产蛋白酶细菌及应用的制作方法

本发明涉及蛋白酶，还涉及产蛋白酶细菌及应用。

背景技术：

蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，已成为目前应用最广泛的酶类，也是目前需求量最大的酶类，广泛存在于动物、植物及微生物中，约占所有蛋白质的2％，执行着许多不同的功能，它在洗涤、皮革、银洗、医药、食品、饲料、化工等方面广为应用，约占酶制剂市场的60％。传统动植物来源的蛋白酶具有生长周期长、生产成本高、不易于控制管理、易受土地和季节限制等缺点，微生物日益成为工业酶制剂的主要来源。而我国产蛋白酶微生物来源有限，目前国内进入蛋白酶生产的微生物大多数来源于陆地或淡水环境，因而，寻找并开发海洋来源的产蛋白酶微生物资源，进一步掌握新型蛋白酶的相关特性具有重要的科研、应用以及商业价值。

地球表面的2/3以上由海洋沉积物覆盖，这些沉积物里广泛存在着大量的具有代谢活性的微生物，包括细菌和古菌。这些微生物将海洋中悬浮颗粒有机氮降解为高分子量的溶解有机氮，溶解有机氮再被分解、氨化(矿化)、硝化和反硝化，最终参与海底沉积物中氮循环，蛋白质是沉积物中颗粒有机氮和溶解有机氮的重要组成部分，因此产蛋白酶细菌在他们的降解过程中起着重要作用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种高效产蛋白酶细菌及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种高效产蛋白酶细菌，为芽孢杆菌BH70049(Bacillus sp)，已于2016年5月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为CGMCC No.12490。

所述产蛋白酶细菌BH70049从渤海海底沉积物中分离筛选获得，对该菌进行16SrRNA基因序列分析，并通过在GenBank中比对发现其与Bacillus altitudinis strain 41KF2b^T(登录号：NR042337)相似性最高，为99％。从而将分离出来的细菌命名为Bacillus altitudinis BH70049。

已于2016年5月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为CGMCC No.12490。

一种高效产蛋白酶细菌的应用，所述细菌在生产蛋白酶中的应用。

所述细菌Bacillus altitudinis BH70049在生产蛋白酶中的应用。

进一步的说，将所述细菌Bacillus altitudinis BH70049于酪蛋白明胶产酶培养基中培养获得蛋白酶。

更进一步的说，将所述Bacillus altitudinis BH70049在pH＝8、酪素浓度为3g/L、明胶浓度为5g/L、酵母粉浓度为2g/L的酪蛋白明胶产酶培养基中培养获得蛋白酶。产酶培养基中酶活最强，经蛋白酶对酪蛋白酶活测定其酶活达到53.09U/mL.

本发明所具有的优点：

1.本发明的细菌BH70049具有产蛋白酶酶活高的特性，该菌能够降解酪蛋白、明胶和弹性蛋白，其在酪蛋白平板、明胶平板和弹性蛋白平板上的水解圈直径/菌落直径依次为4.8、5.42、1.32，在发酵培养基中酶活较高，其产生蛋白酶对酪蛋白酶活测定酶活达到53.09U/mL。

2.经本发明优化后，该菌产酶能力明显提高，酶活达到85.98U/mL。.

3.本发明菌株分离自渤海海底表面沉积物中，属于Bacillus菌株，因而无毒无害，未经遗传改造，可放心应用到在食品、医药、制革、洗涤剂、化妆品、纺织、动植物蛋白及废物处理等行业中。

附图说明

图1为本发明实施例提供的产蛋白酶菌株BH70049在酪蛋白平板上产生水解圈照片。

图2为本发明实施例提供的产蛋白酶菌株BH70049在明胶平板上产生水解圈照片。

图3为本发明实施例提供的产蛋白酶菌株BH70049在弹性蛋白平板上产生水解圈照片。

图4为本发明实施例提供的产蛋白酶菌株BH70049培养条件优化前后蛋白酶酶活。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

1.菌株BH70049的分离、纯化和保存。

从渤海海底表层无污染沉积物中采集样品，称取1g沉积物，用无菌海水10倍梯度稀释至10^-6，混匀后取0.1mL(10^-2-10^-6)的稀释样品涂布于筛选培养基平板上，28℃倒置培养3-5天，分别挑取不同菌落形态的产透明水解圈的单菌落，接至2216E培养基平板上，采用连续划线平板的方法纯化菌株，之后转接至2216E培养基斜面。将纯化后的菌株分别转接至酪蛋白明胶固体培养基(3g/L酪素,5g/L明胶，2g/L酵母粉，15g/L琼脂粉,人工海水)，培养4天，测定菌落和水解圈直径，并计算水解圈和菌落直径的比值，其比值可以作为定性试验，直接反映了菌株降解蛋白质的能力。因此，本研究选取了水解圈和菌落直径比值最大的菌株BH70049作为研究对象。

发酵培养基(用于菌株的代谢产酶):3g/L酪素，5g/L明胶，2g/L酵母粉，人工海水，pH8.0。配制方法：称取0.3g酪素,用少许1MNaOH浸润,加少许去离子水,加热至溶解；称取0.5g明胶加少许去离子水,加热至溶解；上述溶解的酪素和明胶混合,用去离子水定容至20mL,调pH为8.0；在80mL人工海水中加入0.2g酵母粉,调pH为8.0；分装至每瓶40mL,分别灭菌,121℃,20min。接种时，每瓶培养基中加入10mL的酪蛋白明胶混合溶液。

筛选培养基(酪蛋白明胶固体培养基)：在80mL人工海水中加入0.2g酵母粉，加入1.5g琼脂粉，调pH为8.0；分别灭菌，121℃，30min.灭菌结束后，冷却到45－50℃时，而后与酪蛋白明胶混合物混匀后倒平板；其中，酪蛋白明胶混合物为称取0.3g酪素，用少许1M NaOH浸润，加少许去离子水，加热至溶解；称取0.5明胶加少许去离子水，加热至溶解；上述溶解得酪素和明胶混合，用去离子水定容至20mL调pH为8.0；

2216E培养基：酵母粉2.5g/L、蛋白胨5g/L、人工海水、琼脂粉1.5g/L。(自然pH值,于121℃，0.11Mpa下灭菌30备用)。

人工海水(Smibert and Krieg,1994):NaCl 2.75％、MgCl₂ 0.5％、MgSO₄0.2％、CaCl₂ 0.05％、KC1 0.1％、FeS0₄ 0.0001％,去离子水配制。

所述菌株短期保藏方式为：将纯化的菌株接种至2216E固体斜面，待菌落长好后保藏于4℃冰箱；长期保藏方式为：将纯化的菌株培养至生长期的对数后期或稳定期，加入终浓度为20％的甘油混匀，做成甘油管于-80℃冰箱中冷冻长期保藏。

菌株鉴定

将2216E斜面上的菌株在2216E平板划线进行活化，28℃培养24h后对平板上产生的单菌落观察，菌落呈圆形，黄色，不透明，边缘较整齐，表面光滑，易挑取，具有典型细菌的表型特征,初步鉴定为细菌。

分子鉴定：为了进一步确定本实施细菌菌株BH70049的系统进化地位，对其16SrRNA基因序列测定与系统发育分析。PCR反应采用通用引物(正向引物27F和反向引物1492R)，反应体系为：反应体系50μL体积，反应液组成：1μL DNA模板，25μL2×MastarMix，1μL 27F，1μL 1492R，超纯水补足至50μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性45s，56℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测合格后送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。用NCBI的Nucleotide BLAST将测序得到的16SrDNA序列进行比对分析，经过比对，本实施菌株与参比菌株Bacillus altitudinis strain 41KF2b^T相似度为99％，因此，可以判定这株菌株为芽孢杆菌属。

Bacillus altitudinis BH70049 16S rRNA基因拼接序列：

ACCGTCACTTCGGCGGCTGGCTCCAATAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTGCAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTAAACCTTGCGGTCTCGCAGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCGAAGGGAAAGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCAAGCAGTTACTCTTGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGACAGCCGAAACCGTCTTTCATCCTTGAACCATGCGGTTCAAGGAACTATCCGGTATTAGCTCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCCGGGAGCAAGCTCCCTTCTGTCCGCTCGACTGCATGTATAGGCCGCCGC

综合以上鉴定结果，将该菌株命名为Bacillus altitudinis BH70049；已于2016年5月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.12490,简称菌株BH70049。

2.高效产蛋白酶菌株BH70049水解蛋白质的能力分析

(1)高效产蛋白酶菌株BH70049在不同蛋白质底物平板上产生水解圈测定

将斜面高效菌株BH70049在2216E固体平板上划线活化，倒置于28℃培养24h，然后挑取2216E平板菌落分别接种至酪蛋白平板、明胶平板和 弹性蛋白平板上，室温培养5天，测定菌落和水解圈直径。由于酪蛋白平板、明胶平板培养基颜色是透明的，菌株产生水解圈不易观察，所以加入酸性汞试剂(HgCl₂ 15g、浓盐酸20mL、定容至100mL蒸馏水)后,可观察到明显的水解圈。测定三种平板上水解圈和菌落直径，并计算其比值。最终测得菌株BH70049在酪蛋白平板、明胶平板和弹性蛋白平板上水解圈直径/菌落直径依次为4.8、5.42、1.32(参见图片1，2，3)，因此，初步鉴定该菌株具有降解蛋白质的能力，并且对不同蛋白质具有不同的降解能力。

(2)高效产蛋白酶菌株BH70049产蛋白酶酶活测定

酶活力的测定方法参考轻工业标准QBT 1803-1993进行，具体如下：

1)酪氨酸标准曲线制作

精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g,用50mMTris-HCl(pH 8.0)配成1mg/mL酪氨酸标准溶液，再用50mMTris-HCl(pH 8.0)逐步稀释成10、20、30、40、50、60、70、80、90、100|μg/mL的酪氨酸溶液,各取100μL,加入500μL 0.4M Na₂CO₃溶液,再加入100μL Folin-phenol，40℃显色10min,于660nm测吸光度,制作标准曲线。

2)菌株BH70049产蛋白酶对酪蛋白酶活的测定

①将菌株接种到50mL(100mL三角瓶)发酵培养基中，于28℃、180r/min摇床培养，3d后取适量发酵液，13000r/min离心1min,上清即为粗酶液，取100μL上清于1.5离心管。

②向离心管中加入已于40℃预热的2％酪素溶液(50mMTris-HCl(pH 8.0)配制)，40℃水浴中保温10min。

③加入200μL0.4MTCA终止反应，40℃保温10min。

④13000r/min离心3min,取100μL上清，加入500μL0.4M Na2CO3,再加100μL Folin-phenol，40℃显色10min,于660nm测吸光度。对照组将步骤②、③颠倒，以变性失活的酶为对照。

酶活力单位U定义为：在以上条件下，每毫升液体酶水解酪蛋白每分钟释放1μg酪氨酸所需要的酶量。

依据上述制作出来的酪蛋白标准曲线和测出来的吸光值，得出菌株BH70049有较高的酶活，为53.09U/mL(参见图片4)。

3.产蛋白酶菌株BH70049发酵产酶条件的优化

蛋白酶的产生和分泌能力与菌株发酵条件(如温度、pH，发酵时间、装液量等)有很大关系，本发明对发酵产酶过程中温度、pH、发酵时间、装液量进行了优化，最终使产酶能力显著提高。

优化前的发酵条件是：温度28℃、pH8.0、装液量50mL(100mL三角瓶)、发酵72h，菌株BH70049在这个基础发酵条件下产酶能力较强(酶活为53.09U/mL),但这可能不是菌株BH70049产蛋白酶的最优发酵条件，因此，本发明对发酵条件进行优化，分别设置了温度为25℃，30℃，34℃，37℃；设置pH＝5，6，7，9，10；设置装液量为20mL，30mL，40mL，60mL；设置发酵时间为48h,60h,84h,96h等一系列的培养条件，对这些设置发酵条件进行正交试验，结果表明温度为30℃、pH＝9、装液量为30mL(100mL三角瓶)、发酵时间60h时蛋白酶酶活最高，产酶能力最强。发酵条件优化后，测得菌株BH70049产蛋白酶酶活达85.98U/mL(参见图片4)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院烟台海岸带研究所

<120> 产蛋白酶细菌及应用

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<170> PatentIn version 3.1

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<212> DNA

<213> 产蛋白酶细菌(Bacillus altitudinis)

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gccgc 1445