专利名称：一种蛋白质及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于预防和治疗脓毒症的蛋白质，具体地说是一种同活化C蛋白功能相似的用于预防和治疗脓毒症的蛋白。
背景技术：
脓毒症是严重创伤、烧伤、休克、大手术后常见的并发症，是导致人类死亡的一常见病种，它有极高的发病率和死亡率。(Alerti C，Brun-Buission C，Burchardi H，etal.Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentercohort study[J].Intensive Care Med，2002，28(2)108-121.)脓毒症是指由感染或者有高度可疑感染灶引起的全身炎症反应综合症，其病原菌包括细菌、真菌、寄生虫及病毒等，临床症状包括但不限于(1)体温＞38℃或＜36℃；(2)心率＞90次/分钟；呼吸＞20次/分钟或PaCO2＜32mm Hg；(4)外周血白细胞计数＞12×109/L，＜4×109/L或成熟粒细胞＞10％；(5)器官功能障碍，高灌注或高血压。(王正国.脓毒症研究概况[J].中华创伤杂志，2003，19(1)5-7.)自20世纪80年代以来，随着对脓毒症发病机制研究的深入，开发各种旨在抑制脓毒症形成的药物也随即兴起，并进行了80多项临床试验，其中几个有希望的药物进行了III期临床试验，但是遗憾的是仅有一个药物(活化C蛋白)被开发成功。(PoldermanKH and Girbes ARJ.Drug intervention trials in sepsisdivergent results[J].Lancet，2004，3631721-1723.)。活化C蛋白(商品名为Xigris)的开发成功为新的治疗严重脓毒症药物的开发提供了借鉴，特别是在天然产物中寻找同其功能相似的物质，在此称为活化C蛋白样酶(activated protein C like enzyme)。由于在静脉血栓病人中约有64％的患者对活化C蛋白是抗性的，所以这部分病人患脓毒症后再用Xigris治疗肯定是无效的，而活化C蛋白样物质就可以弥补Xigris的不足。另外，Xigris的生产过程复杂，生产成本较高，每个病人一个疗程的费用约为6800美元，如此高的价格限制了它在临床上的广泛应用。以上这些原因使得活化C蛋白样酶的寻找和开发有着非常重要的经济和社会意义。(，冯军，赵文杰.活化C蛋白[J].国外医药——合成药、生化药、制剂药分册，2002，23(6)348～351.)我国有着丰富的蛇毒资源，在世界各地分布的500多种毒蛇，在我国就有150多种。蛇毒是一种混合物，它含有许多种类具有不同生物活性的蛋白质，其中很多蛋白质作用于人血液系统的成分。(Markland FS.Snake venoms and the hemostatic system[J]Toxicon，1998，36(12)1749～1800.)但是，至今没有发现利用蛇毒单一组分进行预防和治疗脓毒症的报道。
基于活化C蛋白被成功开发为治疗严重脓毒症药物和蛇毒中存在多种作用于血液系统的组分，有必要提出从蛇毒中寻找活化C蛋白样酶，进行治疗脓毒症创新药物的开发。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种用于预防和治疗脓毒症的蛋白质，以克服现有技术的不足。
本发明需要解决的另一个技术问题是提供这种蛋白在制备治疗脓毒症的药物中的应用。
本发明公开了一种蛋白质，是由124个氨基酸残基组成的活化C蛋白样酶，在体外它既能显著延长人血浆活化部分凝血活酶时间又能水解活化C蛋白特异显色肽底物，在体内它能显著降低脓毒症试验动物的死亡率。上述活化C蛋白样酶可以是从天然产物提取的也可以是用基因工程手段制备的重组活化C蛋白样酶。上述活化C蛋白样酶的分子量在15.3kD(±5000kD)。上述活化C蛋白样酶的一级结构如附图4所示的氨基酸序列组成。其氨基酸序列如SEQ ID NO1Ser Leu Ile Gln Phe Glu Thr Leu Ile Met Lys Val Ala Lys Lys5 10 15Ser Gly Ile Phe Trp Tyr Ser Asn Tyr Gly Cys Tyr Cys Gly Trp20 25 30Gly Gly Gln Gly Arg Pro Gln Asp Ala Thr Asp Arg Cys Cys Phe35 40 45Val His Asp Cys Cys Tyr Gly Lys Val Thr Gly Cys Asp Pro Lys50 55 60Met Asp Val Tyr Ser Phe Ser Glu Glu Asn Gly Asp Ile Val Cys65 70 75Gly Gly Asp Asp Pro Cys Lys Lys Glu Ile Cys Glu Cys Asp Arg80 85 90Ala Ala Ala Ile Cys Phe Arg Asp Gln Leu Thr Asp Tyr Asn Asp95 100 105
Lys Lys Tyr Trp Ala Phe Gly Ala Lys Asn Cys Pro Gln Glu Glu110 115 120Ser Glu Pro Cys这种预防和治疗脓毒症的蛋白质来源于蝮蛇毒(Agkistrodon halys venom)，但不限于蛇毒。
本发明还公开了该蛋白的制备方法，该方法包括如下步骤(1)蛇毒溶于起始缓冲液即Tris-HCl缓冲液中，4℃透析过夜，然后取出，离心，离心条件为4℃，10000g，30min，取上清；(2)用SOURCE 30Q作为层析介质进行阴离子交换层析分离蛇毒，阴离子层析的柱体积为30ml，流速为5ml/min；用起始缓冲液平衡5倍柱体积；上样量为10ml；先用3倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱，梯度液组成为起始缓冲液(A)，起始缓冲液+0.2mol/L NaCl缓冲液(B)，B从0～100％，洗脱20倍CV；取峰5中的收集液；(3)用截留分子量为3000的醋酸纤维素膜超滤浓缩，取浓缩液做凝胶过滤层析，层析介质为Superdex 75pre grade，凝胶过滤层析柱体积为150ml；流速为0.5ml/min；PBS缓冲液平衡1倍柱体积；上样量为2ml；PBS缓冲液洗脱1.5倍柱体积；取峰2中的收集液。
本发明活化C蛋白样酶的制备方法中最优选地原料使用蝮蛇毒(Agkistrodonhalys)，阴离子交换层析填料使用瑞典Amersham Biosciences公司生产的SOURCE30Q，凝胶过滤层析填料使用瑞典Amersham Biosciences公司生产的Superdex 75pregrade。
阴离子交换层析得到的6个蝮蛇毒组分峰进行水解活化C蛋白特异显色肽能力的测定，结果表明仅有峰5组分具有明显的水解L PefachromePCa3297的能力。
分别对阴离子交换层析得到的6个蝮蛇毒组分峰进行水解活化C蛋白特异显色肽能力的测定，结果表明仅有峰5组分具有明显的水解L PefachromePCa3297的能力阴离子交换分离层析分离到的峰5经凝胶过滤层析后，结果得到2个组分峰，分别对这2个组分峰进行延长人血浆活化部分凝血活酶时间和水解显色肽试验测定，试验结果表明峰2中的各管收集液既能显著延长人血浆活化部分凝血活酶时间又具有较强的水解显色肽的能力，这表明峰2中的组分是活化C蛋白样酶。
进行SDS-PAGE，其中分离胶的浓度为12.5％，浓缩胶的浓度为4％，对得到的活化C蛋白样酶进行纯度检测和分子量测定。SDS-PAGE结果为单一条带，见附图3。以低分子量标准蛋白质的迁移率(Rf)为横坐标，低分子量标准蛋白质的对数值为纵坐标进行回归计算，得出APCL的分子量为15.3kD。
序列测定表明活化C蛋白样酶是由124个氨基酸组成，序列组成见序列表。
活化C蛋白样酶对正常小鼠的毒性测定，试验结果表明在72h内，在任何一个剂量组均没有观察到小鼠的死亡，同时也没有观察到小鼠的外观体征和行为活动发生异常的变化，因此可以确定APCL对小鼠的LD50低于400mg/kg bwt。
活化C蛋白样酶对脓毒症实验小鼠的作用，小鼠注射脂多糖24h后，开始观察到有小鼠的死亡，继续观察至72h。活化C蛋白样酶能显著降低脓毒症小鼠的死亡率，低剂量组降低20％，中剂量组降低65％，高剂量组降低70％。
本发明中蛇毒来源的蛋白质，即活化C蛋白样酶的用途是用于制备预防和治疗脓毒症的药物。
本发明中蛇毒来源的蛋白质的制备方法同活化C蛋白相比，具有来源方便，生产简单易行，成本低等优点。
图1为阴离子交换层析图谱。
图2为凝胶过滤层析图谱。
图3为活化C蛋白样酶的SDS-PAGE检测图谱。
具体实施例方式
实施例1 阴离子交换层析分离蝮蛇毒称取0.5g蝮蛇毒，溶于10ml 0.05mol/L，pH7.6的Tris-HCl缓冲液(起始缓冲液)中，对该缓冲液透析过夜(4℃)，然后取出，离心(4℃，10000g，30min)，弃沉淀，收集上清，进行阴离子交换层析，层析条件如下层析介质SOURCE 30Q；柱体积30ml；流速5ml/min；柱平衡用起始缓冲液平衡5倍柱体积；上样量10ml；洗脱先用3倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱，梯度液组成为起始缓冲液(A)，起始缓冲液+0.2mol/L NaCl缓冲液(B)，B从0～100％，洗脱20倍CV；收集8.0ml/管。
采用SOURCE 30Q阴离子交换层析介质对蝮蛇毒进行分离，得到了6个组分，具体结果见附图1和表1。
表1 阴离子交换层析各组分峰的积分结果
实施例2 延长人血浆活化部分凝血活酶时间的测定取凝血活酶(白陶土-脑磷脂)混悬液0.1ml，加正常人混合新鲜血浆0.1ml，对照组加生理盐水0.1ml，混匀，37℃水浴孵育5min，加入0.025mol/L氯化钙溶液0.1ml，立即开动秒表，记录凝血时间，试验组除用蝮蛇毒分离液代替生理盐水外，其它与对照组相同。[参见，王鸿利.血栓与止血检验技术，第一版[M]，上海上海科学技术出版社，1992，66-67.]分别对阴离子交换层析得到的6个蝮蛇毒组分峰进行测定，结果表明峰5组分具有明显的延长活化部分凝血活酶时间，其中一管收集液可比对照的时间延长10倍，而其它5个组分峰仅有较弱的延长活化部分凝血活酶时间的能力。
实施例3 水解活化C蛋白特异显色肽能力的测定取4μmol/L PefachromePCa3297(活化C蛋白特异显色肽，购自瑞典Pentapharm公司)0.2ml，加pH8.4的0.05mol/L Tris-咪唑缓冲液1.65ml，再加入不同的蝮蛇毒分离液0.2ml，混匀，在405nm测吸收值的变化(测定3min)。参比溶液为用0.2ml水溶液替换蛇毒溶液的上述溶液组成。[参见，Martinoli JL，Stocker K.Fast functionalprotein C assay using Protac，a novel protein C activator[J].Thromb Res，1986，43(3)253～264.]分别对阴离子交换层析得到的6个蝮蛇毒组分峰进行测定，结果表明仅有峰5组分具有明显的水解L PefachromePCa3297的能力。
实施例4 凝胶过滤层析纯化活化C蛋白样酶合并经阴离子交换分离层析分离到的峰5中的各管收集液，用截留分子量为3000的醋酸纤维素膜超滤浓缩，取浓缩液做凝胶过滤层析。层析条件如下层析介质Superdex 75pre grade；柱体积150ml；流速0.5ml/min；柱平衡PBS缓冲液(0.15mol/L NaCl，0.2mol/L Na2HPO4-NaH2PO4，pH 7.0)平衡1倍柱体积；上样量2ml；洗脱PBS缓冲液洗脱1.5倍柱体积；收集3ml/管。
层析结果阴离子交换分离层析分离到的峰5经凝胶过滤层析后，结果得到2个组分峰，具体结果见附图2和表2。
表2 凝胶过滤层析各组分峰的积分结果
分别对这2个组分峰进行延长人血浆活化部分凝血活酶时间和水解显色肽试验测定，试验结果表明峰2中的各管收集液既能显著延长人血浆活化部分凝血活酶时间又具有较强的水解显色肽的能力，这表明峰2中的组分是活化C蛋白样酶。
实施例5 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析活化C蛋白样酶按照文献[参见，李建武，余瑞元，袁明秀等.生物化学实验原理和方法[M].北京北京大学出版社，1997，174～176.]进行SDS-PAGE，其中分离胶的浓度为12.5％，浓缩胶的浓度为4％，对得到的活化C蛋白样酶进行纯度检测和分子量测定。
SDS-PAGE结果为单一条带，见附图3。以低分子量标准蛋白质的迁移率(Rf)为横坐标，低分子量标准蛋白质的对数值为纵坐标进行回归计算，得出APCL的分子量为15.3kD。图中，M为标准蛋白分子；1号为活化C蛋白样酶。
实施例6 活化C蛋白样酶的氨基酸组成序列测定序列测定表明活化C蛋白样酶是由124个氨基酸组成，序列组成见序列表。
实施例7 活化C蛋白样酶对脓毒症实验动物的作用(1)脂多糖对小鼠LD100的测定取18～22g小鼠30只，每10只分为一组，雌雄各半，分别以2mg/kg bwt(体重)、10mg/kg bwt和50mg/kg bwt的剂量尾静脉注射脂多糖(E.coli 055B5，购自Sigma公司)溶液，注射速度为0.5ml/min，在72h内观察各组小鼠的死亡情况。
小鼠被注射脂多糖24h后，开始观察到有小鼠的死亡，继续观察至72h。具体各组小鼠的死亡情况见表3。从表中可看出小鼠对脂多糖的敏感性较低，只有当脂多糖的剂量达到50mg/kg bwt时，其致死率才达到100％，因此确定本试验所测定的脂多糖对小鼠LD100为50mg/kg bwt，该剂量约相当于每只小鼠注射1.0mg的脂多糖。
表3 LPS对小鼠LD100的测定结果
(2)活化C蛋白样酶对正常小鼠的毒性测定取18～22g小鼠24只，每6只分为一组，雌雄各半，分别以4mg/kg bwt、40mg/kgbwt、100mg/kg bwt和400mg/kg bwt的剂量尾静脉注射APCL溶液，注射速度为0.5ml/min，在72h内观察各组小鼠的死亡情况。
试验结果表明在72h内，在任何一个剂量组均没有观察到小鼠的死亡，同时也没有观察到小鼠的外观体征和行为活动发生异常的变化，因此可以确定APCL对小鼠的LD50低于400mg/kg bwt。
(3)活化C蛋白样酶对脓毒症实验小鼠的作用取18～22g小鼠80只，每20只分为一组，雌雄各半，分成四组。第一组以50mg/kgbwt的剂量尾静脉注射脂多糖溶液；第二组先以2mg/kg bwt的剂量尾静脉注射0.4mg/ml的活化C蛋白样酶溶液，30min后再以50mg/kg bwt的剂量尾静脉注射2mg/ml的脂多糖溶液；第三组先以4mg/kg bwt的剂量尾静脉注射0.4mg/ml的活化C蛋白样酶溶液，30min后再以50mg/kg bwt的剂量尾静脉注射2mg/ml的脂多糖溶液；第四组先以8mg/kg bwt的剂量尾静脉注射0.4mg/ml的活化C蛋白样酶溶液，30min后再以50mg/kg bwt的剂量尾静脉注射2mg/ml的脂多糖溶液注射速度均为0.5ml/min，在72h内观察各组小鼠的死亡情况，计算死亡率。
小鼠注射脂多糖24h后，开始观察到有小鼠的死亡，继续观察至72h。各组小鼠的死亡情况见表4。从表中可看出活化C蛋白样酶能显著降低脓毒症小鼠的死亡率，低剂量组降低20％，中剂量组降低65％，高剂量组降低70％。
表4 活化蛋白C样酶降低脓毒症小鼠死亡率的试验结果
实施例8在实施例7下“用活化C蛋白样酶对脓毒症实验小鼠的作用”中以先注射脂多糖，再注射活化C蛋白样酶做替换，也得到了相类似的试验结果。
序列表<110>上海医药工业研究院<120>一种蛋白质及其用途<130>SPI058153<160>1<170>Patent In Version2.1<210>1<211>124<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>CHAIN<400>1Ser Leu Ile Gln Phe Glu Thr Leu Ile Met Lys Val Ala Lys Lys5 10 15Ser Gly Ile Phe Trp Tyr Ser Asn Tyr Gly Cys Tyr Cys Gly Trp20 25 30Gly Gly Gln Gly Arg Pro Gln Asp Ala Thr Asp Arg Cys Cys Phe35 40 45Val His Asp Cys Cys Tyr Gly Lys Val Thr Gly Cys Asp Pro Lys50 55 60Met Asp Val Tyr Ser Phe Ser Glu Glu Asn Gly Asp Ile Val Cys65 70 75Gly Gly Asp Asp Pro Cys Lys Lys Glu Ile Cys Glu Cys Asp Arg80 85 90Ala Ala Ala Ile Cys Phe Arg Asp Gln Leu Thr Asp Tyr Asn Asp95 100 105Lys Lys Tyr Trp Ala Phe Gly Ala Lys Asn Cys Pro Gln Glu Glu110 115 120Ser Glu Pro Cys
权利要求
1.一种蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.根据权利要求1所述的蛋白在制备预防和治疗脓毒症的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种来源于蛇毒的同活化C蛋白功能相似的蛋白质，用于脓毒症的预防和治疗。本发明还公开了该蛋白的制备方法，可采用阴离子交换和凝胶过滤相结合的层析技术从蛇毒中分离纯化。本发明公开的蛋白可应用于制备预防和治疗脓毒症的药物，同活化C蛋白相比，具有来源方便，生产简单易行，成本低等优点，有着非常重要的经济和社会意义。
文档编号A61P17/02GK1847262SQ20051002505
公开日2006年10月18日 申请日期2005年4月13日 优先权日2005年4月13日
发明者冯军, 赵文杰, 朱宝泉 申请人:上海医药工业研究院