专利名称：根霉菌干混悬剂、制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及根霉菌干混悬剂、制备方法及其在治疗各种感染性急性腹泻、急性胃肠炎和消化不良过程中的用途。
背景技术：
本产品是以我国民间开发出来的祖传验方为基础，用常见的食用菌-根霉菌，加淀粉培养发酵而成。民间世代相传用根霉菌治疗各种感染性急性腹泻，包括急性菌痢、细菌性肠炎、病毒性肠炎和霍乱等。过去民间生产工艺简陋，常有杂菌或病原菌存在，食品工业生产工艺主要采用固体发酵，厂房设备均达不到无菌要求，产品质量不够稳定。我们根据传统用药习惯，结合根霉菌丝生长快，无横隔膜，易于培养繁殖的生物学特性，对生产工艺和剂型进行改进，制备出质量稳定、效果可靠的产品。
发明内容
本申请选用的两种根霉菌购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，米根霉Rhizopus oryzae的保藏号为AS 3.866，日本根霉Rhizopus japonicus的保藏号为AS 3.868。
根据根霉菌生长快，无横隔膜，易于培养繁殖的生物学特性，确定了口服干混悬剂剂型(中国药典95版二部附录IO)，使菌丝体便于复苏，并对生产工艺的各个环节，包括菌种筛选、鉴定、斜面条件、一、二级培养发酵条件、固培干燥以及各阶段的培养基、发酵液、C、N源及其比例、pH变化、温度时间、通气量、转速和方式等，均进行了实验研究。最后根据收率、质量、成本等综合分析，初步制定了飞克痢最佳生产工艺流程。并于1996-1998年采用新工艺生产了6批样品，同时进行酶活力、酸度、抑菌率等质量考核。技术方案如下1.菌种 购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号分别为米根霉Rhizopus oryzaeAS 3.866，日本根霉Rhizopus japonicusAS 3.868，见附件保藏目录。在制剂中二者用量各半。
2.生产工艺及其基本原理和依据本申请的产品是根霉活菌休眠状态的生物制品。其生产基本原理是根霉可利用单糖-葡萄糖等增殖，而根霉增殖过程产生的α-淀粉酶和葡萄糖苷酶，可使淀粉糊精化，并逐步水解为葡萄糖。因此，生产本产品是利用根霉具有增殖和发酵的双相生理功能，设置其培养繁殖的最佳条件，使菌丝产量高，复苏快，繁殖迅速，粗壮，酶活力强，抑菌率高。同时要注意每个不同工艺阶段的生长周期，否则不是年轻体壮的精兵，而是掺杂老弱病残的混合体，会影响其活力。所以当菌丝长成后，立即使其在辅料中(淀粉，作为分散剂、保存剂和C源)迅速转入干燥休眠状态。一旦在人体胃部复苏，则是一支精锐的生物工程兵。在完成其生物发酵过程中产生大量菌丝网络、酶和酸，造成不利于病原菌的综合性酸性环境，使病原菌受到抑制和杀死，从而达到治疗目的(在动物模型切片中证实了这一点)。
工艺流程见附
图1。
工艺过程及条件2.1原菌种 两株原菌种分别接种于麦芽汁琼脂斜面培养基上，24-40℃培养20-48小时，优选用13Bé麦芽汁+2％琼脂，32℃培养24-32小时，取出，置0-8℃-优选3-5℃冰箱中贮存备用。
2.2传斜面菌种 主要提供一级种子罐用菌种。从米根霉和日本根霉的原菌种斜面上，分别取豆粒大小菌种，分别接种于装在试管中的麦芽汁琼脂斜面上，每支试管中有10ml麦芽汁琼脂斜面培养基，24-40℃培养20-48小时，优选用13Bé麦芽汁+2％琼脂的培养基，32℃培养24-36h，更优选36小时，即可用于制做一级菌液。
2.3一级培养发酵 一级主要为了扩大种子量，供二级发酵用，也可在一级培养后直接进入拌粉固培升温干燥，制备产品。一级菌液的配制和用量分别刮取已培养20-48小时，—优选已培养36h的米根霉和日本根霉的斜面菌种，分别加适量灭菌0.85％生理盐水(通常1支斜面加10ml生理盐水)研匀，即为一级菌液。一级培养发酵液为10Bé麦芽汁，加0.5％-1％蛋白胨，优选加0.5％蛋白胨，用乳酸调至pH4.8，高压灭菌115℃，20分钟。按1000ml三角烧瓶装量为500ml计算，每个三角瓶中接种菌液量相当于各菌种的1/5斜面-1/2斜面，优选1/3斜面，混匀，如培养液量增大，依此比例扩大，即可上摇床培养发酵。条件为通气量40-60％，温度24-40℃，20-48h，转速150-350转/分，优选通气量50％，温度32℃，36h，转速180-200转/分。过筛收集菌丝，一级菌丝为直径1-1.5cm的小球状或散絮状，白色，备用。
2.4二级培养发酵 二级主要扩大菌丝产量。二级菌液的配制和用量取一级菌丝加入适量灭菌0.85％盐水研匀，再加入与一级发酵液等量的盐水混匀，即为二级培养用菌液，接种在二级发酵液中培养，接种量为14-16％，优选14％，二级培养发酵液为12Bé麦芽汁加0.5％-1％蛋白胨，优选加0.5％蛋白胨，用前，高压灭菌110℃，20分钟。培养条件为通气量40-60％，温度24-40℃，20-48h，转速150-350转/分，优选通气量为50％，温度32℃，40小时，转速190-200转/分，长成的菌丝应为散絮状，用0.85％灭菌盐水洗3-4次，为纯净菌丝，备用。
一、二级培养发酵所用发酵液的C源可选自8-13Bé麦芽、7％土豆丝液、7％大米液、7％地瓜液、7％玉米液、7％鲜土豆丝液、糯米液、7％糊精液，N源可选自0.2％-1％蛋白胨、1％酵母、50％牛肉汁和纯牛奶、30％豆饼水解液、15％花生渣水解液、黄豆粉水解液，二者的比例可任意组合，使用麦芽和蛋白胨的组合时，二者的比例可以是13Bé∶0.2％、8Bé∶0.7％、10Bé∶0.5％或5Bé∶0.9％。
2.5拌粉固培升温干燥 此工序是从液体培养发酵转入固培阶段。首先将获得的湿菌丝打散，拌入事先于120℃烘3小时灭菌的米粉(大米或糯米，粉碎过2-3号筛)中，菌丝与米粉重量比1∶0.5-5，拌匀，铺在垫纸上，厚度1-2cm，稍压平，上面盖一层湿沙布，28-40℃培养8-17h，优选35℃培养12-15h，菌丝渐长满在米粉上，稍富弹性，并有一定发酵香气，说明菌丝培养阶段已完成。立即翻动，通风，尽快中止菌丝繁殖，升温40-50℃，优选45-47℃翻动至干燥，此时含水量＜9％。
2.6干收、粉碎、过筛、包装、贮存。干燥后粉碎过10-60目筛，优选过40目筛，真空包装。根据稳定性实验结果，在5℃±2℃冷藏条件及室温干燥箱条件下，分别贮存两年半或两年，检查各项质量指标均符合标准，说明在以上条件贮存两年半质量稳定，有效期暂定为二年。
3.工艺条件的选择依据根霉菌干混悬剂培养发酵工艺正交试验3.1正交试验的依据生产工艺研究过程中发现斜面时间、一级时间、二级时间和二级接种量对菌丝得率影响较大，为此进行了下列预试研究。
3.1.1斜面培养时间的筛选对米根霉和日本根霉进行不同梯度时间(h)的培养，主要观察菌丝生物学特性和长势。结果斜面培养34-38h菌丝生长良好，以38h的更优，菌丝长势旺，覆盖整个斜面，48h已长出黑孢子。
3.1.2不同培养、发酵时间对一二级菌丝得率的影响进行了不同梯度时间(12-50h)菌丝得率的预试工作。结果表明，一、二级发酵36-40h的得率高，其中以36h最高。一级菌丝得率从40-44h明显降低，48-50h处于低平状况。二级菌丝则从40-50h呈缓慢降低趋势。
3.1.3二级接种量的对比试验在预试过程发现不同接种量的菌丝得率不太稳定，有时14％接种量得率高，有时16％得率高，具体接种量有必要再通过正交试验来筛选。
3.2正交试验根据上面预试结果选用正交表L9(34)进行表头设计和实验安排，试验结果采用直观分析和方差分析，加以讨论和结论，现分析如下。
3.2.1一、二级培养、发酵的因素和水平设置四个因素三个水平(见表1)。
表1.一二级发酵的因素水平表因素水平A BCD一级发酵时间 二级发酵时间 斜面时间 二级发酵接种量1 24h36h 24h 12％2 36h40h 36h 14％3 40h42h 46h 16％3.2.2L9(34)表头的设计将四个因素和列号排上，根据所设三个水平，将9个实验号排好，并将考察结果列上，根据实验结果计算K、K值和R值(见表2)。
3.2.3直观分析(见表2)3.2.3.1四因素极差(R)分析结果D＞A＞C＞B。即D因素(二级接种量)为影响产量的主要因素。A、C为次要因素，B为影响最小的因素。
3.2.3.2主要因素D(二级接种量)所设三个水平对产量影响顺序为K2＞K3＞K1，因此K2水平(二级接种量取14％)的菌丝产量最高。
3.2.3.3 A、B、C三因素分别所设三水平均以K2的菌丝产量最高。此外，值得一提的是A、B、C三因素的K3水平，其菌丝产量均有下降趋势。这一结果可以提示，斜面培养和一、二级发酵时间不是愈长愈好。与我们进行的预试结果也是一致的。
表2L9(34)试验计划及分析计算表试因素与列号菌丝得率％验号 A(1)B(2)C(3)D(4) y1 1(24h) 1(36h) 1(24h) 1(12％) 1.902 1(24h) 2(40h) 2(36h) 2(14％) 2.85
3 1(24h) 3(42h) 3(46h) 3(16％) 2.004 2(36h) 1(36h) 2(36h) 3(16％) 2.805 2(36h) 2(40h) 3(46h) 1(12％) 2.206 2(36h) 3(42h) 1(24h) 2(14％) 3.207 3(40h) 1(36h) 3(46h) 2(14％) 2.608 3(40h) 2(40h) 1(24h) 3(16％) 2.509 3(40h) 3(42h) 2(46h) 1(12％) 2.30K16.757.307.606.40 ∑y＝22.35K28.207.557.958.65 9K37.407.506.807.35 ∑yi2＝56.95i＝1K12.252.432.532.13K22.732.522.652.88K32.462.502.272.45R 0.480.090.380.753.2.4方差分析 从方差分析表(表3)上的F比值(73.20)和P值(0.0135)＜0.025，可以看出，D(接种量)为较显著性因素，用D2(接种量14％)比用D1(接种量12％)的收率会显著性提高。此外，A、C因素的P值分别为0.032和0.048均＜0.05。说明A因素(一级发酵时间)和C因素(斜面时间)均为显著性因素，用A2、C2其收率比用A1、C3的收率会显著增高。因此，D、A、C三因素均有显著性差异，而B因素不显著。方差分析结果表明本工艺采用D2A2C2B2为最佳选择。即二级接种量14％，一级发酵时间36小时，斜面时间36小时，二级发酵时间40小时。
表3方差分析表方差来源 离均差平方和(SS)自由度n均方(MS) F值P值A 0.3522 0.17630.143 0.032＜0.05B 0.0122 0.0061.000 0.500＞0.05C 0.2322 0.11619.857 0.048＜0.05
D0.85520.42873.2860.013＜0.025误差 0.012总计 1.4638F0.05(2，2)＝39F0.1(2，2)＝19.004.实施例例1原菌种两株原菌种[米根霉Rhizopus oryzae(3.866)和日本根霉R.japonicus(3.868)]分别接种于13Bé麦芽汁+2％琼脂的斜面培养基上，32℃培养32小时，取出，置4℃冰箱中贮存备用。
传斜面菌种从米根霉和日本根霉的原菌种斜面上，分别取豆粒大小菌种，分别接种于装在试管中的麦芽汁琼脂斜面上，每支试管中有10ml 13Bé麦芽汁+2％琼脂斜面培养基，34℃培养32小时，即可用于制做一级菌液。
一级培养发酵一级菌液的配制和用量分别刮取已培养32h的米根霉和日本根霉的斜面菌种，对每支斜面的菌种加10ml生理盐水，研匀，即为一级菌液。一级培养发酵液为10Bé麦芽汁，加0.5％蛋白胨，用乳酸调至pH4.8，高压灭菌115℃，20分钟。在各装有10ml麦芽汁琼脂斜面培养基的试管中，分别在34度已培养32h的米根霉和日本根霉的根霉菌种，用接种针分别刮下于乳钵内，加生理盐水10ml，研细，混匀，取6ml菌液，加至1000ml含10Bé麦芽汁加0.5-1％蛋白胨的培养液内(用2000ml三角瓶装)，上摇床培养发酵。条件为通气量50％，温度34℃，32h，转速180-200转/分。过筛收集菌丝，得到的一级菌丝为直径1-1.5cm的小球状或散絮状，白色，备用。
二级培养发酵二级菌液的配制和用量取一级菌丝加入适量灭菌0.85％盐水研匀，再加入与一级发酵液等量的盐水混匀，即为二级培养用菌液；二级培养发酵液为12Bé麦芽汁加0.5％，用前高压灭菌110℃，20分钟；在每100ml培养发酵液中接种14ml二级用菌液，培养条件为通气量为50％，温度32℃，40小时，转速190-200转/分，长成的菌丝应为散絮状，用0.85％灭菌盐水洗3-4次，为纯净菌丝，备用。
拌粉固培升温干燥首先将从液体培养发酵获得的湿菌丝打散，拌入事先于120℃烘3小时灭菌的大米粉(粉碎过2-3号筛)中，菌丝与米粉重量比1∶3，拌匀，铺在垫纸上，厚度1-2cm，稍压平，上面盖一层湿沙布，优选35℃培养12-15h，菌丝渐长满在米粉上，稍富弹性，并有一定发酵香气，说明菌丝培养阶段已完成。立即翻动，通风，尽快中止菌丝繁殖，升温45-47℃，翻动至干燥，此时含水量＜9％。
干收、粉碎、过筛、包装、贮存干燥后粉碎过40目筛，真空包装。根据稳定性实验结果，在5℃±2℃冷藏条件及室温干燥箱条件下，分别贮存两年半或两年，检查各项质量指标均符合标准，说明在以上条件贮存两年半质量稳定，有效期暂定为二年。
5.连续生产6批样品及其质量考察为了验证筛选出来的最佳工艺流程和生产条件是否科学可行，3年间我们采用这些条件连续生产了6批产品(商品名飞克痢)，并对每批产品进行了质量考察，包括菌丝形态，菌丝得率(2.5-4％)、酶活力、酸度、水分、抑菌作用等6项指标。同时对其稳定性进行了考察，结果表明，用新工艺生产的产品，菌丝得率稳定，重现性好，抑菌率高，酶活力强，其它各项指标均符合质量标准要求，是生产飞克痢的可行工艺。
效力或活性测定方法和结论飞克痢干混悬剂中的主要菌种根霉菌含有多种糖化酶，其中α-淀粉酶能使淀粉糊精化，又含有很强的葡萄苷酶，而且不含糖苷转移酶；因此根霉在生长的同时进行糖化，能将淀粉完全水解为葡萄糖。
淀粉萄萄糖苷酶活性测定方法目前主要采用碘量法(中国药典2000年版二部淀粉酶测定方法)和斐林试剂定糖法。本研究进行了两种测定方法的正交试验。结果证明，中药药典采用的碘量法比斐林试剂法更适用，更稳定，重现性好，便于操作，也较完善。故决定采用碘量法。
碘量法测定酶活性的基本原理淀粉酶能使淀粉水解具有还原性的葡萄糖，糖的醛基，在碱性碘液中，定量的被次碘酸钠氧化成羧酸，过量的碘用硫代硫酸钠滴定，终点蓝色消失。
计算式如下每1ml碘滴定液(0.1mol/L)相当于9.008mg无水葡萄糖； 在上述条件下，每1g供试品水解淀粉生成1Hmol葡萄糖的酶量为1活力单位(μ)。
每1g供试品的淀粉葡萄糖苷酶活力单位不得少于550μ。
适应症与用法适应症 用于治疗急性感染性腹泻(包括急性细菌性痢疾、急性细菌性肠炎和病毒性肠炎)，急性胃肠炎和消化不良引起的厌食等症。
用法用量 微温(接近人体温)开水冲服，一次1-2g，重症第一次2-3g，日服2-3次。
飞克痢436例的临床疗效初步观察结果1.轮状病毒急性肠炎40例疗效观察，经轮状病毒核酸电泳(PAGE)检测及酶联免疫吸附试验诊断为轮状病毒阳性者(山东省防疫站检测)，用本品治疗总有效率95％，痊愈率92.5％，病程短，1-3日内痊愈率占98.75％，用抗生素无效，只能对症疗法和补液，疗程需拖延7天。
2.痢治疗急性菌痢80例，结果本品总有效率92.5％，阳性庆大霉素治疗组有效率73.3％(两组P＜0.01)。
3.飞克痢治疗急性细菌性肠炎265例，对照组为庆大霉素。结果两组疗程有非常显著性差异(P＜0.005)，飞克痢2日内痊愈率为84.88％，而庆大霉素仅为15.79％。总有效率相近，分别为飞克痢91.7％，庆大霉素为88％。
权利要求
1.一种药物组合物，含有米根霉(Rhizopus oryzae)AS 3.866和日本根霉(Rhizopusjaponicus)AS 3.868的菌丝体各半及米粉。
2.根据权利要求1所述的产品，其特征在于剂型为干混悬剂。
3.备权利要求1所述组合物的方法，其特征在于按以下步骤进行(1)两株原菌种分别接种于麦芽汁琼脂斜面培养基上，24-40℃培养20-48小时；(2)传斜面菌种从(1)的米根霉和日本根霉原菌种斜面上，分别取豆粒大小菌种，接种于麦芽汁琼脂斜面上，24-40℃培养20-48小时；(3)一级培养发酵分别刮取已培养20-48小时的米根霉和日本根霉的斜面菌种，分别加适量灭菌0.85％生理盐水研匀，即为一级菌液，一级培养发酵液为麦芽汁加蛋白胨，用乳酸调至pH4.8，在发酵液中接种菌液后，上摇床培养发酵，条件为通气量40-60％，温度24-40℃，20-48h，转速150-350转/分，过筛收集菌丝，备用；(4)二级培养发酵取一级菌丝加入适量灭菌0.85％盐水研匀，再加入与一级发酵液等量的盐水，混匀，即为二级用菌液，接种在二级发酵液中培养，二级培养发酵液为麦芽汁加蛋白胨，培养条件为通气量40-60％，温度24-40℃，20-48h，转速150-350转/分，收集菌丝，备用；(5)拌粉固培升温干燥将从(4)获得的湿菌丝打散，拌入米粉中，28-40℃培养8-17h，立即翻动，通风，升温至40-50℃，翻动至干燥。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于各步骤为(1)两株原菌种分别在麦芽汁琼脂斜面培养基上32℃培养24-32小时；(2)传斜面菌种，条件为接种于13Bé麦芽汁+2％琼脂的培养基上，32℃培养24-36h；(3)一级培养发酵，条件为一级培养发酵液为10Bé麦芽汁，加0.5％-1％蛋白胨，接种的米根霉和日本根霉的斜面菌种一级菌液量为按1000ml三角烧瓶装量为500ml计算，每个三角瓶中接种的一级菌液量相当于各菌种的1/5斜面-1/2斜面，混匀，如培养液体积增大，依此比例扩大加入的一级菌液量，培养条件为通气量40-60％，温度24-40℃，20-48h，转速150-350转/分；(4)二级培养发酵，条件为二级培养发酵液为12Bé麦芽汁，加0.5％-1％蛋白胨，接种量为14％-16％，培养条件为通气量40-60％，温度24-40℃，20-48h，转速150-350转/分，收集菌丝，备用；(5)拌粉固培升温干燥，其中二级发酵菌丝与米粉比例为1∶0.5-5，培养条件为28-40℃培养8-17h，立即翻动，通风，升温至40-50℃，翻动至干燥，并过10-60目筛，即得。
5.据权利要求4所述的方法，其特征在于各步骤的条件为传斜面菌种的培养时间为32℃培养36h；一级培养发酵一级培养发酵液为10Bé麦芽汁，加0.5％蛋白胨，用乳酸调至pH4.8，在发酵液中接种一级菌液的量为按1000ml三角烧瓶装量为500ml计算，每个三角瓶中接种的一级菌液量相当于各菌种的1/3斜面，上摇床培养发酵，条件为通气量50％，温度32℃，36h，转速180-200转/分，过筛收集菌丝，备用；二级培养发酵的条件为二级培养发酵液为12Bé麦芽汁，加0.5％蛋白胨，接种量为14％，培养条件为通气量50％，温度32℃，40小时，转速190-200转/分收集菌丝，备用；拌粉固培升温干燥时，培养条件为优选35℃培养12-15h，立即翻动，通风，升温至45-47℃，翻动至干燥，过40目筛。。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于一级培养发酵得到的菌丝体可以直接进行拌粉固培升温干燥过程，制得产品。
7.根据权利要求3-6中任一权利要求所述的方法，其特征在于将步骤(2)斜面得到的菌种用常规方法保存，在需要时从一级培养发酵步骤直接进行制备过程。
8.根据权利要求3-6中任一权利要求所述的方法，其特征在于一、二级培养发酵的C源选自8-13Bé麦芽、7％土豆丝液、7％大米液、7％地瓜液、7％玉米液、7％鲜土豆丝液、糯米液或7％糊精液，N源选自0.2％-1％蛋白胨、1％酵母、50％牛肉汁和纯牛奶、30％豆饼水解液、15％花生渣水解液或黄豆粉水解液，二者的比例可任意组合，采用麦芽和蛋白胨时，二者的组合是13Bé0.2％、8Bé0.7％、10Bé0.5％或5Bé0.9％。
9.根据权利要求1或2所述的组合物在制备治疗感染性急性腹泻、急性胃肠炎和消化不良的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其中的感染性急性腹泻包括急性细菌性痢疾、急性细菌性肠炎、病毒性肠炎和霍乱。
全文摘要
本发明涉及用毛霉科根霉属的米根霉(Rhizopusoryzae)AS 3.866菌株和日本根霉(R.japonicus)AS 3.868菌株制备的干混悬剂、制备方法及其在治疗各种感染性急性腹泻、急性胃肠炎和消化不良过程中的用途。
文档编号A61P31/00GK1526413SQ0310510
公开日2004年9月8日 申请日期2003年3月3日 优先权日2003年3月3日
发明者蔡剑前 申请人:蔡剑前