一种蛋白酶及其生产菌株的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于水产蛋白技术领域，具体涉及一种蛋白酶及其生产菌株。
【背景技术】
[0002] 蛋白酶英文名Protease，又叫肽酶peptidase，是生物体内一类蛋白质水解酶，可 以将蛋白质水解生成氨基酸和小分子肽。在自然环境中，蛋白酶无处不在，动物、植物、微 生物都含有丰富的蛋白酶资源。蛋白酶不仅在生物体的新陈代谢中起着不可替代的作用， 如细胞分化、消化吸收等，与人类的生产生活也息息相关。作为一种常见的生物催化剂，蛋 白酶是最重要的工业酶之一，其生产总量占到整个工业酶市场的65%，广泛应用于食品、医 药、洗涤、制革、化妆品等工业中。目前，微生物来源蛋白酶是应用最广泛的，因为微生物生 长迅速易于培养并且可以相对容易的改造获得高产菌株或工程菌株。所以从自然界中筛选 具有特异性活力的蛋白酶是非常有必要的。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种蛋白酶及其生产菌株，即从微球菌发酵粗酶液中分离纯 化的蛋白酶，及其制备方法和主要酶学性质，从而弥补现有技术的不足。
[0004] 本发明首先提供一种藤黄微球菌（Micrococcus luteus) NH54PC02,该菌株保藏于 2014年12月23日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄 所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)，保藏编号为 CGMCC NO. 10238。
[0005] 本发明还提供一种从上述藤黄微球菌中分离的蛋白酶，包括有如下的性质：
[0006] I) SDS-PAGE 电泳分子量为 25kDa.，
[0007] 2)乙二胺四乙酸二钠（EDTA)、苯甲基磺酰氟（PMSF)和胃蛋白酶抑制剂 (pepstatin A)能够完全抑制酶活，
[0008] Fe2+，Ni2+，Cu2+、Zn2+、二甲基亚砜、甲醇、乙醇和异丙醇能够部分抑制酶活，
[0009] Mn2+可以很好的促进酶活，
[0010] 3)其在pH 6~11的范围内具有较强的酶活力，最适的pH为10.0 ;
[0011] 4)上述的蛋白酶，在40°C保温Ih后，酶活力保留90% ;
[0012] 上述的蛋白酶其最适的反应温度为50°C。
[0013] 本发明蛋白酶可以用于水产蛋白（虾头、虾粉、鲳鱼蛋白）的水解。
【附图说明】
[0014] 图1 :本发明微球菌产酶曲线和生长曲线
[0015] 图2 :本发明的脂肪酶纯化过程电泳图；其中泳道1为标准分子量蛋白；泳道2为 微球菌发酵液；泳道3为70 %硫酸铵沉淀透析液；泳道4为DEAE离子交换层析溶液；泳道 5为苯基疏水层析溶液。
[0016] 图3 :本发明蛋白酶Mascot评分柱状图和本发明蛋白酶测序覆盖率
[0017] 图4 :pH和温度对本发明蛋白酶活性和稳定性的影响。A，pH对酶活力的影响；B， PH对酶稳定性的影响；C，温度对酶活力的影响；D，温度対酶稳定性的影响；
[0018] 图5 :本发明蛋白酶水产品酶解效果：A，水解前后水产品氨基态氮含量；B，水解前 后水产品多肽含量。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合【具体实施方式】对本发明的酶的纯化步骤、酶的性质进行详细描述。
[0020] 实施例1 :蛋白酶产生菌的筛选及分离纯化步骤
[0021] 本发明的酶是从微球菌发酵粗酶液中分离纯化，该菌株是验从南海沉积物中筛选 得到的，具体描述如下：
[0022] 菌株筛选及培养
[0023] 将冻存于_20°C的南海沉积物在无菌操作台内均质后取Ig于IOmL灭菌的陈海水 中震荡混匀。梯度稀释上述混匀液至10'每个稀释梯度取〇. ImL均匀涂布于筛选培养基 平板上，28°C恒温培养。提取在筛选平板上产生水解圈的单菌落。
[0024] 筛选使用的培养基的组成如下：
[0025] 筛选培养基：5g/L蛋白胨，lg/L酵母粉，0. lg/L柠檬酸铁，20g/L琼脂粉，陈海水定 容，121°C蒸气灭菌20分钟。
[0026] 种子培养基：5g/L蛋白胨，lg/L酵母粉，0. lg/L柠檬酸铁，陈海水定容，115°C蒸气 灭菌20分钟。
[0027] 发酵培养基：5g/L蛋白胨，lg/L酵母粉，0. lg/L柠檬酸铁，陈海水定容，115°C蒸气 灭菌20分钟。
[0028] 本发明中藤黄微球菌在液体培养基中呈黄色，镜检为球形；而且其发酵过程生 产迅速、产酶周期短，在28°C和180rmp条件下培养36-48h即可高产蛋白酶；此外，该藤 黄微球菌在高温40°C条件下亦可较好的生长并产蛋白酶，有利于减少发酵过程冷凝循环 水的使用、降低污染杂菌的可能性，具有较高的工业应用前景。将该菌命名为藤黄微球菌 (Micrococcus luteus) NH54PC02,于2014年12月23日保藏在位于北京市朝阳区北辰西 路1号院3号中国科学院微生物研宄所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心（China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)，保藏编号为 CGMCC NO. 10238。
[0029] 实施例2 :
[0030] 划线挑取筛选的藤黄微球菌单克隆于种子培养基中28°C ISOrpm震荡培养24小 时，将种子培养液按照2% (v/v)的接种量接种于发酵培养基中，28°C 180rpm震荡培养36 小时，4°C 6000rpm离心10分钟得到发酵粗酶液。
[0031] 粗酶液硫酸铵沉淀
[0032] 离心得到的发酵粗酶液进行70%硫酸铵沉淀。冰水浴保温，磁力搅拌的条件下均 匀缓慢地向发酵粗酶液加入粉碎并干燥的硫酸铵。4°C静置过夜后离心收集沉淀，用20mM pH 8. OTris-Hcl缓冲液复溶沉淀，并在此缓冲液中透析。
[0033] DEAE Sepharose Fast Flow 阴离子交换层析
[0034] 用pH 8· 0的20mM Tris-HCl缓冲液充分平衡DEAE S印harose FF离子交换柱 (10cm*l. 2cm)，上样吸附。然后用 pH 8. 0 的 20mM Tris-HCl 含有 NaCl (0· 1-0. 6M of NaCl) 进行梯度洗脱，收集0D280出峰平衡液及洗脱液。对收集管中的溶液测酶活和蛋白质分析。
[0035] Phenyl Sepharose 6Fast Flow 苯基疏水层析
[0036] 上柱前，向上步OM NaCl洗脱液酶液中添加氯化钠至终浓度为2M再上柱。上柱后 用高浓度到低浓度的氯化钠缓冲液先后洗脱（2M-1. 5M-1. 0M-0. 5M-0M)，收集洗脱液，对收 集管中