一种海洋链霉菌及其在制备那西肽中的应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682及其在制备那西肽中的应用。

背景技术：
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近年来，动物养殖领域对抗生素的无节制添加以及临床领域对抗生素长期、反复、大剂量的滥用，加剧了各大类耐药致病菌迅速产生和蔓延，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)、耐万古霉素肠球菌(vancomycin-resistant Enterococcus,VRE)、多耐药结核分枝杆菌(multidrug-resistant tuberculosis,MDRMT)，以及近年来新出现的被称为“超级细菌”的“产NDM-1耐药细菌(新德里-金属-β-内酰胺酶，New Delhi metallo-β-lactamase)”。与此形成鲜明对比，新型抗菌抗生素的发现数量却急剧下降，近10年来，只有达托霉素和替加环素等几个新抗生素上市，远远不能满足人类对感染性疾病防治的需要。因此，开发新型抗生素显得尤为紧迫。

那西肽(nosiheptide)属于硫肽类(thiopeptide)抗生素，那西肽最早由法国学者在链霉菌Streptomyces actuosus 40037中发现，其结构式如式(I)所示。那西肽具有出色的抗感染活性，其对革兰氏阳性菌有显著的抑制作用，最小抑菌浓度(MIC)平均值为0.008μg/mL，其中对金黄色葡萄球菌、四联球菌的抑菌浓度为0.001μg/mL，对小球菌属(Micrococcus)、八叠球菌属(Sarcina)、梭菌属(Clostridium)、链球菌属(Streptococcus)、双球菌属(Pneumococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、杆菌属(Bacillus)细菌的MIC为0.0001～0.01μg/mL；此外，那西肽还具有抗病毒活性，对乙肝病毒HBSAg和HBEAg的50％抑菌浓度(IC₅₀)分别小于12.5μg/mL和41.6μg/mL，治疗指数分别大于16和4.8，在12.5μg/mL浓度下对细胞内HBV DNA的抑制率为26.4％。因此，那西肽有望开发成为新一代抗感染抗生素，在抗感染药物研究开发中极具研究开发价值。

技术实现要素：
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本发明的第一个目的是提供一种能够产生那西肽的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682，该菌于2016年6月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2016307。

本发明的第二个目的是提供海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682在制备那西肽中的应用。

本发明的第三个目的是提供那西肽的制备方法，所述的那西肽是从海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682的发酵培养物中制备得到的。

优选，所述的那西肽是从海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682的发酵培养物中制备得到的，具体包括以下步骤：

(a)制备海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682的发酵培养物，将该发酵培养物的发酵上清液和菌丝体分开，发酵上清液用丁酮萃取，丁酮相经浓缩后得到浸膏A，菌丝体用丙酮浸泡萃取，丙酮浸提液经浓缩后得到浸膏B；

(b)将浸膏A和浸膏B合并，采用硅胶柱层析，以氯仿-甲醇作为洗脱剂，从体积比100:0、95:5进行梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比为95:5洗脱的馏分Fr2；馏分Fr2经纯化后得到那西肽。

所述的制备海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682的发酵培养物是通过以下方法制备：

将海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682接入种子培养基中，发酵得种子培养液，将种子培养液接入到发酵培养基，发酵得到发酵培养物，所述的种子培养基和发酵培养基的配方均为：大豆粉10g/L，淀粉5g/L，细菌学蛋白胨2g/L，葡萄糖20g/L，酵母膏2g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，CaCO₃ 2g/L，海盐30g/L，余量为水。

本发明提供了一株能够产生那西肽的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682，利用该菌可以制备那西肽，从而为那西肽的生产制备提供了生物制备方法，具有广阔的应用前景。

本发明的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682于2016年6月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M 2016307。

附图说明：

图1是海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682的系统进化树，其中SCSIO 1682代表海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682；

图2是海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682发酵生产那西肽的HPLC图谱。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682的分离与鉴定

本发明的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682是从我国三亚鹿回头海域(109°48'E，18°23′N)水深45m的沉积物样品中分离得到的。

该菌株的分类学特征是：

1、形态学特征：

菌落干燥，单菌落一般呈圆形，较小，较紧密，不易扩散，中间凸起，基内菌丝与气生菌丝结合紧密不易挑起，末期产孢子后，孢子易刮取。在ISP4培养基上形成浅褐色的气生菌丝和黄色的基质菌丝。

2、分子生物学分离特征：

提取上述分离的菌株的基因组DNA，通过常规方法PCR扩增其16S rDNA序列，并测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，构建基于16S rDNA序列的系统进化树(如图1所示)，显示菌株SCSIO 1682与Streptomyces wuyuanensis FX61T 16S rDNA的序列相似性为99％，表明菌株SCSIO 1682属于链霉菌属(Streptomyces)的一个种。

综上所述，鉴定菌株SCSIO 1682属于链霉菌属的一个种，命名为海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682，该菌于2016年6月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M 2016307。

实施例2：那西肽的分离鉴定

1、制备海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682的发酵培养物：

(1)种子培养基和发酵培养基的配制：

a)种子培养基的配制：每升种子培养基中含有10g大豆粉，5g淀粉，2g细菌学蛋白胨，20g葡萄糖，2g酵母膏，0.5g K₂HPO₄，0.5g MgSO₄·7H₂O，2g CaCO₃，30g海盐，余量为自来水，将上述组份混合均匀，调节pH至7.0。配制1L种子培养基，然后平均分装于20个250mL锥形瓶中，每个装有50mL种子培养基，121℃灭菌30min备用。

b)发酵培养基的配制：每升发酵培养基中含有10g大豆粉，5g淀粉，2g细菌学蛋白胨，20g葡萄糖，2g酵母膏，0.5g K₂HPO₄，0.5g MgSO₄·7H₂O，2g CaCO₃，30g海盐，余量为自来水，将上述组份混合均匀，调节pH至7.0。配制1L发酵培养基，然后平均分装于5个1000mL锥形瓶中，121℃灭菌30min备用。

(2)种子的培养：

将活化的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682(保藏编号为：CCTCC NO：M 2016307)接入到装有50mL种子培养基的250mL锥形瓶中，于28℃、200rpm的摇床上培养24h，得到种子培养液。

(3)规模发酵培养：

将上述锥形瓶中的50mL种子培养液转接到装有200mL发酵培养基的1L锥形瓶中，于28℃、200r/min的摇床上培养7天，获得海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682的发酵培养物。

2、海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682所产那西肽的分离

(1)发酵培养物的萃取

将海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682的发酵培养物进行离心分离(3800～4000r/min，10～15min)使发酵上清液与菌丝体分开；发酵上清液使用丁酮进行等体积萃取3次，丁酮相经旋蒸冷凝浓缩之后得到浸膏A；菌丝体使用丙酮(2L)浸泡萃取，超声处理得到丙酮浸提液，丙酮浸提液经旋蒸冷凝浓缩后得到浸膏B。

(2)那西肽的提取

经HPLC分析，浸膏A和浸膏B的成分类似，将浸膏A和浸膏B合并，经正相硅胶柱层析，用氯仿-甲醇作为流动相，从体积比100:0、95:5、92:8、90:10、8:2、7:3、1:1、0:100进行梯度洗脱，100％氯仿梯度下洗脱下来的馏分记为Fr1，氯仿-甲醇体积比为95:5梯度下洗脱下来的馏分记为Fr2，氯仿-甲醇体积比为92:8梯度下洗脱下来的馏分记为Fr3，氯仿-甲醇体积比为90:10梯度下洗脱下来的馏分记为Fr4，氯仿-甲醇体积比为8:2梯度下洗脱下来的馏分记为Fr5，氯仿-甲醇体积比为7:3梯度下洗脱下来的馏分记为Fr6，氯仿-甲醇体积比为1:1梯度下洗脱下来的馏分记为Fr7，100％甲醇梯度下洗脱下来的馏分记为Fr8。

对上述馏分Fr1-8进行高效液相分析，发现Fr2馏分中含有那西肽，Fr2馏分经反相ODS(YMC-Pack ODS-A column，250×20mm,5μm)半制备高效液相色谱分离纯化(CH₃CN/H₂O体积分数60％～100％梯度洗脱30min，流速2.5mL/min)(如图2所示)，得到30mg化合物1(保留时间15.3min)，即为那西肽。

(3)那西肽的鉴定

通过结构分析，对本发明的从海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682的发酵培养物中制备的化合物1鉴定结果如下：

化合物1为浅黄色粉末，分子式C₅₁H₄₄N₁₃O₁₂S₆，ESIHRMS m/z 1222.1565([M+H]⁺)。¹H NMR谱中低场中显示五个单峰烯氢质子信号δ8.65，8.59，8.30，8.17和7.91；两个端烯质子信号δ6.36和5.75，对应的碳信号为δ103.6；一个烯氢质子信号δ6.45；δ7.61，7.28和7.13为苯环上相邻的三个质子氢信号。高场区存在三个甲基氢信号δ0.90，1.72，2.63。其NMR数据为：¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.65(Thz(1)5,s)；8.59(Thz(5)5，s)；8.30(Thz(3)5，s)；8.17(Thz(2)5，s)；7.91(Thz(4)5，s)；7.83(Pyr 4，s)；7.61(Ind 7，d)；7.28(Ind 6，dd，J＝7.16,8.32)；7.13(Ind 5，d，J＝7.15)；6.45(But 3，q，J＝6.79)；6.36(Deala 3，E(s))，5.75(Deala 3，Z(s))；5.86(Cys 2，m)；5.70(Glu2，dd)；5.57，5.42(Ind4')；4.58(Thz 2，m)；4.08(Glu 4，dd,J＝2.24，11.89)；4.00(Thr 3，m)；3.83(Cys 3，dd，J＝4.89，13.86)，3.51(Cys 3，dd，J＝5.49，13.95)；2.63(Ind CH₃，s)；2.44S(Glu 3，m)，1.90R(Glu 3，m)；1.72(But CH₃，d，J＝6.74)；0.90(Thr CH₃，d，J＝6.43)；¹³C NMR(125MHz，DMSO-d6)δ181.8，172.6，170，169，167.7，167.1，166.3，165，163.9，159，159.6，159.5，158.2，153.1，150.8，149.8，149.6，148.7，147.6，142.5，137.6，135，134.3，130.4，129.9，129.3，129.2，128.9，127.1，126.8，126，125.3，124.9，124.7，124.5，123.2，120，118.4，114.4，103.6，66.5，66.4，65.9，56.6，49.1，45.2，37.6，29.5，18.3，13.5，12.2。查阅文献，化合物1的NMR数据与文献[Mocek U,Chen L C,Keller P J,et al.¹H and ¹³C NMR assignments of the thlopeptide antibiotic nosiheptide[J].J Antibiot,1986,42(11):1643-1648.]报道的那西肽NMR数据一致，故鉴定化合物1为那西肽，其结构如式(I)所示。