本发明涉及冻干领域，特别是蛋白酶k的冻干工艺。
背景技术：
蛋白酶k是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，用于生物样品中蛋白质的一般降解。从林伯氏白色念球菌（tritirachiumalbumlimber）中纯化得到。据资料显示：该酶有两个ca2+结合位点，它们离酶的活性中心有一定距离，与催化机理并无直接关系。然而，如果从该酶中除去ca2+，由于出现远程的结构变化，催化活性将丧失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染酸制品的蛋白质。
蛋白酶k作为一种蛋白酶可以起到消化和降解其他蛋白的作用，但同时其本身也是一种蛋白质。和大部分的蛋白质一样，其活性和稳定性也受到温度、ph值、保存时间等因素的影响，因此，通常蛋白酶k冻干的干粉在0～4℃保存，或溶液状态下于-20℃保存。而现有的蛋白酶k冻干工艺仍有不足，需要花费的时间太长，影响其蛋白酶k冻干产品的生产。为了解决蛋白酶k的运输和应用不便，缩短冻干的时间，加强蛋白酶k干粉的稳定性、延长其保存期等问题，非常有必要需要一种新的冻干工艺流程。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供一种蛋白酶k的冻干工艺。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种蛋白酶k的冻干工艺，包括以下步骤：
a.预处理待冻干蛋白酶k；
b.再将蛋白酶k溶液样品放入冷冻干燥机内，温度调节至第一温度-50℃以下并保持温度在-50℃以下，对蛋白酶k进行冷冻，再升温至温度-15±5℃，保持1-2h，再降温至-50℃以下，保持1-2h对蛋白酶k进行预冻；
c.当真空度低于20pa后，将预冻之后的蛋白酶k溶液样品升温至第二温度，所述第二温度处于-40±5℃，使样品在-40±5℃且真空条件下保持1~2小时；
d.冷凝器的温度降低至-40℃，蛋白酶k样品溶液的温度由第二温度升至第三温度，所述第三温度处于-15±5℃，使样品在-15±5℃且真空条件下保持1~2小时；
e.当真空度低于5pa后，样品溶液的温度由第三温度降至第二温度，并在真空条件下保持2~3h，温度再由第二温度升温至第三温度，使样品在真空条件下保持2~3h；
f.再将蛋白酶k样品溶液的温度由第三温度升至第四温度，所述第四温度处于0±5℃，使样品在0℃且真空条件下保持2~3小时；
g.再将蛋白酶k样品溶液的温度由第四温度升至第五温度，所述第五温度处于35±5℃，维持冷冻干燥室温度在35±5℃左右，真空条件下，并保持2~3小时。
优选的，所述的预处理蛋白酶k样品溶液的质量分数为4~5%。
优选的，所述的预冻时间为1~2h。
优选的，所述的预冻真空度为50~80pa。
优选的，所述的由第三温度升温至第四温度，每小时的回温速率在5~6℃。
优选的，所述的由第四温度升温至第五温度，每小时的回温速率在5~7.5℃。
优选的，所述的由第三温度升温至第四温度的时间为2~5h。
优选的，所述的由第四温度升温至第五温度的时间为4~6.5h。
根据本发明所得的蛋白酶k冻干产品，其外观形状为成型的是白色圆饼状，无冒泡，无萎缩现象发生，能有效保障产品的质量以及保存。
本发明的有益效果：
本发明的蛋白酶k的冻干工艺，利用蛋白酶k的理化性质，通过预冻之后，进行快速一次干燥，和解析干燥再降压进行一次干燥和解析干燥之后的特殊工艺，结合冷凝器的低温，加速固态水的升华，将其冻干时间缩短至20-26个小时，比常规的冻干工艺时间（一般约40h）缩短了将近一半，大大提高了冻干的效率，而且让蛋白酶k的储存受温度的影响降低，可以在室温下进行储存，使其在生产以及运输过程的条件更为宽泛，在室温条件下存储长达数年之后，冻干蛋白酶k的稳定性仍然很好，复溶之后的蛋白酶k的活性高，并且冻干样品的复溶速度只需2秒。
具体实施方式
实施例1蛋白酶k的冻干工艺操作方法：
a.预处理：将50g蛋白酶k溶解在1l的纯化水中，按照1ml/瓶分装在5ml西林瓶中，作为待冻干样品；
b.开启冷冻干燥机，调节冷冻干燥室内温度至第一温度-50℃以下，将经过预处理的蛋白酶k放入冷冻干燥机内快速冷冻；调节冷冻干燥室内温度至-10℃，保持冷冻干燥室温度-10℃，在60pa的压强下产品保持2小时，再降温至-50℃以下，保持2小时对蛋白酶k进行预冻；
c.调节冷冻干燥室内温度至第二温度-40℃，并在10pa的压强下，使样品在-40℃条件下保持2小时；
d.冷凝器的温度降低至-40℃，调节冷冻干燥室内温度至第三温度-15℃，并在10pa的压强下，使样品在-15℃条件并保持2小时；
e.当真空度低于5pa后，调节冷冻干燥室内温度至第二温度-40℃，使样品在-40℃且真空条件下，保持2小时。再将冷冻干燥室内温度至第三温度-15℃，并在5pa的压强下，使样品在-15℃条件并保持2小时；
f.调节冷冻干燥室温度逐渐升温至第四温度0℃，每小时回温不超过5℃，并在5pa的压强下，使样品在0℃条件下保持2小时；
g.调节冷冻干燥室温度至第五温度30℃，每小时回温不超过7.5℃，维持冷冻干燥室温度在30℃左右，在5pa的压强下，使样品在30℃条件下保持2小时；
h.关闭冷冻干燥机，调节冷冻干燥室内环境至常压、常温后，取出蛋白酶k冻干品。
实施例2：允许范围内，改变冻干温度、时间等参数下的蛋白酶k的冻干工艺操作方法：
a.预处理：将50g蛋白酶k溶解在1l的纯化水中，按照1ml/瓶分装在5ml西林瓶中，作为待冻干样品；
b.开启冷冻干燥机，再将蛋白酶k溶液样品放入冷冻干燥机内，温度调节至第一温度-50℃以下并保持温度在-50℃以下，对蛋白酶k进行冷冻，再升温至温度-15℃，保持1小时，再降温至-50℃以下，保持1小时对蛋白酶k进行预冻；
c.调节冷冻干燥室内温度至第二温度-45℃，并在20pa的压强下，使样品在-45℃条件下保持1小时；
d.冷凝器的温度降低至-40℃，调节冷冻干燥室内温度至第三温度-10℃，并在20pa的压强下，使样品在-15℃条件并保持1小时；
e.当真空度低于5pa后，调节冷冻干燥室内温度至第二温度-45℃，使样品在-45℃且真空条件下，保持3小时。再将冷冻干燥室内温度至第三温度-10℃，并在5pa的压强下，使样品在-10℃条件并保持3小时；
f.调节冷冻干燥室温度逐渐升温至第四温度5℃，每小时回温不超过6℃，并在5pa的压强下，使样品在5℃条件下保持3小时；
g.调节冷冻干燥室温度至第五温度40℃，每小时回温不超过5℃，维持冷冻干燥室温度在40℃左右，在5pa的压强下，使样品在40℃条件下保持3小时；
h.关闭冷冻干燥机，调节冷冻干燥室内环境至常压、常温后，取出蛋白酶k冻干品。
实施例1以及实施例2，所制得的冻干蛋白酶k，外观形状皆为成型的白色圆饼状，无冒泡，无萎缩现象发生，能有效保障产品的质量以及保存。
实施例3：本发明的冻干工艺冻干的蛋白酶k在核酸提取操作中的应用。
1.病毒样品核酸提取
实验分为两组，两组都是采用本发明的冻干工艺所获得的冻干蛋白酶k，一组是在37℃条件下放置2年的蛋白酶k冻干品，另一组是新制备的蛋白酶k冻干品。两组冻干品用于病毒样品的核酸提取实验过程中，以进一步测试新的蛋白酶k的冻干工艺。测试实验使用广州和实生物技术有限公司生产的核酸提取或纯化试剂盒。实验操作步骤如下：
1.在1.5ml的无菌离心管内加入50µl的蛋白酶k，20µl的磁珠，取200µl样本加入离心管中，并计算蛋白酶k所需的复溶时间；
2.再加入300µl的磁珠结合液，盖紧管盖，漩涡振荡15秒以充分混匀。56℃温育10分钟，期间不时振荡混匀（同时可将洗脱液置于56℃预热）；
3.将离心管放入磁力架上，吸磁1分钟，然后用移液器将所有上清小心吸弃；
4.将500µl的磁珠洗涤液1加入离心管，移液器反复吹打10次以重悬磁珠；
5.将离心管放入磁力架上，吸磁1分钟，然后用移液器将所有上清小心吸弃；
6.将500µl的磁珠洗涤液2加入离心管，移液器反复吹打10次以重悬磁珠；
7.将离心管放入磁力架上，吸磁1分钟，然后用移液器将所有上清小心吸弃；
8.将500µl的磁珠洗涤液2加入离心管，移液器反复吹打10次以重悬磁珠；
9.将离心管放入磁力架上，吸磁1分钟，然后用移液器将所有上清小心吸弃，不剩余残余液体；
10.将离心管移离磁力架，打开管盖，室温静置10分钟；
11.往离心管内加入56℃预热的洗脱液60µl，移液器反复吹打10次，充分悬浮磁珠；
12.盖紧管盖，56℃静置2分钟后，将离心管放入磁力架上，吸磁1分钟。将上清吸至一个新的离心管中。离心管内即为核酸溶液。
2.紫外分光光度计检测所抽提的dna浓度与纯度
用紫外分光光度计检测dna在260nm和280nm下的吸光值。计算od260与od280的比值，获得的基因组dna的od260/od280。新制备的蛋白酶k冻干的od260/od280在1.96，放置两年的蛋白酶k冻干的od260/od280在1.93。
该结果表明，使用本发明的方法所冻干的蛋白酶k复溶所需的时间不超过两秒，在室温下放置2年后仍然可以用于核酸提取等实验，蛋白酶k的活性与效果不受影响。
当然，本发明创造并不局限于上述实施方式，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可做出等同变形或替换，这些等同的变形或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。