一株瑞士乳酸菌及其应用的制作方法

本发明涉及一株瑞士乳酸菌及其应用，具体为一株适用于食醋酿造并可以提高食醋中乳酸含量的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus HS1-8)，属于微生物应用和食醋酿造领域。

背景技术：

乳酸菌广泛分布于自然界中，与人类生活密切相关，具有多种生理功能。随着现代微生物学的发展，食品级乳酸菌的优良特性引起微生物界的关注，乳酸菌已广泛应用于乳制品、肉制品、果蔬制品、软饮料等食品。乳酸菌在酿造工业中的应用也受到越来越多的关注。

乳酸具有酸味柔和、刺激性小，可以缓和醋酸刺激的酸味，同时具有在消化道内降解代谢，产生能量，能起利利尿和缓泻作用，对肝糖原的合成，调节细胞内氧化还原状态和体液均起到良好作用。镇江香醋是我国传统四大名醋之一，具有醇香浓厚，回味悠长的特点。不挥发酸是镇江香醋中重要的风味物质，而且《GB/T 18623-2011地理标志产品镇江香醋》中要求特级镇江香醋的不挥发酸(以乳酸计)含量≥1.60g/100ml。镇江香醋中的不挥发酸以乳酸为主，乳酸含量可以占总不挥发酸的80％以上。

在实际的食醋发酵生产过程中，除了主导醋酸发酵的醋酸菌以外，乳酸菌也是酿造过程中常见的、重要的微生物，并对产品的风味和品质起着重要的作用。传统发酵过程中乳酸菌的主要来源为天然原料带入和带种时带入，在不同的季节、不同批次之间具有较大的差异，尤其在冬季乳酸的含量明显偏低。此外，带入的部分乳酸菌在发酵过程中因不适应高乙醇、高醋酸等特殊酿造环境而无法增值。因此，筛选出适合食醋特殊酿造环境的乳酸菌，应用于食醋的酿造具有重要的意义。

本发明针对上述课题，本发明提供一株适合应用于食醋酿造的瑞士乳杆菌，该菌株可直接应用于食醋的酿造，可明显提高食醋中乳酸的含量，改善产品风味，提高产品品质。

技术实现要素：

本发明从镇江香醋生产工艺过程的酒醪中分离筛选得到一株较适合于食醋酿造使用的瑞士乳杆菌。该乳酸菌的应用可明显提高食醋中乳酸的含量，改善产品风味，提高产品品质。

具体地，该瑞士乳杆菌Lactobacillus helveticus HS1-8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏登记入册的编号为CGMCC NO.12225，保藏日期为2016年3月18。

其分离、纯化及鉴定方法如下：

(1)分离

取10ml经过接种镇江香醋特制大曲后经过酒精发酵的酒醪样品，取1ml样品加入到9ml无菌生理盐水中，在漩涡混合器上混和均匀后，再取1ml稀释过的溶液加入到9ml的生理盐水中，以此类推。选取3个合适的浓度依次涂布到添加有碳酸钙的MRS固体平板上，于37℃厌氧培养箱中培养48h。

分离培养基(MRS培养基)：酪蛋白胨10.0g，葡萄糖20.0g，酵母粉4.0g，牛肉粉8.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温80 1.0g，蒸馏水1000mL，调节pH6.2±0.2。固体培养基添加15～20g/L琼脂粉。筛选培养基添加15～20g/L碳酸钙。

(2)菌株纯化

根据微生物菌落的大小、颜色、光泽、透明度等，挑取钙溶解圈较大的疑似乳酸菌菌落，并利用划线的方法在MRS平板上划线纯化2次。挑取划线后的单菌落进行革兰氏染色和过氧化氢酶，选取革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的菌种在斜面上进行划线后，37℃厌氧培养48h后置于4℃冰箱保存。

(3)菌株初筛

将保存的菌株分别接种到含有9％vol乙醇的MRS培养基中，37℃培养24h后测定发酵液的pH值，选取pH值低于4.0的菌株。

同时将该菌株接种到pH值4.0的MRS培养基中，37℃培养24h，测定发酵液的pH值。

得到一株耐乙醇、耐酸、产酸特性较好的菌株HS1-8，其菌落形态如图1所示。

(4)生理生化特性

表1生理生化特性

注：“+”代表阳性，“-”代表阴性，“W”生长弱。

(5)菌株分子生物学鉴定

检测菌株HS1-8的16S rRNA的序列。

采用生工生物工程(上海)股份有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒，提取本发明筛选到的菌株HS1-8的基因组DNA，PCR扩增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司提供，测序引物如下：

27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT

PCR反应循环条件：

PCR产物的检测：取5ul反应产物，利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。如果PCR成功，在约1500bp处有条带出现。

测序分析：将PCR产物委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，序列如下文16S rRNA序列。测得的序列用BLAST程序在NCBI数据库中比对分析。结果本发明菌株HS1-8与瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)DSM20075的16S rRNA同源性为99％。

菌株HS1-8的16S rRNA序列

CGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAGCAGAACCAGCAGATTTACTTCGGTAATGACGCTGGGGACGCGAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGGAACCTGCCCCATAGTCTGGGATACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAAGAAAGCAGATCGCATGATCAGCTTATAAAAGGCGGCGTAAGCTGTCGCTATGGGATGGCCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGCAATGGCTTACCAAGGCAATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAAGAATAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAACTGCATCGGAAACTGTTTTTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTAGTGCCATCCTAAGAGATTAGGAGTTCCCTTCGGGGACGCTAAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTATTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGTACAACGAGAAGCGAGCCTGCGAAGGCAAGCGAATCTCTGAAAGCTGTTCTCAGTTCGGACTGCAGTCTGCAACTCGACTGCACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGTCTGCAATGCCCAAAGCCGGTGGCCTAACCTTCGGAAGGAGCCGTCTAAGGCAGGGCAGATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGAGAACCTGCGGTTGGA

综合以上结果，将本发明菌株命名为Lactobacillus helveticus HS1-8，于2016年3月18日将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏登记入册的编号为CGMCC NO.12225。

本发明进一步提出了上述瑞士乳杆菌在食醋生产中的应用。

经过试验表明，本发明的瑞士乳杆菌可以有效地提高镇江香醋醋醅中乳酸的含量，有效地改善镇江香醋的风味与品质。

有益效果：本发明提供一株适合食醋酿造的瑞士乳杆菌，可直接添加于食醋的酿造过程中，通过该乳酸菌的使用，可以改善因季节温度变化、老菌种退化等问题引起的乳酸含量降低的问题。通过该乳酸菌的使用，可明显提高醋醅中乳酸菌的相对丰度和镇江香醋中乳酸的含量，改善镇江香醋的风味与品质。

附图说明

图1为瑞士乳杆菌Lactobacillus helveticus HS1-8的菌落形态图；

图2为发酵过程中接种后、露底和封醅时总酸的含量变化示意图；

图3为发酵过程中接种后、露底和封醅时乳酸的含量变化示意图。

具体实施方式

本发明从镇江香醋生产工艺过程的酒醪中分离筛选得到一株较适合于食醋酿造使用的瑞士乳杆菌，该瑞士乳杆菌Lactobacillus helveticus HS1-8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏登记入册的编号为CGMCC NO.12225，保藏日期为2016年3月18日。

下面通过具体的实施例详细说明该瑞士乳杆菌Lactobacillus helveticus HS1-8在镇江香醋生产中的应用。

1.菌株的扩大培养

一级种子液的制备：按照5％的接种量，将纯化的瑞士乳杆菌HS1-8接种到液体MRS培养基中，37℃培养20h。

二级种子液的制备：选用50L液态发酵罐，加入35L处理过的米浆，米浆中米粉含量15％～25％，所述米浆的处理过程如下：100℃高温糊化30min，添加6～8u/ml的淀粉酶保持85～90℃液化30min，然后添加100～300u/ml的糖化酶保持55～60℃糖化30min。添加2‰的脱脂奶粉后，115℃灭菌20min。按照5％的接种量接入一级种子液。控制温度37℃，罐内压强为0.05MPa，搅拌速度为60r/min，以NaOH溶液控制培养液pH值恒定为6.0，发酵24h。发酵结束后，乳酸菌的活菌数达到10⁹cfu/ml。

2.醋醅接种发酵

选取6个400kg大缸，每个缸中加入酒醪250kg，麸皮90kg，大糠50kg。选3个缸为试验组，每个缸中接入11L二级发酵种子液，剩余3个缸为对照组。按照镇江香醋酿造工艺进行带种，翻醅发酵。

3.总酸和乳酸含量的检测

发酵过程中，取接种后、露底和封醅时的卤子进行检测。

总酸(以乙酸计)采用酸碱滴定法测定，测定结果如图2所示。

乳酸采用高效液相色谱法，参照《GB/T 18623-2011地理标志产品镇江香醋》附录B中方法，测定结果如图3所示。

在醋酸发酵过程中，试验组和对照组的总酸含量没有显著性差异。在发酵过程中，试验组的乳酸含量明显高于对照组，封醅时试验组乳酸含量比对照组提高11.4％。

本发明的菌株HS1-8可较好的作为乳酸菌强化菌种应用于镇江香醋的生产中，通过该菌株的强化可明显提高镇江香醋中的乳酸含量，提高产品品质。