly Tyr Ile Thr420 425 430Leu Asp Glu Ile Gln Gln Ala Cys Lys Asp Phe Gly Leu Asp Asp Ile435 440 445His Ile Asp Asp Met Ile Lys Glu Ile Asp Gln Asp Asn Asp Gly Gln450 455 460Ile Asp Tyr Gly Glu Phe Ala Ala Met Met Arg Lys Gly Asn Gly Gly465 470 475 480Ile Gly Arg Arg Thr Met Arg Lys Thr Leu Asn Leu Arg Asp Ala Leu485 490 495Gly Leu Val Asp Asn Gly Ser Asn Gln Val Ile Glu Gly Tyr Phe Lys500 505 510
(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度21碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:GACAAGGACG GGAGTGGGTA T 21(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度35碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:GACTCGAGTC GACATCGATT TTTTTTTTTT TTTTT 35(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:GACTCGAGTC GACATCG 17(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)长度21碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:AGGGGCTACG TAGTAAGGAC T 21(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)长度21碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:ATTCTCAGGC TTAAGGTCCC T 21(2)SEQ ID NO:11的信息
(ⅰ)序列特征(A)长度308氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Phe Leu Phe Ser Ala Asp Asp Phe Met1 5 10 15Val Lys Ser Lys Ala Thr Asp Phe Gly Leu Ser Val Phe Tyr Lys Pro20 25 30Gly Gln Lys Phe Thr Asp Ile Val Gly Ser Pro Tyr Tyr Val Ala Pro35 40 45Glu Val Leu Arg Lys Cys Tyr Gly Pro Gly Ser Asp Val Trp Ser Ala50 55 60Gly Val Ile Leu Tyr Thr Leu Leu Cys Gly Ala Pro Pro Phe Met Ala65 70 75 80Asp Ser Glu Pro Gly Val Ala Leu Gln Ile Leu His Gly Asp Leu Asp85 90 95Phe Lys Ser Asp Pro Trp Pro Thr Ile Ser Glu Ser Ala Lys Asp Leu100 105 110Ile Arg Lys Met Leu Glu Gln Asp Pro Lys Arg Arg Leu Thr Ala His115 120 125Glu Val Leu Arg His Pro Trp Ile Val Asp Glu Asn Ile Ala Pro Asp130 135 140Lys Pro Leu Gly Pro Ala Val Leu Ser Arg Leu Lys Gln Phe Ser Ala145 150 155 160Met Asn Lys Ile Lys Lys Met Ala Leu Arg Val Ile Ala Glu Arg Leu165 170 175Ser Glu Glu Glu Ile Val Gly Leu Lys Glu Met Phe Lys Met Ile Asp180 185 190Thr Asp Asn Ser Gly Thr Val Thr Phe Phe His Leu Lys Asp Gly Leu195 200 205Lys Arg Val Gly Ser Gln Leu Gly Glu Ser Glu Ile Lys Asp Leu Met210 215 220Asp Ala Ala Asp Val Asp Asn Ser Gly Thr Ile Asp Tyr Gly Glu Phe225 230 235 240Val Thr Ala Ala Met His Leu Asn Lys Ile Lys Arg Glu Asp His Leu245 250 255Val Ser Ala Phe Ser Tyr His Asp Lys Asp Gly Ser Gly Tyr Ile Glu260 265 270Val Asp Glu Ile Arg Gln Ala Leu Glu Glu Phe Gly Val Pro Asp Thr275 280 285Ser Leu Glu Asp Met Ile Lys Glu Val Asp Thr Asp Asn Asp Gly Gln290 295 300Ile Asp Tyr Gly30权利要求
1．一种分离的多核苷酸，该多核菅酸含有a)核苷酸序列SEQ ID NO:1；b)SEQ ID NO:1的RNA类似物；c)含有与a)或b)互补的核酸序列的多核苷酸；或d)长度为至少20个核苷酸且在严格条件下与编码图3多肽的基因组DNA杂交的a)、b)或c)的核酸片断。
2．如权利要求1所述的多核苷酸，其中该多核苷酸含有图2中的核苷酸1至170。
3．如权利要求1所述的多核苷酸，其中该多核苷酸含有图2中的核苷酸160至560。
4．如权利要求1所述的多核苷酸，其中该多核苷酸含有图2中的核苷酸550至920。
5．一种含有如权利要求1所述的多核苷酸的核酸构建体。
6．如权利要求5所述的核酸构建体，进一步包括有效连接到该多核苷酸上的调节元件。
7．如权利要求6所述的核酸构建体，其中该调节元件是可诱导的调节元件。
8．如权利要求7所述的核酸构建体，其中该调节元件在响应植物病原体时被诱导。
9．一种转基因植物，包含含有如权利要求1所述的多核苷酸的核酸构建体。
10．如权利要求9所述的植物，其中的构建体进一步包括有效连接到所述多核苷酸上的调节元件。
11．如权利要求10所述的植物，其中的调节元件是可诱导的调节元件。
12．如权利要求11所述的植物，其中所述的调节元件在响应植物病原体时被诱导。
13．如权利要求11所述的植物，其中所述的调节元件在响应诱导剂时被诱导。
14．如权利要求9所述的植物，其中的植物是双子叶植物。
15．如权利要求14所述的植物，其中的植物属于茄科。
16．如权利要求15所述的植物，其中的植物是烟草属植物。
17．如权利要求16所述的植物，其中的植物是烟草。
18．一种转基因植物，它含有表达一种具有250到550个氨基酸的多肽的多核苷酸，该多肽含有与图3的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。
19．如权利要求18所述的植物，其中的多肽含有图3的氨基酸序列。
20．如权利要求18所述的植物，其中的植物是双子叶植物。
21．如权利要求20所述的植物，其中的植物属于茄科。
22．一种使用多核苷酸的方法，包含将如权利要求1所述的多核苷酸与来自植物的DNA或RN4杂交的步骤。
23．如权利要求22所述的方法，进一步包含鉴定与所述多核苷酸具有大约70％以上序列相同性的所述植物DNA或RNA片断的步骤。
24．如权利要求23所述的方法，进一步包括克隆至少一部分所述DNA或RNA片断的步骤。
25．如权利要求24所述的方法，其中所述的被克隆部分进一步包含具有70％以上序列相同性的该片断两侧的DNA。
26．一种改变植物中疾病抗性的方法，该方法包括下列步骤(a)将如权利要求5所述的核酸构建体导入植物细胞；和(b)从所述细胞生成含有该多核苷酸的植物，其中所述多核苷酸的表达改变了该植物的疾病抗性。
27．如权利要求26所述的方法，其中所述的核酸构建体进一步含有与该多核苷酸有效连接的可诱导的调节元件，且通过所的述调节元件调节所述的表达。
28．如权利要求27所述的方法，其中所述的表达在所述植物与诱导剂或植物病原体接触时通过所述调节元件被诱导。
29．一种具有250至550个氨基酸的分离的多肽，所述的多肽含有与图3基本上相同的氨基酸序列。
30．如权利要求29所述的多肽，其中所述多肽含有图3的氨基酸序列。
全文摘要
本发明提出一种在病原体侵入或诱导剂处理时被诱导的核酸分子。该分子在植物、植物组织和植物细胞中对于可诱导基因的表达和改变植物的疾病抗性表型发挥功能。该分子是钙依赖性蛋白质激酶基因的序列或与其相关。本发明还公开了获得含有该核酸分子的转基因植物的方法和使用该分子的方法。本文也公开了由该核酸编码的多肽。
文档编号C12N15/82GK1234831SQ98800943
公开日1999年11月10日 申请日期1998年7月7日 优先权日1997年7月8日
发明者M·F·G·吕松, J·查普尔 申请人:肯塔基大学研究基金会