专利名称：一种e1a蛋白及其制备方法，以及含该蛋白的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种E1A蛋白及其制备方法，以及抗肿瘤的含该E1A蛋白的组合物及其在制备治疗肿瘤疾病药物方面的应用。
背景技术：
人类腺病毒5型E1A基因是近年来新发现的一个抑癌基因(Oncogene，1992，71255~1258)。它编码两个主要蛋白，一个含243个氨基酸(12S)，另一个含289个氨基酸(13S)，这是由于两个外显子被选择性剪切而形成的。研究表明E1A能调控多种基因的表达，调控细胞周期(Oncogene，1995，11467～474)。体外及体内的实验证明它能诱导肿瘤细胞分化，表型向正常细胞转变，抑制肿瘤细胞生长及转移，且与p53基因的状态无关，也不论其他癌基因如Ras是否突变被激活，E1A都能在较大程度上提高肿瘤细胞对化疗药物及射线的敏感性(Oncogene，1996，131083～1092；Oncogene，1998，172167~2175)。
大量临床及基础研究已经证明肿瘤的耐药性是严重影响患者疗效的关键问题。在死亡的癌症患者中，约有61％为内在性耐药，约有33％为获得性耐药，二者合计约有90％以上的患者因耐药使化疗失败而死[中华医学杂志，2001，Vol 81(24)，P1481]。因此，克服耐药性是提高疗效的关键问题之一。虽然手术和放疗在肿瘤的治疗中发挥着重要的作用。但这些局部治疗的措施对于未形成肿瘤结节的亚临床病灶即散在的癌细胞效果都不理想。而这些散在的癌细胞往往造成复发和转移。另一方面，由于一些肿瘤部位重要器官密集如头颈肿瘤，可切除范围有限，手术时为了保存器官的功能而往往会残存一些癌细胞在患者体内。这些都是造成复发的重要原因。
化疗作为全身治疗本来是杀伤这些残存癌细胞的有效措施，但由于部分肿瘤固有的耐药性致使效果一直较差。国外Wolf博士领导的研究组对10年来多个肿瘤中心的头颈肿瘤化疗的结果进行了总结，结果表明化疗虽对部分病人症状的缓解有一定效果，但对五年生存率无明显影响(Head and Neck，1999，21；689-693)。针对目前的现状，研发新的抗肿瘤药物是非常必要的。
目前，在国外E1A多采用基因治疗的方式。然而，与其它一些基因一样，E1A的基因治疗也存在亟待解决的问题，如腺病毒载体的免疫原性；非病毒载体转导效率较低；载体缺乏靶向性及特异性；基因表达的不可调控性；特别是他能随机整合到细胞基因组DNA中引起染色体移位及由于DNA片段插入而引起新的基因失活或激活等诸多因素，又可能导致基因组出现新的异常变化。这些都制约了E1A基因治疗的实际应用(J.Natl.Cancer Inst，1997，8921～39)。大量研究已经证明酵母表达系统发酵适合于大规模生产，特别是在翻译后水平加工如糖基化等修饰接近于哺乳动物，适合于要求维持高级结构才能保持生物活性的蛋白表达等而倍受人们关注(Biochem.Biophys.Res.Commun，2000，267169～173)。我们采用了脂质体作为E1A蛋白的转运载体，对耐药的肿瘤细胞S-180肉瘤在昆明小鼠和人头颈肿瘤细胞LN686在裸鼠体内生长的影响进行了观察，为E1A蛋白代替其基因治疗提供了依据。经检索，尚未见国内外有类似的报道。
发明内容
本发明针对目前肿瘤治疗所面临的世界性难题，寻找常规手术、化疗和放射治疗之外新的有效方法，以期提高肿瘤的治疗效果。
本发明的目的是提供一种E1A蛋白，编码E1A蛋白的E1A基因的表达载体、其制备方法，本发明的另一目的是提供一种抗肿瘤的E1A蛋白组合物及其在制备治疗肿瘤药物方面的应用，本发明克服了E1A基因治疗导致基因组出现异常变化而疗效不确切的缺点，且无明显毒副作用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种抗肿瘤的E1A蛋白，所述E1A蛋白具有SEQ ID No.2的氨基酸序列；所述的E1A蛋白是由具有SEQ ID No.1核苷酸序列的E1A(12S)基因所编码，所述E1A(12S)基因的表达载体，包括质粒和所述的E1A(12S)基因。
所述质粒可以由真核表达系统如酵母表达系统，或真核表达系统如大肠杆菌表达系统代替。
所述肿瘤为实体瘤，尤其是头颈肿瘤。
一种抗肿瘤药物，包括介导物质和前述的E1A蛋白。
一种抗肿瘤药物，包括介导物质、博莱霉素和前述的E1A蛋白。所述介导物质为脂质体，或其它介导物质。
所述抗肿瘤药物还可以进一步包括其它药物或射线。
一种E1A蛋白的制备方法，包括以下步骤E1A(12S)基因表达载体的构建取质粒DNA(PUC-E1A)、上游引物、下游引物，用于PCR，上游引物为5′CGACTCGAGATGAGACATATTATCTGCCAC3′，上游引物5′含有Xho I酶切位点；下游引物为5′ATAGCGGCCGCTTATGGCCTGGGGCGTTTACA3′，下游引物5′含有Not位点；PCR反应条件下得到PCR产物，PCR产物纯化后，用Xho I，Not I酶切，再克隆到pPIC9载体的Xho I，Not I位点，筛选获得重组质粒pPIC9/E1A；酵母细胞的转化及筛选重组质粒pPIC9/E1A经Bgl II线性化，电穿孔法转导酵母细胞，将转化子均匀铺在置于MD平板上的硝酸纤维素膜上，30℃培养3天；待克隆形成后转至MM平板上，28℃诱导E1A蛋白表达，48h后，将膜取出，用E1A单抗筛选阳性菌株.由于表达产物为分泌型，在菌落周围形成环状，挑选形成颜色深的环状菌落，即为表达工程菌株；重组菌株的诱导表达重组菌株接种于BMGY培养液中，30℃摇瓶培养，生长至菌体密度A600＝10-20，离心收取细胞，重悬于BMMY诱导液中，28℃诱导表达，每24h补加甲醇至终浓度1％，诱导72h；E1A蛋白的纯化利用Pharmacia AKTA FPLC层析系统，将BMMY诱导液离心、过滤、经Tris-HCl缓冲液透析后，上由Tris-HCl缓冲液平衡的HiTrapQ阴离子交换柱，用Tris-HCl缓冲液含0-0.2M NaCL线性梯度洗脱，获得E1A蛋白的粗分离产物；将其用50mM，PH 4.0醋酸缓冲液透析后，再上由50mM，PH 4.0醋酸缓冲液平衡的HiTrap SP阳离子交换柱，用醋酸缓冲液含0-0.15M NaCL线性梯度洗脱，流速为5ml/min，获得纯化的E1A蛋白。
为得到所述表达载体，所述PCR产物反应条件为94℃、30sec，55℃、30sec，72℃、1min，30个循环后，72℃延伸7min。
所述转导酵母细胞为GS115(Mut+，His-)；所述MD平板为含有34％YNB，4×10-5％生物素，1％葡萄糖，1％琼脂的平板；所述MM平板为含有1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甲醇，1％琼脂的平板；所述BMGY培养液为100mmol/LK3PO4，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甘油培养液；所述BMMY培养液为100mmol/L K3PO4，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甲醇培养液。所述Tris-HCl缓冲液为50mM，PH 7.5，含0.1mM dTT，1mM EDTA，20mM KCl缓冲液。
一种包括介导物质和前述的E1A蛋白药物组合物在制备治疗肿瘤疾病药物方面的应用。
一种包括介导物质、博莱霉素和前述的E1A蛋白药物组合物在制备治疗肿瘤疾病药物方面的应用，所述药物组合物还可以进一步包括其它介导物质、药物或射线。
本发明采用上述方法制备的E1A蛋白，以及以脂质体为E1A蛋白转运载体，与博莱霉素联合用药，能显著抑制肿瘤生长并提高肿瘤对化疗药物博莱霉素的敏感性，为治疗肿瘤及克服肿瘤对化疗药物耐药性的难题提供了新的措施；同时，用E1A蛋白治疗肿瘤还克服了E1A基因治疗的缺点和不足。因此，E1A蛋白在肿瘤的治疗中具有重要的临床应用价值。
图1为SDS-PAGE分析和Western blot鉴定。
其中(a)为SDS-PAGE分析1表示蛋白标准分子量，2表示纯化后的E1A蛋白；(b)为Western blot鉴定纯化后的E1A蛋白图2为E1A蛋白对S-180肉瘤在昆明小鼠体内生长的抑制及化疗增敏作用。
其中-○-对照组-△-博莱霉素组-●-脂质体组-■-E1A蛋白+脂质体组-◆-E1A蛋白+脂质体+博莱霉素组图3为E1A蛋白对在裸鼠体内生长的头颈淋巴结转移肿瘤的抑制及化疗药物增敏作用。
其中-○-对照组-△-博莱霉素组-●-脂质体组
-■-E1A蛋白+脂质体组-◆-E1A蛋白+脂质体+博莱霉素组-▲-环磷酰胺组具体实施方式
实施例1E1A蛋白的制备制备如图1所示E1A蛋白的方法，步骤如下1、PCR扩增E1A(12S)基因和载体构建。取1μg质粒DNA(PUC-E1A)用于PCR，所用上、下游引物分别为5′CGACTCGAGATGAGACATATTATCTGCCAC3′，5′ATAGCGGCCGCTTATGGCCTGGGGCGTTTACA3′。上游引物5′含有Xho I，下游引物5′含有Not I(已在引物中标明)位点。反应条件为94℃、30sec，55℃、30sec，72℃、1min，30个循环后，72℃延伸7min.PCR产物纯化后，用Xho I，Not I酶切，再克隆到pPIC9载体的Xho I，Not I位点，筛选获得重组质粒pPIC9/E1A，序列分析结果正确。
2、酵母细胞的转化及筛选。重组质粒pPIC9/E1A经Bgl II线性化，电穿孔法转导酵母细胞GS115(Mut+，His-)，将转化子均匀铺在置于MD(1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％葡萄糖，1％琼脂)平板上的硝酸纤维素膜上，30℃培养3天.待克隆形成后转至MM(1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甲醇，1％琼脂)平板上，28℃诱导E1A蛋白表达，48h后，将膜取出，用E1A单抗筛选阳性菌株。由于表达产物为分泌型，在菌落周围形成环状，挑选形成颜色深的环状菌落，即为高表达工程菌株。
3、重组菌株的诱导表达。重组菌株接种于BMGY(100mmol/L K3PO4，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甘油)培养液中，30℃摇瓶培养，生长至菌体密度A600＝10-20，离心收取细胞，重悬于BMMY(100mmol/L K3PO4，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甲醇)诱导液中，28℃诱导表达，每24h补加甲醇至终浓度1％，诱导72h，进行SDS-PAGE及Western blot分析。
4、E1A蛋白的纯化。利用Pharmacia AKTA FPLC层析系统，将BMMY诱导液离心、过滤、经Tris-HCl缓冲液(50mM，PH 7.5，含0.1mM dTT，1mMEDTA，20mM KCl)透析后，上由Tris-HCl缓冲液平衡的阴离子交换柱(HiTrapQ)，用Tris-HCl缓冲液含0-0.2M NaCL线性梯度洗脱，获得E1A蛋白的粗分离产物。将其用醋酸缓冲液(50mM，PH 4.0)透析后，再上由醋酸缓冲液(50mM，PH 4.0)平衡的阳离子交换柱(HiTrap SP)，用醋酸缓冲液含0-0.15M NaCL线性梯度洗脱，流速为5ml/min，获得纯化的E1A蛋白。进行10％SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定。纯化的蛋白为单一条带，经Westernblot鉴定正确。
实施例2如图2所示的E1A蛋白对耐药的S180肉瘤的抑制及化疗增敏曲线。
昆明(KM)小鼠25只，皮下接种S180肉瘤细胞40万/只，待肿瘤长至约5毫米时，记录肿瘤体积，开始给药。对照组(肿瘤局部注射生理盐水5mL/kg)；博莱霉素组(腹腔注射博莱霉素5mg/kg)；脂质体组(肿瘤局部注射脂质体2mL/只)；E1A蛋白组(肿瘤局部注射脂质体2mL/kg+E1A蛋白2mg/kg)；合并组(肿瘤局部注射脂质体2mL/kg+E1A蛋白2mg/kg及腹腔注射博莱霉素5mg/kg)。每两天给药一次，共给药6次，并测量肿瘤的长径和短径，肿瘤体积＝长径×短径2×0.52。经6次给药后，与对照组相比，博莱霉素的抑瘤率为20％，E1A蛋白抑瘤率为52％，博莱霉素与E1A蛋白联合使用时，抑瘤率提高为73％，可见E1A蛋白有明显的增敏作用。
实施例3如图3所示的E1A蛋白及环磷酰胺对LN686人头颈淋巴节转移瘤体内生长的抑制及增敏曲线。
裸鼠(中国医学科学院肿瘤医院动物中心)60只，皮下接种LN686肿瘤块约50mm3/只，接种后5天开始给药并记录肿瘤体积，隔天给药，共给药8次。对照组(肿瘤局部注射生理盐水5mL/kg)；博莱霉素组(腹腔注射博莱霉素5mg/kg)；脂质体组(肿瘤局部注射脂质体1.25mL/kg)；E1A蛋白组(肿瘤局部注射脂质体1.25mg/kg+E1A蛋白2.5mg/kg)；合并组(肿瘤局部注射脂质体1.25mg/kg+E1A蛋白2.5mg/kg及腹腔注射博莱霉素5mg/kg)。环磷酰胺组(腹腔注射环磷酰胺64mg/Kg·BW，(见Cancer Res.1999，59(20)5176-5180)，经4次给药后，由于毒性较大，死亡2只。测量肿瘤的长径和短径，计算肿瘤体积＝长径×短径2×0.52。实验进行到第38天时，与对照组相比较，博莱霉素，E1A蛋白，E1A蛋白与博莱霉素联合作用，及环磷酰胺对人LN686肿瘤细胞的抑制率分别为52.8％、90％、95.5％、77.4％。E1A蛋白的抑瘤率(90％)明显高于环磷酰胺(77％)，且未发现明显的毒副作用。
权利要求
1.一种E1A蛋白，所述E1A蛋白具有SEQ ID No.2的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的E1A蛋白，所述E1A蛋白是由具有SEQ ID No.1核苷酸序列的E1A(12S)基因所编码。
3.根据权利要求2的E1A蛋白，所述E1A(12S)基因的表达载体，包括质粒和权利要求2所述的E1A(12S)基因，所述质粒可以由真核表达系统如酵母表达系统，或真核表达系统如大肠杆菌表达系统代替。
4.一种抗肿瘤药物组合物，包括介导物质和权利要求1-3之一所述的E1A蛋白。
5.一种抗肿瘤药物组合物，包括介导物质、博莱霉素或其它药物或射线和权利要求1-4之一所述的E1A蛋白。
6.根据权利要求4或5的抗肿瘤药物组合物，所述介导物质可以为脂质体或其它介导物质。
7.一种E1A蛋白的制备方法，包括以下步骤E1A(12S)基因表达载体的构建取质粒DNA(PUC-E1A)、上游引物、下游引物，用于PCR，上游引物为5′CGACTCGAGATGAGACATATTATCTGCCAC3′，上游引物5′含有Xho I；下游引物为5′ATAGCGGCCGCTTATGGCCTGGGGCGTTTACA3′，下游引物5′含有Not位点；PCR反应条件下得到PCR产物，PCR产物纯化后，用Xho I，Not I酶切，再克隆到pPIC9载体的Xho I，Not I位点，筛选获得重组质粒pPIC9/E1A；酵母细胞的转化及筛选重组质粒pPIC9/E1A经Bgl II线性化，电穿孔法转导酵母细胞，将转化子均匀铺在置于MD平板上的硝酸纤维素膜上，30℃培养3天；待克隆形成后转至MM平板上，28℃诱导E1A蛋白表达，48h后，将膜取出，用E1A单抗筛选阳性菌株；由于表达产物为分泌型，在菌落周围形成环状，挑选形成颜色深的环状菌落，即为表达工程菌株；重组菌株的诱导表达重组菌株接种于BMGY培养液中，30℃摇瓶培养，生长至菌体密度A600＝10-20，离心收取细胞，重悬于BMMY诱导液中，28℃诱导表达，每24h补加甲醇至终浓度1％，诱导72h；E1A蛋白的纯化利用Pharmacia AKTA FPLC层析系统，将BMMY诱导液离心、过滤、经Tris-HCl缓冲液透析后，上由Tris-HCl缓冲液平衡的HiTrapQ阴离子交换柱，用Tris-HCl缓冲液含0-0.2M NaCL线性梯度洗脱，获得E1A蛋白的粗分离产物；将其用50mM，PH4.0醋酸缓冲液透析后，再上由50mM，PH4.0醋酸缓冲液平衡的HiTrap SP阳离子交换柱，用醋酸缓冲液含0-0.15M NaCL线性梯度洗脱，流速为5ml/min，获得纯化的E1A蛋白。
8.根据权利要求7的E1A蛋白的制备方法，所述PCR反应条件为94℃、30sec，55℃、30sec，72℃、1min，30个循环后，72℃延伸7min。所述转导酵母细胞为GS115(Mut+，His-)；所述MD平板为含有34％YNB，4×10-5％生物素，1％葡萄糖，1％琼脂的平板；所述MM平板为含有1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甲醇，1％琼脂的平板；所述BMGY培养液为100mmol/L K3PO4，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甘油培养液；所述BMMY培养液为100mmol/LK3PO4，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甲醇培养液。所述Tris-HCl缓冲液为50mM，PH7.5，含0.1mM dTT，1mM EDTA，20mM KCl缓冲液。
9.一种权利要求4所述的E1A蛋白药物组合物在制备治疗肿瘤疾病药物方面的应用。
10.一种权利要求5所述的E1A蛋白药物组合物在制备治疗肿瘤疾病药物方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种E1A蛋白，编码E1A蛋白的E1A基因的表达载体及其制备方法，以及抗肿瘤的E1A蛋白药物组合物，其组合物在制备治疗肿瘤药物方面的应用。本发明E1A蛋白能明显提高肿瘤细胞对化疗药物和射线的敏感性。E1A蛋白制备的药物对耐药S180肉瘤的抑瘤率可达73％；对人LN686肿瘤细胞的抑瘤率可达95.5％。本发明克服了E1A基因治疗导致基因组可能出现异常变化影响疗效的缺点，且无明显毒副作用。
文档编号A61P35/00GK1524874SQ03105240
公开日2004年9月1日 申请日期2003年2月25日 优先权日2003年2月25日
发明者赵清正 申请人:中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所