专利名称：微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生产工艺的制作方法
微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生产工艺
本发明涉及一种碱性蛋白酶的生产工艺，尤其是涉及一种微生物发酵法生 产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生产工艺。
背景技术：
随着化学农药产品的种类和产量的增加，其施用范围也不断扩大，农药残 留已对人类和生态环境造成严重的威胁，而生物农药由于其高效、安全、无毒、 尤残留、无环境污染的优点，己成为农业发展中最为活跃的研究领域。近十多 年来，由于各国的重视，生物农药研究和生产都有了很大的发展，目前化学农 药每年以2%的速度递减，而生物农药却以5%的速度递增。特别是我国作为农业
大国，在'2001年加入WTO后面对着国际市场上激烈的竞争，微生物资源在农业 上的开发和利用也迎来了前所未有的历史机遇和挑战，其发展将有利于解决当 前农业生态环境中的难点问题。为了保护生态环境和实现农业的可持续性发展， 开发出具有自主知识产权的微生物农药显得意义深远，且具有广阔的市场价值 和应用前景。
微生物杀虫剂具有无污染、无残留和对人体危害小等特点，但也存在作用 时间长、侵染力弱、杀虫效果迟缓等缺点。而许多细菌能够分泌碱性蛋白酶， 降解昆虫寄主的表皮蛋白质，协助菌体侵入虫体，提高杀虫剂的毒力，克服生
物杀虫剂迟效和不稳定的缺点。因此可在生物杀虫剂中添加碱性蛋白酶，开发 出高效的生物农药。同时碱性蛋白酶还在医学上作为生化药物，在食品工业中 作为嫩化剂、沉淀剂等广泛使用，甚至在日用品工业中用作美容产品添加剂。
目前，国内外大多利用动物胰脏来提取生产，成本高，产量有限，限制了 该酶的应用范围。而采用微生物发酵生产碱性蛋白酶周期短、营养需求低、提 取工艺简单，可实现自动化生产，不受原料限制而进行大规模生产，对国家的 可持续发展策略具有深远的意义。
发明内容
本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，提供一种微生物发酵法生产 枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生产工艺，其采用微生物发酵生产碱性蛋白酶，周 期短，营养需求低，提取工艺简单，降低了成本，同时提高了蛋白酶的回收率。 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为
- 一种微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生产工艺，其特征在于 包括以下步骤-
(1) 菌种培养采用种子培养基对枯草芽孢杆菌种进行扩大培养；
(2) 发酵培养基配制；
(3) 发酵将枯草芽孢杆菌菌种接入摇瓶，进行发酵得发酵液；
(4) 粗提发酵液经预处理后离心，脱色，过滤和减压干燥得粗品碱性蛋
白酶；
(5) 精制粗品经纯化溶解后，盐析，透析，超滤浓縮，凝胶过滤层析，
然后干燥浓縮得成品。 步骤(1)中发酵培养基的配方为葡萄糖1.2%+蔗糖0.6% +淀粉1.2%，
豆饼粉3. 0%，酵母粉0. 3%， K2HP04 3H200. 2% ,其余以蒸馏水补充。
步骤(3)中发酵条件为发酵时间36h，温度36。C，初始最佳PH值8.0，摇
瓶转速150 r/min。
步骤(3)中枯草芽孢杆菌的培养方法为
(1) :菌种培养基选用采用LB液体培养基 胰化蛋白胨10g/L+酵母提取物5g /L+NaCl 5g/L+蒸馏水
(2) :将配置好的LB培养基调节PH至7.8,分装三角瓶，在O. 105Mpa蒸 f二压力灭菌30min，自然冷却至45°C， 24h后无菌条件下接种枯草芽孢杆菌菌种， 38。C下170 r/min摇床培养36-38h;
(3) :无菌条件下将扩大培养的菌液接入发酵培养基。 在发酵液中加入植物油作为消泡剂，加入量为0. 3%(w/w)
发酵液的处理和产品制备过程为
(1) 发酵液的预处理
取发酵完毕的发酵液100ml，加入絮凝剂NaA102，室温搅拌8min后静置待 分层；絮凝剂NaA102的用量以质量百分数O. 1%—0. 15%为宜；
(2) 离心
将预处理后的发酵液的上清液装入离心管，在4卩条件下8000r/min离心 8min;
(3) 脱色
向离心液中加入1%的中颗粒活性炭，用水浴加热至9(TC，保温搅拌30分
钟，趁热过滤，如滤液颜色加重，可用活性炭再度脱色，直至滤液为无色或微
黄色为止；
(5) 纸板过滤过滤纸板由孔径30 50iim的棉花纤维、石棉和硅藻土组 成，纸板过滤机的压力为0.3 MPa，取滤液低温千燥可得粗蛋白酶；
(6) 盐析
将硫酸铵晶体磨成粉末，在冰浴条件下边搅拌边加入pH为7. 8的粗蛋白酶 辨液中，然后继续搅拌lh放置于4X:条件下4000r/min离心30min，收集沉淀， 溶于定量缓冲液中；
(7) 透析
将盐析获得的沉淀物溶解于装有O. 2mol/LpH7. 4硼酸缓冲液中的透析袋中， 扎好两端，置于IO倍酶液体积的蒸馏水中4'C透析过夜，其间需换水4次，最 后以饱和BaCU来检测硫酸铵是否透析完全；<formula>formula see original document page 9</formula>
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将透析所得酶液置于超滤容器中在4。C的环境中，在氮气压力0. 5个大气压 力下，用截留分子量为10万的膜超滤5h，收集截留的液体；
(9)离子交换柱层析
选用阴离子交换树脂DEAE-S印hadex A50作为填充介质，将DEAE-S印hadex A50用蒸馏水充分溶胀，采用浮选法除去过细的粒子，放置一定时间后，倒去上 清液，至上清液不含细粒为止；用0. lmol/LHCL浸泡20min，再用0. lmol/LNaOH 浸泡20min，最后用0. 1 mol/LHCL浸泡20min;用上柱缓冲夜平衡几次，抽真
空，然后采用快速装柱法装入树脂，避免产生气泡；用洗脱液平衡若干天；洗 脱液为50mmol/L， pH7. 4的Tris-HCL缓冲液，洗脱速度为2. 8ml/10min，每十分 钟收集-一管；收集蛋白酶活性峰，浓縮。
(10) S印hadexG 一 75凝胶柱层析
在低温4'C的环境下，选择SephadexG — 75作为填充介质；称取一定量的 S印hadexG — 75在沸水中充分溶胀，冷却，装柱；将DEAE-S印hadex A50收集 到的活性峰浓縮后上样；用O. lmol/LpH7.4的Tris-HCL缓冲液进行洗脱，洗脱 速度为0.5ml/min，用核酸/蛋白检测仪检测，收集含碱性蛋白酶活性组分，然
后冷冻干燥浓缩于4r保存。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下
1、 制备简单。工艺简单，设备要求一般，操作过程可人为控制，便于管理 和质量控制。
2、 产量高。对菌种发酵条件进行优化设计，发酵液活性物质的产最达最高。
3、 回收率高。将传统提取工艺与现代工艺相结合，采用絮凝、盐析，凝胶 层析等技术，大大提高回收率。
4、 具有迅速的资源再生性。整个工艺过程简单，生产周期短，并可对工艺 条件进行改造，原材料可重复利用。
5、 生产成本低，生产安全、排污少，且天然产物容易降解、无积累、选择 性高，不会对环境构成危害。
6、 针对不同领域的需求生产相应的产品，最大程度减轻能耗。 四
图1为发酵产物的提取和纯化流程图； 图2为发酵生产流程框图。
五具体实施例方式
弹性蛋白酶(Elastase)是一种以水解不溶性弹性硬蛋白(elastin)为特征 的蛋白水解酶，它可由动物胰脏提取或由微生物发酵制得。本发明的生产工艺 为用枯草芽孢杆菌BQ-An作为生产菌株，经摇瓶发酵得发酵液，发酵液通过 预处理、离心、脱色、过滤、盐析、透析、超滤、凝胶过滤层析后真空冷冻干 燥得纯的碱性蛋白酶成品。具体工艺过程
1、 菌种培养
将菌种BQ-An活化并扩大培养；
2、 配制发酵培养基
以最佳营养条件配制菌株发酵培养基；
3、 发酵
将在LB液体培养基中扩大培养后菌液于无菌条件下，接入装有发酵培养基 的摇瓶进行发酵；
4、 提取
发酵液通过预处理、离心、脱色、过滤、盐析、透析、超滤、凝胶过滤层 析后，真空冷冻干燥得碱性蛋白酶成品。
实施例 ,(1)菌种培养
①种子培养基
LB液体培养基蛋白胨IO g，酵母浸膏5 g， NaCl 10 g，水l L， pH7. 0， 121 。C高压灭菌30 min。
②扩大培养
用接种环挑取保存在斜面上的BQ-An菌株菌泥一环，接种于装有100 mL种 子培养基的250 mL三角培养瓶中。在38。C恒温摇床160 r/min条件下培养36-38h。
(2) 发酵培养基配制
a:发酵培养基最佳配方(w/w)为葡萄糖1.2% +蔗糖0.6%+淀粉1.2%， 豆饼粉3%，酵母粉O. 3%， K2HP04'3H20 0.2% ;其余以蒸馏水补充。b:将按上 述配方配制好的发酵培养基调节PH至7. 8，分装三角瓶，在0. 105Mpa蒸汽压力 灭菌30min，自然冷却至45°C， 24h后无菌条件下接种枯草芽孢杆菌菌种，38 。C下170 r/min摇床培养36-38h。
(3) 发酵最佳发酵条件为最佳发酵时间36h，最佳温度36'C，初始最 佳PH值8.0，摇瓶转速150 r/min。(参见图2)
无菌条件下将发酵好的种子培养液以10% (体积比)的量加入到装有100 mL 发酵培养基的250 mL三角培养瓶中。在36 。C恒温摇床150 r/min条件下培养 36h。发酵过程中可在发酵液中加入植物油(花生油)作为消泡剂，加入量为 0. 30/0-0. 6%。
(4) 提取(参见图1)
(1)发酵液的预处理
取发酵完毕的发酵液lOOml，加入0. P/。(w/w)的絮凝剂NaA102，室温搅拌 8min后静置待分层。
(2) 离心
将预处理后的发酵液的上清液装入离心管，在4。C条件下8000r/min离心 8min;
(3) 脱色
向洗脱液中按重量百分比加入1%的活性炭，用水浴加热至9(TC，保温搅拌 30分钟，趁热过滤
(5) 纸板过滤过滤纸板由孔径30 50ym的棉花纤维、石棉和硅藻土组 成，纸板过滤机的压力为0. 3 MPa，。
(6) 盐析
将硫酸铵晶体磨成粉末，在冰浴条件下边搅拌边加入定量的溶粗蛋白酶溶 液液(调pH为7. 8)中，然后继续搅拌lh放置于4t:条件下4000r/min离心30min， 收集沉淀，溶于定量缓冲液中。
(7) 透析
将盐析获得的沉淀物溶解于装有O. 2mol/LpH7. 4硼酸缓冲液中的透析袋中， 扎好两端，置于IO倍酶液体积的蒸馏水中4i:透析过夜，其间需换水4次，最 后以饱和BaCL2来检测硫酸铵是否透析完全；
(8) 超滤
将透析所得酶液置于超滤容器中在4t:的环境中，在氮气压力0. 5个大气压
力下，用截留分子量为10万的膜超滤5h，收集截留的液体。
(9) 离子交换柱层析
选用阴离子交换树脂DEAE-S印hadex A50作为填充介质，将DEAE-S印hadex A50用蒸馏水充分溶胀，采用浮选法除去过细的粒子，放置一定时间后，倒去上 清液，至上清液不含细粒为止。用0. lmol/LHCL浸泡20min，再用0. lmol/LNaOH 浸泡20min，最后用0. 1 mol/LHCL浸泡20min。用上柱缓冲夜平衡几次，抽真 空，然后采用快速装柱法装入树脂，避免产生气泡。收集蛋白酶活性峰，浓縮。
(10) S印hadexG — 75凝胶柱层析
在低温4'C的环境下，选择S印hadexG — 75作为填充介质。称取一定量的 S印hadexG — 75在沸水中充分溶胀，冷却，装柱。将DEAE-S印hadex A50收集 到的活性峰浓縮后上样。用0. lmol/LpH7. 4的Tris-HCL缓冲液进行洗脱，收集 碱性蛋白酶活性组分。然后冷冻干燥浓縮于4X:保存。
枯草芽孢杆菌的培养方法
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按照多点取样(不同地点、不同土层深度)混合的方法，铲去表层土，采用
简易打孔器，打取深度为3 — 15cm的土样，装入无菌牛皮纸袋或铝盒中，做好 记录。采集的土样应没有大的颗粒，带回实验室阴干后立即进行分离培养。其 中取样的土壤为任何普通的土壤，任何普通的土壤中均含有枯草芽孢杆菌，即 取样不受客观条件的限制，具有重复性。
2、分离与纯化
将采来的土样阴干、研磨后，称取5g，放入150ml盛有45ml生理盐水的三
角瓶中，摇动3-5min，在8CTC水浴中加热10 min，杀灭不产芽孢的细菌和其他 菌类。采用土壤稀释分离法，吸取l mL的稀释液加入到含有9 mL水的试管中， 振荡混匀，制得10"土壤稀释液；按照上述方法分别制取10—3、 10, 10—5土壤稀 释液。分别取10入10—4、 10—5土壤稀释液0.05 mL涂布于肉汁胨培养基平板上。 倒置在28 'C的恒温培养箱中培养48 h。挑取单菌落，镜检，采用划线分离的 方法纯化。
3 、初筛
(1) 初筛培养基(％) (w/w):脱脂奶粉6.0;酵母膏0. l;葡萄糖O. l;MgS04.7 I12O0. 01; KH2P 040.05; K2H P 040. 1;琼脂2. 0;其余为蒸馏水，调pH为 7.0。
(2) 用接种环将分离得到的菌株接种在弹性蛋白平板培养基上，并置于37 r培养2 — 3天，然后观察直径和透明圈大小，以透明圈直径与菌落直径的比 值(HC值)作为初筛指标。将比值大的用稀释倒平板或划线法进行分离纯化，挑 取单菌落接入斜面，于37。C培养24-32小时。
4、复筛
(1) 发酵培养基(％) (w/w):酪蛋白3.0;葡萄糖4.0;玉米提取液2.0; K 2HPO40.2; MgS04 7 H2 0. 01;其余为蒸馏水。调pH为7.8。
(2) 将初筛所得菌株分别接种到基础发酵培养基中，摇床振荡发酵24小 时后，4°C、 4000rpm离心30分钟，取上清液，用标准底物、分光光度计测定各 菌株弹性蛋白酶的活力反复试验，选择一株活力最高的菌株作为发酵菌株。酶 活测定参照工业部颁国家标准方法进行。
权利要求
1.一种微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生产工艺，其特征在于包括以下步骤(1)菌种培养采用种子培养基对枯草芽孢杆菌种进行扩大培养；(2)发酵培养基配制；(3)发酵将枯草芽孢杆菌菌种接入摇瓶，进行发酵得发酵液；(4)粗提发酵液经预处理后离心，脱色，过滤和减压干燥得粗品碱性蛋白酶；(5)精制粗品经纯化溶解后，盐析，透析，超滤浓缩，凝胶过滤层析，然后干燥浓缩得成品。
2、根据权利要求1所述的微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生 产工艺，其特征在于步骤(1)中发酵培养基的配方为葡萄糖1.2%+蔗糖 0. 6%+淀粉1. 2%，豆饼粉3%，酵母粉0. 3%， K2HP04 3H20 0. 2% ，其余以蒸馏 水补充，其中百分比为w/w。
3、 根据权利要求1所述的微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生 产工艺，其特征在于步骤(3)中发酵条件为发酵时间36h，温度36'C，初始 PH值8.0，摇瓶转速150 r/min。
4、 根据权利要求1所述的微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生 产工艺，其特征在于歩骤(3)中枯草芽孢杆菌的培养方法为 (1) :菌种培养基选用采用LB液体培养基；(2) :将配置好的LB培养基调节ra至7.8，分装三角瓶，在O. 105Mpa蒸 汽压力灭菌30min，自然冷却至45°C， 24h后无菌条件下接种枯草芽孢杆菌菌种， 38r下170 r/min摇床培养36-38h;(3) :无菌条件下将扩大培养的菌液接入发酵培养基。
5、 根据权利要求1所述的微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生 产工艺，其特征在于在发酵液中加入植物油作为消泡剂，加入量为0. 3% w/w。
6、 根据权利要求1所述的微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生产工艺，其特征在于发酵液的处理和产品制备过程为(1) 发酵液的预处理取发酵完毕的发酵液100ml，加入絮凝剂NaA102，室温搅拌8min后静置待 分层；絮凝剂NaAlO,的用量以质量百分数O. 1%—0. 15%为宜；(2) 离心将预处理后的发酵液的上清液装入离心管，在4t:条件下8000r/min离心 8min;(3) 脱色向离心液中加入1%的中颗粒活性炭，用水浴加热至9(TC，保温搅拌30分 钟，趁热过滤，如滤液颜色加重，可用活性炭再度脱色，直至滤液为无色或微 黄色为止；(5)纸板过滤过滤纸板由孔径30 50"m的棉花纤维、石棉和硅藻土组 成，纸板过滤机的压力为O. 3 MPa，取滤液低温干燥可得粗蛋白酶；(6) 盐析将硫酸铵晶体磨成粉末，在冰浴条件下边搅拌边加入pH为7. 8的粗蛋白酶 溶液中，然后继续搅拌lh放置于4t条件下4000r/min离心30min，收集沉淀， 溶于定量缓冲液中；(7) 透析将盐析获得的沉淀物溶解于装有O. 2mol/LpH7. 4硼酸缓冲液中的透析袋中， 扎好两端，置于IO倍酶液体积的蒸馏水中4。C透析过夜，其间需换水4次，最 后以饱和BaCU来检测硫酸铵是否透析完全；(8) 超滤将透析所得酶液置于超滤容器中在4。C的环境中，在氮气压力0. 5个大气压 力下，用截留分子量为10万的膜超滤5h，收集截留的液体；(9) 离子交换柱层析选用阴离子交换树脂DEAE-S印hadex A50作为填充介质，将DEAE-S印hadex A50用蒸馏水充分溶胀，采用浮选法除去过细的粒子，放置-一定时间后，倒去上 清液，至上清液不含细粒为止；用O. lmol/LHCL浸泡20min，再用0. lmol麵OH 浸泡20min，最后用0. 1 mol/LHCL浸泡20min;用上柱缓冲夜平衡几次，抽真 &，然后采用快速装柱法装入树脂，避免产生气泡；用洗脱液平衡若干天；洗 脱液为50mmol/L， pH7. 4的Tris-HCL缓冲液，洗脱速度为2. 8ml/10min，每十分 钟收集一管；收集蛋白酶活性峰，浓縮。(10) S印hadexG — 75凝胶柱层析 在低温4。C的环境下，选择S印hadexG — 75作为填充介质；称取一定量的 S印hadexG — 75在沸水中充分溶胀，冷却，装柱；将DEAE-S印hadex A50收集 到的活性峰浓縮后上样；用0. lmol/LpH7. 4的Tris-HCL缓冲液进行洗脱，洗脱 速度为0. 5ml/min，用核酸/蛋白检测仪检测，收集含碱性蛋白酶活性组分，然
全文摘要
本发明涉及一种微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生产工艺，其采用微生物发酵生产碱性蛋白酶，周期短，营养需求低，提取工艺简单，降低了成本，同时提高了蛋白酶的回收率。本发明包括以下步骤(1)菌种培养采用种子培养基对枯草芽孢杆菌种进行扩大培养；(2)发酵培养基配制；(3)发酵将枯草芽孢杆菌菌种接入摇瓶，进行发酵得发酵液；(4)粗提发酵液经预处理后离心，脱色，过滤和减压干燥得粗品碱性蛋白酶；(5)精制粗品经纯化溶解后，盐析，透析，超滤浓缩，凝胶过滤层析，然后干燥浓缩得成品。
文档编号C12N9/56GK101368177SQ20081023171
公开日2009年2月18日 申请日期2008年10月13日 优先权日2008年10月13日
发明者刘双发, 安德荣 申请人:西北农林科技大学