本发明涉及一种以反式8-甲基-6-壬烯酸为底物生物合成辣椒素的方法，属于生物工程领域。
背景技术：
辣椒素，学名反式-8-甲基-N-香草基-壬烯酰胺，是辣胡椒(辣椒属)的一种具有刺激性味道的次生代谢产物。辣椒素是由辣椒素合成酶(CS)合成的，辣椒素合成酶是一种酰基转移酶。
辣椒果实中的辣味成分，最早由Threhs(1876年)从辣椒果实中分离出来，并命名为辣椒素(Capsaicin)。之后，D.J.Bennet等人利用色谱、核磁共振等仪器详细分析其化学组成后发现，辣椒中的辛辣成分是由一系列同系物或相似物所组成，它们的结构和性质与辣椒素非常相似，它们被统称为辣椒素类物质。此后，又有一些辣椒素的同类物在辣椒果实中被发现，至今已发现约20种以上的辣椒素类物质，它们主要是：辣椒素，二氢辣椒素，降二氢辣椒素，高辣椒素I，高辣椒素II，高二氢辣椒素I，高二氢辣椒素II，壬酰香荚兰胺，辛酰香荚兰胺和癸酰香荚兰胺等。其中辣椒素(69％)和二氢辣椒素(22％)约占总量的90％以上，其余仅占少量。
目前高纯度天然辣椒素价格昂贵，限制了其在生物农药、化工涂料等低端市场中的应用，而仅能用于食品保健和医药工业等高端市场。
通常采用从天然辣椒中提取的方法来制取辣椒素。早期的方法是将鲜红的干辣椒粉碎后，用乙醚或乙醇等有机溶剂抽提，浓缩得到一种暗红色至橙红色油状液体，这种油状物在国际上统称为辣椒油树脂，此步得率一般占干果重量的1％左右。辣椒油树脂再经乙醚，稀乙醇和碱性水溶液，或石油醚，二氯乙烷等溶剂进一步抽提浓缩后，经石油醚或正己烷结晶可得粗辣椒碱晶体。用化学试剂提取辣椒碱具有浸提能力大，易于工业化生产等优点，但是所得的辣椒素产品纯度低、生产消耗大，难于提高产品效益。
随着生物及化学技术的不断发展，运用生物制取法和化学合成法制取辣椒素将有很好的前景，但目前两种方法仍具有一些难以解决的问题，如设备投资大，难于实现工业化，而化学合成法得到的产品性质有待进一步鉴定。
辣椒素制取工艺的研究，传统的制取方法要么工艺复杂、产品纯度低，要么提取成本高、难于实现工业化生产，其发展受到层层阻碍。
技术实现要素：
本发明首先提供了一种用于以反式8-甲基-6-壬烯酸为底物生物合成天然辣椒素的大肠杆菌(Escherichia coli)spec16-2，于2016年11月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M 2016647，保藏地址为中国武汉的武汉大学。所述大肠杆菌spec16-2高效表达辣椒素合成酶。
本发明还提供应用所述大肠杆菌spec16-2以反式8-甲基-6-壬烯酸为底物生物合成天然辣椒素的方法，包括以下步骤：
(1)制备种子培养液；
(2)转化细胞培养：使用步骤(1)所得的种子培养液，按体积百分比3％的接种量接入M转化培养基中，在28～30℃条件下，180～200转/分钟振荡培养约5～8小时；所述M转化培养基配方为：甘油5～30克/升、酵母提取物2～15克/升、磷酸二氢钾0.5～5克/升、磷酸氢二钾1.0～10克/升、氯化钠0.1～3.0克/升、氯化铵0.1～3.0克/升。
(3)转化：向步骤(2)体系中加入0.5～2.5克/升的反式8-甲基-6-壬烯酸和0.5～2.5克/升的香兰素胺盐酸盐，继续180～200转/分钟振荡培养16～48小时。
在本发明的一种实施方式中，制备种子培养液之前，将保存于甘油管的大肠杆菌接种于固体培养基上，在30℃条件下，静置培养24小时。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)制备种子培养液：是将纯种接种到液体种子培养基中，在30℃条件下，200转/分钟振荡培养16小时，得种子培养液。
在本发明的一种实施方式中，液体种子培养基的配方为：甘油5～20克/升、酵母提取物2～15克/升、磷酸二氢钾0.5～5克/升、磷酸氢二钾1.0～10克/升、氯化钠0.1～3.0克/升、氯化铵0.1～3.0克/升。121℃条件下灭菌20分钟。固体培养基配方为在液体种子培养基基础上添加质量体积比1.5％的琼脂。
本发明的优点是：使用大肠杆菌生物转化反式8-甲基-6-壬烯酸生产辣椒素的方法，辣椒素产物浓度高，能够达到3克/升以上，副产物少，反应条件温和，生产周期短(发酵周期48小时)，生产清洁，产品环境友好，安全可靠，解决了长期以来植物原料提取法和化学合成法遇到的多种难题，具有很大的应用前景。
生物材料保藏
大肠杆菌(Escherichia coli)spec16-2，于2016年11月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M 2016647，保藏地址为中国武汉的武汉大学。
附图说明
图1为大肠杆菌spec16-2转化反式8-甲基-6-壬烯酸生产辣椒素过程中反式8-甲基-6-壬烯酸和辣椒素的变化曲线。
具体实施方式
产物辣椒素的检测方法为：高效液相色谱法使用SHIMADZU LC-20A系统，采用C18反相色谱柱(5μm，150x4.6mm)。移动相的组成有溶剂A(0.1％的三氟乙酸)和溶剂B(乙腈)。梯度洗脱的程序如下：0到5分钟，5％溶剂B；5到9分钟，溶剂B浓度从5％到80％线性增加；9到11分钟，溶剂B浓度80％；11到12分钟，溶剂B浓度5％。流速为0.6mL/min。紫外检测器的检测范围为200到400nm。底物和产物的定性定量通过计算280nm下谱峰的面积获得。
实施例1
大肠杆菌spec16-2菌体在种子培养12小时后以体积百分比3％接种量接入M转化培养基中，菌体培养3小时后加入0.5克/升反式8-甲基-6-壬烯酸和0.5克/升香兰素胺盐酸盐，在30℃条件下200转/分钟振荡培养。20小时后取样测定辣椒碱浓度。
本实施例的大肠杆菌生物转化反式8-甲基-6-壬烯酸生产辣椒素，其涉及的详细步骤如下：
(1)平板培养：将保存于甘油管的大肠杆菌接种固体培养基上，在30℃条件下，静置培养24小时。
(2)制备种子培养液：用步骤(1)所得的平板培养物，接种到液体种子培养基中，在30℃条件下，200转/分钟振荡培养16小时，得种子培养液；
(3)转化细胞培养：使用步骤(2)所得的种子培养液，按体积百分比3％的接种量接入M转化培养基中，在30℃条件下，200转/分钟振荡培养约3小时。
(4)转化：步骤(3)培养约3小时后，加入0.5克/升的反式8-甲基-6-壬烯酸和香兰素胺盐酸盐，200转/分钟振荡培养培养至16小时。
(5)辣椒素浓度检测：转化产品经分析纯乙酸乙酯萃取后使用岛津高效液相色谱仪检测辣椒素浓度，最终辣椒碱浓度达到0.6克/升，摩尔转化率为75％。
在上述利用大肠杆菌生物转化反式8-甲基-6-壬烯酸生产辣椒素的方法中，种子培养使用的液体种子培养基配方为：甘油5～20克/升、酵母提取物2～15克/升、磷酸二氢钾0.5～5克/升、磷酸氢二钾1.0～10克/升、氯化钠0.1～3.0克/升、氯化铵0.1～3.0克/升。121℃条件下灭菌20分钟。固体培养基配方为在液体种子培养基基础上添加质量体积比1.5％的琼脂。
在上述利用该大肠杆菌转化反式8-甲基-6-壬烯酸生产辣椒素的方法中，菌株转化反式8-甲基-6-壬烯酸生产辣椒素的M转化培养基配方为：甘油5～30克/升、酵母提取物2～15克/升、磷酸二氢钾0.5～5克/升、磷酸氢二钾1.0～10克/升、氯化钠0.1～3.0克/升、氯化铵0.1～3.0克/升。121℃条件下灭菌20分钟。
实施例2
大肠杆菌spec16-2菌体在种子培养16小时后以体积百分比3％接种量接入M转化培养基中，菌体培养5小时后加入1.0克/升反式8-甲基-6-壬烯酸和1.0克/升香兰素胺盐酸盐，在30℃条件下200转/分钟振荡培养。24小时后取样测定辣椒素浓度。
本实施例的大肠杆菌生物转化反式8-甲基-6-壬烯酸生产辣椒素，其涉及的详细步骤如下：
(1)平板培养：将保存于甘油管的大肠杆菌接种固体培养基上，在30℃条件下，静置培养24小时。
(2)制备种子培养液：用步骤(1)所得的平板培养物，接种到液体种子培养基中，在30℃条件下，200转/分钟振荡培养18小时，得种子培养液；
(3)转化细胞培养：使用步骤(2)所得的种子培养液，按体积百分比3％的接种量接入M转化培养基中，在30℃条件下，200转/分钟振荡培养约5小时。
(4)转化：步骤(3)培养约5小时后，加入1.0克/升的反式8-甲基-6-壬烯酸和香兰素胺盐酸盐，200～600转/分钟振荡培养培养至24小时。
(5)辣椒素浓度检测：转化产品经分析纯乙酸乙酯萃取后使用岛津高效液相色谱仪检测辣椒素浓度，最终辣椒素浓度达到1.2克/升，摩尔转化率为75％。
在上述利用大肠杆菌生物转化反式8-甲基-6-壬烯酸生产辣椒素的方法中，种子培养使用的液体种子培养基配方为：甘油5～20克/升、酵母提取物2～15克/升、磷酸二氢钾0.5～5克/升、磷酸氢二钾1.0～10克/升、氯化钠0.1～3.0克/升、氯化铵0.1～3.0克/升。121℃条件下灭菌20分钟。固体培养基配方为在液体种子培养基基础上添加质量体积比1.5％的琼脂。
在上述利用该大肠杆菌转化反式8-甲基-6-壬烯酸生产辣椒素的方法中，菌株转化反式8-甲基-6-壬烯酸生产辣椒素的M转化培养基配方为：甘油5～30克/升、酵母提取物2～15克/升、磷酸二氢钾0.5～5克/升、磷酸氢二钾1.0～10克/升、氯化钠0.1～3.0克/升、氯化铵0.1～3.0克/升。121℃条件下灭菌20分钟。
实施例3
大肠杆菌spec16-2菌体在种子培养16小时后以体积百分比3％接种量接入M转化培养基中，菌体培养5小时后加入2.5克/升反式8-甲基-6-壬烯酸和2.5克/升香兰素胺盐酸盐，在30℃条件下200转/分钟振荡培养。48小时后取样测定辣椒素浓度。
本实施例的大肠杆菌生物转化反式8-甲基-6-壬烯酸生产辣椒碱，其涉及的详细步骤如下：
(1)平板培养：将保存于甘油管的大肠杆菌接种固体培养基上，在30℃条件下，静置培养24小时。
(2)制备种子培养液：用步骤(1)所得的平板培养物，接种到液体种子培养基中，在30℃条件下，200转/分钟振荡培养18小时，得种子培养液；
(3)转化细胞培养：使用步骤(2)所得的种子培养液，按体积百分比3％的接种量接入M转化培养基中，在30℃条件下，200转/分钟振荡培养约5小时。
(4)转化：步骤(3)培养约5～10小时后，加入2.5克/升的反式8-甲基-6-壬烯酸和香兰素胺盐酸盐，200～600转/分钟振荡培养培养至24小时。
(5)辣椒素浓度检测：转化产品经分析纯乙酸乙酯萃取后使用岛津高效液相色谱仪检测辣椒素浓度，最终辣椒素浓度达到3.22克/升，摩尔转化率为80％。
在上述利用大肠杆菌生物转化反式8-甲基-6-壬烯酸生产辣椒素的方法中，种子培养使用的液体种子培养基配方为：甘油5～20克/升、酵母提取物2～15克/升、磷酸二氢钾0.5～5克/升、磷酸氢二钾1.0～10克/升、氯化钠0.1～3.0克/升、氯化铵0.1～3.0克/升。121℃条件下灭菌20分钟。固体培养基配方为在液体种子培养基基础上添加质量体积比1.5％的琼脂。
在上述利用该大肠杆菌转化反式8-甲基-6-壬烯酸生产辣椒素的方法中，菌株转化反式8-甲基-6-壬烯酸生产辣椒素的M转化培养基配方为：甘油5～30克/升、酵母提取物2～15克/升、磷酸二氢钾0.5～5克/升、磷酸氢二钾1.0～10克/升、氯化钠0.1～3.0克/升、氯化铵0.1～3.0克/升。121℃条件下灭菌20分钟。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。