本发明涉及一种干酪乳杆菌来源的d-乳酸脱氢酶及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术：
手性α-羟基酸是合成许多药物、化学材料的重要前体物质。例如，苯乳酸(phenyllacticacid,pla)又名2-羟基-3苯基丙酸，存在两种对映异构体，d-pla和l-pla。d/l-pla均具有广谱且高效的抑菌活性，是一种新型天然生物防腐剂，可作为饲料添加剂替代畜禽饲料的抗菌剂。
d-乳酸脱氢酶(d-lactatedehydrogenase，d-ldh，ec1.1.1.28)，是脱氢酶中十分重要且研究较多的一种酶，也是生物体内糖酵解途径中一种关键的氧化还原酶。已有研究发现多种d-ldh可不对称还原苯丙酮酸(phenylpyruvicacid,ppa)生成d-pla，如来源于pediococcusacidilactici和pediococcuspentosaceus的paldh和ppldh，lactobacillusplantarumwcfs1中的d-ldh及lactobacillusbulgaricusatcc11842中的d-nldh等。但是不同的d-ldh不对称还原ppa的能力存在明显差异，胡发根等利用来源于lactobacillusplantarum的重组ldh将55mmppa在1h内转化生成了30.5mmd-pla，摩尔转化率为54.5％，光学纯度达到100％。而来源于lactobacillusbulgaricus的d-nldh突变体偶联甲酸脱氢酶后可将50mmppa在90min内完全转化，其d-pla产率为99.0％，eep>99.9％。因此，为获得高纯度，高产量的d-pla，利用分子生物学手段不断挖掘出性状优良的d-ldh，具有重要的工业化应用价值。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一种来源于干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)的d-乳酸脱氢酶，命名为lcldhd，其氨基酸序列如(a)或(b)所示：
(a)氨基酸序列如seqidno.2所示；
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有苯丙酮酸还原活性的由(a)衍生的蛋白质。
本发明的第二个目的是提供编码所述d-乳酸脱氢酶的基因lcldhd。
在本发明的一种实施方式中，所述基因序列如seqidno.1所示。
本发明的第三个目的是提供一种基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，表达seqidno.1所示基因。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pet-28a(+)为载体。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主为e.colibl21、e.colijm109、e.colidh5α、或e.colitop10。
本发明的第四个目的是提供构建所述基因工程菌的方法，是将seqidno.1所示基因与载体连接，转化至大肠杆菌细胞中。
在本发明的一种实施方式中，所述载体为pet-28a(+)。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主为e.colibl21(de3)。
本发明的第五个目的是提供生产所述乳酸脱氢酶的方法，是将所述基因工程菌接种至lb培养基中，培养至od600＝0.6～0.8，加入终浓度为0.4～0.5mmol/l的iptg诱导6～10h。
在本发明的一种实施方式中，所述诱导是在24～28℃进行诱导。
本发明的第六个目的是提供所述d-乳酸脱氢酶的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是以苯丙酮酸为底物，加入所述d-乳酸脱氢酶，转化生产d-苯乳酸。
在本发明的一种实施实施方式中，所述应用是向每1mmol苯丙酮酸中加入2～8mg含的该d-乳酸脱氢酶的重组菌的湿菌体，于30～37℃，200～220rpm条件下反应20～60min。
有益效果：本发明构建的重组菌株e.colibl21(de3)pet-28a(+)-lcldhd可将10mmol/l苯丙酮酸在40min内完全不对称还原生成9.91mmol/lpla，产率为99.1％，对映体过量值(eep)为98.3％，相比于现有技术，在反应时间缩短一倍以上的同时，转化率提高，取得了预料不到的技术效果。
附图说明
图1为e.coli全细胞的sds-page分析；m:proteinmarker；1:e.coli/pet28a；2:e.coli/lcldhd。
具体实施方式
lcldhd的酶活性测定：总反应体系为3ml，包括100mmol/l磷酸钠缓冲液(ph7.0)，0.2mmol/lnadh，8mmol/l苯丙酮酸，对照组中不含nadh，其他成分相同。混匀后于30℃保温5min，加入适量的酶液。检测nadh在340nm处吸收值的变化。酶活力单位(u)定义为：在上述条件下，每分钟催化氧化1μmolnadh所需要的酶量。同时，采用bradford方法测定蛋白含量。
底物和产物的检测：反应结束后，取一定量的转化液加入甲醇终止反应，进行反相hplc分析：色谱柱为prontosilc18(150mm×4.6mm×0.25μm)，流动相成分：0.05％三氟乙酸/水(a)和0.05％三氟乙酸/甲醇(b)混合液。梯度洗脱程序为：0～15min20％～65％b；15～16min65％～100％b；16～19min保持100％b；紫外光检测器，柱温：30℃；流速1ml/min。检测波长为210nm，苯丙酮酸的保留时间11.372min，pla的保留时间为12.858min。
另取一部分转化液于1ml乙酸乙酯中进行萃取，上层有机相经无水硫酸镁干燥后过0.22μm有机滤膜采用正相hplc进行手性分析，色谱柱为daicelod-h(250mm×4.6mm)，分析条件为：流动相为正己烷/异丙醇/三氟乙酸(98:2:0.05，v/v)，流速为1ml/min，检测波长为210nm，柱温：30℃，d-pla和l-pla的保留时间分别为33.889min，35.797min。根据实验数据计算对映体纯度：eep＝[d-pla-l-pla/(d-pla+l-pla)]×100％。
实施例1lcldhd基因的克隆与表达质粒的构建
根据l.caseibl23的d-ldh(caq65269)对应的核苷酸序列设计如下引物：
lcldhd-f：5’-gaattcatgaagattattgcttacgg-3’，含ecori酶切位点。
lcldhd-r：5’-ctcgagctttgctggaccagtaactt-3’，含xhoi酶切位点。
提取l.casei的总dna，以l.casei的总dna为模板，以lcldhd-f和lcldhd-r为引物进行pcr扩增，pcr条件为：94℃4min；94℃30s，52℃30s，72℃1min10s，30个循环；72℃10min。将pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pucm-t载体连接(pucm-t-lcldhd)，转化入e.colijm109中，经菌液pcr鉴定正确后送上海生工测序，得到lcldhd核苷酸序列。
将测序结果正确的pucm-t-lcldhd与pet-28a(+)质粒均用ecori和xhoi进行双酶切，割胶回收的酶切产物在t4dna连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pet-28a(+)-lcldhd，并对重组质粒进行序列测定。
实施例2重组菌的构建与诱导表达
将pet-28a(+)-lcldhd转化入e.colibl21(de3)中，经含有kan的抗性平板筛选后，挑取阳性转化子于2ml含kan的抗性lb液体培养基中，37℃220rpm摇床振荡培养14～16h。按1～2％的接种量转接于30ml相同培养基中，37℃220rpm摇床振荡培养至对数生长中期(od600＝0.6～0.8)，加入终浓度为0.4mmol/l的iptg，16℃220rpm诱导培养10h。对照组分别用仅含空pet-28a(+)在相同条件下培养(e.colipet28a)。诱导结束后，离心收集菌体并用磷酸盐缓冲液(ph＝7.0)洗涤两次后制备含100mg/ml湿细胞的菌悬液，用于sds-page分析，分析结果见图1，构建成功的重组菌e.colibl21(de3)pet-28a(+)-lcldhd在37.8kda处有明显的蛋白条带，对照e.colipet28a没有大小相同的蛋白条带。
实施例3重组菌全细胞催化苯丙酮酸生成d-pla
于1ml离心管中加入300μl菌悬液(30mg湿菌体)和250μl磷酸钠缓冲液(ph7.0)，37℃保温5min，再依次加入50μl葡萄糖(终浓度50mmol/l)和400μl苯丙酮酸(终浓度10mmol/l)，反应40min后，取200μl反应液加入800μl甲醇终止反应，过0.22μm有机滤膜，进行hplc分析；利用液相色谱测定lcldhd重组菌转化10mmol/l苯丙酮酸生成pla的产量及对映选择性分析，结果显示pla的浓度为9.31～9.92mmol/l。
另取200μl反应液，用1ml乙酸乙酯进行萃取，上层有机相经无水硫酸钠干燥后过0.22μm有机滤膜，进行对映选择性分析。结果显示，当体系反应20min后d-pla的产率为76.9％，eep为98％。在反应40min后，苯丙酮酸完全被还原生成d-pla，产率为99.1％，eep为98.3％。对照例1
具体实施方式同实施例2，区别在于，用仅含空pet-28a(+)和无iptg诱导的工程菌在相同条件下诱导表达，测得两种工程菌催化苯丙酮酸获得d-pla的浓度仅为0.81mmol/l和0.78mmol/l。
对照例2
合成编码genbank登录号为：kde85061.1的d-乳酸脱氢酶基因序列，将该基因命名为aoldh，按照实施例1的策略克隆该基因和构建表达质粒pet28a(+)-aoldh。
aoldh-f:5′–catatgatgaagctagcagtcttcag–3′下划线部分为ndeⅰ酶切位点
aoldh-r:5′–ctcgagtaaccggacaggctcctt–3′下划线部分为xhoⅰ酶切位点。
根据实施例2的策略，将aoldh在e.colibl21(de3)中进行异源表达，得到重组菌e.coliaoldh。将重组菌按照实施例2的步骤进行诱导表达得到aoldh，按照实施例3将e.coliaoldh菌悬液与10mmol/l苯丙酮酸混匀，于37℃、220r/min共同反应12h后进行液相检测，结果显示该重组菌产生的pla浓度与表达空质粒的对照组相同，表明aoldh对苯丙酮酸无催化活性。
对照例3
按实施例2的方式对重组菌进行诱导，区别在于调整诱导温度为12℃，在其余的条件相同的情况下，d-苯乳酸浓度仅4.02～4.75mm。
对照例4
按实施例2的方式对重组菌进行诱导，区别在于调整诱导温度为20℃，8h，在其余的条件相同的情况下，d-苯乳酸浓度仅5.02～5.75mm。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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