一种多汁乳菇多糖的干酪乳杆菌发酵乳及其制备方法与流程

本发明属于乳酸菌和乳品加工的技术领域，具体涉及一种可提高人体免疫力的多糖发酵乳及其制备方法。

背景技术：

研究已经证实，真菌多糖作具有调节免疫、降血脂、抗衰老和抗肿瘤等多种生理功能，深受人们的重视，极具开发价值。发酵乳因具有极佳的口感和营养成分，被认为是添加功能性成分、实现产品功能的最佳载体之一。乳酸菌在人体内有极其重要的生理功能，其数量的多少，影响着人体健康乃至人的寿命。而乳酸菌在人体中所发挥重要生理功能则主要通过其所产生的有机酸、细菌素、细菌表面成分和特殊酶系这4类物质来实现的。乳酸菌的生理功能主要包括：(1)赋予食品良好的风味，提高食品营养价值；(2)促进胃液的分泌，促进胃肠的蠕动，防治消化不良和习惯性便秘；(3)能够抵御外来细菌的入侵，抑制病原性细菌的生长繁殖，维持肠道菌群的平衡；(4)增强机体免疫力，抑制肿瘤的生长和转移；(5)降低血清中胆固醇的含量，预防心血管疾病的发生。发酵乳因含有活的益生菌或乳酸菌和活性成分，在改善人体健康有重要作用，近年来受到极大关注。据文献报道，真菌多糖能应用于发酵乳，例如将金针菇多糖、黑木耳多糖、姬松茸多糖、香菇多糖和云芝多糖应用于发酵乳中，结果表明，真菌多糖具有促进乳酸菌的生长、提高发酵产生乳酸的速度、减少发酵周期，还可以增加乳酸菌的活菌数量。

多汁乳菇(lactariusvolemusfr.)，俗名红奶浆菌、牛奶菇、奶汁菇，是可食用的野生真菌，但对其中的活性多糖的提取、活性成分的评价及其多糖在发酵乳中的应用，未曾有报道。

技术实现要素：

本发明针对多汁乳菇多糖免疫活性不明及其在发酵乳中应用的现状，提供一种可提高免疫力的多汁乳菇多糖干酪乳杆菌发酵乳及其制备方法。

本发明采用了如下技术方案：

通过对上述发酵乳添加剂、质构不稳定等问题进行了深入研究，结果发现在发酵乳的制备工序中添加多汁乳菇多糖，使其作为益生元因子在发酵过程中发生作用，与不添加多汁乳菇多糖时相比，可在不影响发酵乳固有风味的前提下显著增强发酵乳中的活菌总数及质构的稳定性。因此，本发明在优化配方的基础上同时改进工艺：添加多汁乳菇多糖进行发酵，促进发酵剂的生长繁殖，延长保存发酵乳的保存期，制备风味独特、质地细腻、口感顺滑的发酵乳产品，减少了乳清析出。

一种多汁乳菇多糖的干酪乳杆菌发酵乳的制备方法，将发酵用奶液与多汁乳菇多糖和干酪乳杆菌发酵剂，混合均匀后发酵，发酵后制成含多汁乳菇多糖的发酵乳；所述发酵用奶液还经均质和消毒预处理，或者发酵用奶液与多汁乳菇多糖混合后再经均质和消毒预处理。

所述多汁乳菇多糖的制备方法为：先将多汁乳菇原料进行预处理得到多汁乳菇细粉，经脱脂后，再用水进行多糖提取；之后经脱蛋白质处理；用95％乙醇沉淀多糖，所得浓缩液用75％乙醇洗涤多糖并真空冷冻干燥，制得多汁乳菇多糖。

所述多汁乳菇多糖的制备包含如下步骤：

(1)原材料预处理：洗涤多汁乳菇，将其烘干去柄，用子实体部分磨粉，然后过150目～200目筛网，得到多汁乳菇细粉；

(2)脱脂：向多汁乳菇细粉中加入无水乙醇及石油醚，在85℃～95℃回流3h～4h，抽滤得到滤渣；

(3)用水进行多糖提取：向滤渣中加入蒸馏水，浸泡1h～2h后，100w超声波处理10min～20min，于90℃～95℃的水浴条件下浸提3h～5h；用150目～200目滤袋过滤，收集浸提液用旋转蒸发仪进行浓缩，得到15倍～25倍浓缩的多汁乳菇多糖浓缩液；

(4)脱蛋白质处理：将多汁乳菇多糖浓缩液与1/3～1/5倍体积的sevag试剂混合，静置20min～40min后分层，再低温离心得上层浸提液，用蒸馏水稀释再用旋转蒸发仪去除有机溶剂，得到脱蛋白的多汁乳菇多糖浓缩液i；

(5)用95％乙醇沉淀多糖：在多汁乳菇多糖浓缩液i中，加入2倍～4倍体积预冷95％乙醇，于1℃～4℃下放置10h～20h，再进行低温离心得到絮状沉淀，为多汁乳菇多糖浓缩液ii；

(6)用75％乙醇洗涤多糖：用75％乙醇将多汁乳菇多糖浓缩液ii进行3次洗涤后，重新溶解于水用低温离心去除不溶物，上清液预冻后进行真空冷冻干燥，得到多汁乳菇多糖粉。

所述多汁乳菇多糖的含量为0.05％～0.15％，优选0.05％～0.10％。

所述发酵温度为35℃～43℃。

加入的多汁乳菇多糖先配制成溶液，并经过膜处理。

所述发酵用奶液组成为：

全脂乳粉的复原奶与蔗糖、稳定剂按比例配制而成；

或脱脂奶粉和稀奶油的复原奶与蔗糖、稳定剂按比例配制而成；

或鲜奶与蔗糖、稳定剂按比例配制而成。

制备干酪乳杆菌发酵剂包含如下步骤：

(1)采用mrs液体培养基进行干酪乳杆菌冻干菌粉活化培养2～3次，得活化菌液；

(2)将活化菌液接种于活化用奶液中活化处理，得到干酪乳杆菌发酵剂。

所述活化用奶液为10.0％～12.5％的全脂乳粉、7.5％～8.5％蔗糖混合后，经均质和消毒而成。

本发明与现有的技术相比，具有如下的优点：

(1)本发明采用的多汁乳菇多糖，为纯天然物质，具有良好的免疫活性，在发酵乳中性质稳定，能耐受巴氏消毒强度，不会影响发酵乳的保质期和口感。

(2)相比于未添加多糖的发酵乳，本发明的多糖发酵乳具有很好的流变学特性、持水力、酸甜适中、含有较丰富的必需氨基酸和游离氨基酸等，乳酸菌活菌数高达10¹⁰cfu/ml；香气成分较浓郁，口感较好，色泽、口感等感官性质均符合发酵乳国家标准gb19302-2010中的各项指标。

(3)本发明的发酵乳的原料丰富，可以是全脂乳粉的复原奶与蔗糖、稳定剂等发酵乳原料按比例配制而成，也可以是脱脂奶粉和稀奶油的复原奶与蔗糖、稳定剂等发酵乳原料按比例配制而成，还可以是鲜奶与蔗糖、稳定剂等发酵乳原料按比例配制而成。

(4)生产工艺简单和容易控制，口感细腻，香气浓郁，乳酸菌的活菌数高，质构较好，粘稠度适宜，持水力较好，无乳清析出。

附图说明

图1中a、b、c、d分别为正常组(ck)、cp损伤组(cp^-)、cp损伤阳性组(cp⁺)和多糖中剂量组(mp)小鼠在注射墨汁后的肝脏病理切片图。

图2是多汁乳菇多糖干酪乳杆菌发酵乳剪切扫描流变学特性曲线，图2a为表观粘度随剪切速率的变化，图2b为剪切应力岁剪切速率的变化。

图3是多汁乳菇多糖干酪乳杆菌发酵乳频率扫描流变学特性曲线，其中g′为弹性模量，g〞为粘性模量。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于此。

实施例1

多汁乳菇多糖的提取

洗涤多汁乳菇，将其烘干去柄，用子实体部分磨粉，然后过200目筛网，得到多汁乳菇细粉，在90℃回流3.5h进行脱脂后，按料液比1:30浸泡1.5h后，用100w超声波处理15min，于95℃水浴浸提4h，用200目滤袋过滤，收集浸提液，于55℃旋转蒸发仪中浓缩至20倍，再加入1/5倍体积的sevag试剂(正丁醇:氯仿的体积比为1:4)脱蛋白质，在低温下用5000r/min离心5min后得到上层浸提液，用适量的蒸馏水稀释，再用旋转蒸发仪去除有机试剂，于多汁乳菇多糖浓缩液i中加入3倍体积的95％乙醇，于4℃放置20h后用5000r/min离心5min得多汁乳菇多糖浓缩液ii，再用75％乙醇洗涤多汁乳菇多糖浓缩液ii数3次，重新溶解于水后在低温下用5000r/min离心5min去除不溶物，再将上清液其预冻后进行真空冷冻干燥，得多汁乳菇多糖粉iii，置于密封袋中4℃保存，多糖得率为2.18％(以干重计)。

实施例2

在体内多汁乳菇多糖提高免疫力作用评价

(1)小鼠分组：7～8周龄spf级近交系balb/c小鼠72只，体重18～22g，根据小鼠的体重随机分为6组，详细分组信息如表1。并经过spss17.0软件进行显著性差异分析，显示组别之间无显著性差异。所有小鼠由专业人员饲养，4只/笼。在温度22～24℃、湿度50％～60％的条件下，每天光照12h，黑暗12h。实验期间，小鼠自由饮水和进食，每天上午9:00对各实验组小鼠进行灌胃，灌胃量均为200ml/(kg·bw·d)，cp^-和cp⁺组是提前7天在小鼠的腹腔注射免疫系统损伤药物环磷酰胺(简称cp)，每天注射30mg/(kg·bw)的cp，连续注射7天，第25天再注射80mg/(kg·bw)的cp。

表1小鼠分组信息表

(2)各种免疫指标测定

①迟发型变态反应测定：在饲喂25个日龄后，每只小鼠腹腔注射0.2ml的2％的srbc绵羊红细胞，免疫5天后，小鼠称重并测量左后足跖部厚度(h0)，于测量部位注射20μl的20％的srbc绵羊红细胞，24h后测定同一部位的左后足跖部厚度(h)，注射前后足跖部厚度之差表示为dth＝h-h0，单位为mm。

②碳廓清指数测定：第30日测量结束，尾部静脉注射33％的印度墨汁，注射量为0.1ml/(kg·bw)，分别于注射完2min、10min后，从内眦静脉取血20μl，并立即加于盛有2ml0.1％na2co3的ep管中，测定od600nm并计算相应的吞噬速率k＝(lgod1-lgod2)/(t2-t1)和吞噬指数a＝(体重×k^1/3)/(肝重+脾重)，碳廓清指数即是吞噬指数a。

③脏器系数测定：在实验终止时，将全部小鼠禁食一夜，摘除眼珠取小鼠全血，然后颈部脱臼处死小鼠，分离肝脏、脾脏、胸腺，用生理盐水洗涤脏器表面血污并用滤纸吸干称重，脏器系数包括肝脏系数、脾脏系数和胸腺系数，计算公式为：脏器系数＝脏器质量(mg)/体重(g)。对于碳廓清受试小鼠的脏器而言，6个组别的颜色均呈暗红色，未代谢完印度墨汁，肉眼可观察到cp^-比剂量组的色泽状态更暗沉，代谢情况要差于lp、mp和hp等3个多糖剂量组和ck组，可判定多汁乳菇多糖液具备一定的免疫功效性。经计算，得到各组小鼠脏器系数结果如表2所示。lp、mp和hp等3个多糖剂量组与ck比较，小鼠的体重和肝脏系数、脾脏系数和胸腺系数等3项免疫器官系数有明显升高，具有统计学意义(p＜0.05)，而cp^-与ck比较，小鼠的体重和3项免疫器官系数有明显下降，这验证了小鼠免疫损伤模型已经建立，cp⁺与cp^-比较，小鼠的免疫力略有恢复，说明多汁乳菇粗多糖有免疫提高作用。

表2第4周(d28)各组小鼠的体重(g)及免疫脏器系数(m±sd，n＝12)

注:脏器系数＝脏器重量/体重，单位为mg/g。不同符号(a～d)表示同一列数据之间具有显著性差异(p<0.05)；显著性差异采用spss17.0中的dunan’s分析法。

如表3所示，第4周时，对小鼠进行足跖部过敏肿胀(dth)和碳廓清试验，lp、mp和hp等3个多糖剂量组与ck比较，小鼠的足跖部过敏肿胀症状更为明显，同时，其巨噬细胞清除碳粒的能力(吞噬指数a)也更强，且具有统计学意义(p＜0.05)，而cp^-与ck比较，小鼠的足跖肿胀程度及巨噬细胞功能远不如ck组，这验证了小鼠免疫损伤模型的建立；cp^-与cp⁺比较，小鼠的免疫力略有恢复，说明多汁乳菇粗多糖有免疫提高作用。

表3第4周(d28)各组小鼠dth及碳廓清指数检测结果(m±sd，n＝12)

注:足跖部过敏肿胀程度用dth表示，单位为mm；碳廓清指数指吞噬指数a。注：不同字母(a～f)表示同一列数据之间具有显著性差异(p<0.05)；显著性差异采用spss17.0中的dunan’s分析法。

④全血分析：将小鼠全血立即送检中山大学东校区实验动物中心进行十八项全血自动分析，重点分析其中的淋巴细胞及白细胞数量，小鼠全血中淋巴细胞数量及白细胞数量如表4所示，lp、mp和hp等3个多糖剂量组的淋巴细胞占比明显高于其他组，与正常组水平相当，且lp的白细胞数量和淋巴细胞数量均显著高于其他组(p＜0.05)。而cp^-与正常组比较，小鼠的白细胞数量和淋巴细胞数量都有所下降，这也验证了小鼠免疫损伤模型的建立；另外，cp⁺与cp^-相比较，小鼠的免疫指标略有恢复，介于cp^-和ck之间，表明多汁乳菇多糖显示出免疫提高作用。cp⁺的白细胞数量和淋巴细胞数量也都显著高于cp^-，这表明当小鼠受到抗原的袭击时，多糖可以明显增强小鼠细胞免疫功能且低剂量的促进效果最显著。

表4第4周(d28)各组小鼠全血检测结果(m±sd，n＝12)

注:不同字母(a～e)表示同一列数据之间具有显著性差异(p<0.05)；显著性差异采用spss17.0中的dunan’s分析法。wbc表示白细胞数量，单位为10⁹个/l；lym表示淋巴细胞数量，单位为10⁹个/l；lym％表示淋巴细胞占全血细胞的百分比。

⑤脏器病理切片分析：将经过聚甲醛初步固定处理的小鼠脏器立即送检中山大学东校区实验动物中心进行苏木精-伊红染色，显微镜下观察注射墨汁的各组小鼠的肝脏正常组织形态及病变组织结构形态，病理切片结果如附图1所示，其中图1a为正常组(ck)的肝窦周边可见5～10％的吞噬色素并参与免疫调节的枯否细胞，10～20％的由炎症引起的可表征肝细胞损伤程度的肝细胞核空泡化；cp损伤组(cp^-)的肝窦周边可见10～20％吞噬色素的枯否细胞及10～20％的肝细胞核空泡化(图1b)；cp⁺的肝窦周边可见10～20％的吞噬色素的枯否细胞，10～20％的肝细胞核空泡化及5～10％的肝细胞浆空泡化(图1c)；中剂量多糖组(mp)的肝窦周边可见20～30％的吞噬色素的枯否细胞，10～20％的肝细胞核空泡化，1～5％的肝细胞浆空泡化(图1d)。mp的枯否细胞数目明显高于其他组，肝细胞浆空泡化程度最低，且cp⁺的肝细胞空泡化程度也低于cp^-，说明多汁乳菇多糖有利于肝巨噬细胞的激活，参与碳粒异物的清除反应且对肝细胞损伤具有一定的修复作用。

对肝脏切片中的未清除碳粒采用imageplus-pro软件进行面积积分处理，得如表5所示结果，显然，cp^-未清除碳粒比例0.60％稍大于cp⁺的0.50％，mp则小于cp⁺和ck。进一步说明了多糖可以增强小鼠的肝巨噬细胞功能。

表5各组小鼠肝脏碳粒分布积分结果

注：不同字母(a～d)表示同一列数据之间具有显著性差异(p<0.05)；显著性差异采用spss17.0中的dunan’s分析法

实施例3

多汁乳菇多糖在发酵乳中的应用

第一步发酵剂制备：用1ml无菌水重悬干酪乳杆菌(编号cicc6013，lactobacilluscaseisubsp.rhamnosus6013，中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，地址：北京市朝阳区霄云路32号，邮编：100027，电话：010-64666552，传真：010-64616613，电子邮箱:sales@china-cicc.org，由吴焕章分离)冻干粉，然后全部转接至mrs液体培养基中，于37℃下培养16h，再以5％～10％接种量转接至新鲜的mrs液体培养基中活化3次，于4000r/min低温离心收集菌体，并将其全部转接至活化用奶液在37℃下活化培养2～3次，即得干酪乳杆菌发酵剂；所述活化用奶液为12.5％的全脂乳粉、8.5％蔗糖混合后，经消毒而成。

第二步发酵用奶液制备及与多糖混合：将12.5％的全脂乳粉、8.5％的蔗糖、0.1％的稳定剂粉，按质量体积比加入0.00％、0.05％、0.10％、0.15％的多汁乳菇多糖粉混合均匀后，预热至60℃在18mpa下均质，并于95℃消毒5min后降温至43℃，备用；

第三步接种和发酵：按体积比10％的干酪乳杆菌发酵剂加入发酵用奶液中，于43℃进行发酵，当滴定酸度达到75°t后终止发酵，得到多汁乳菇多糖发酵乳。

第四步多汁乳菇多糖发酵乳各项指标评价

(1)感官质量评价按照发酵乳国家标准gb19302-2010的要求进行，具体评定项目如表6所示，总分为100分，其中风味指标和口感指标各占30分，外观指标满分为15分，质地指标满分为25分。每项指标按照可接受程度分三个评分段：不太接受、一般接受、喜欢接受，分值分布如表6。评分结果如表7，从风味、口感、外观和质地看，多糖含量0.10％的发酵乳比较好，0.15％的发酵乳颜色有点深，完全偏离了发酵乳原有的颜色。多糖含量0.05％的发酵乳也可以接受。

表6发酵乳感官评价指标

表7多汁乳菇多糖添加量对发酵乳感官的影响

注：不同字母(a～c)表示同一列数据之间具有显著性差异(p<0.05)；显著性差异采用spss17.0中的dunan’s分析法。

(2)多汁乳菇多糖发酵乳理化指标评价测定发酵结束后发酵乳的ph、持水力、游离氨基酸、乳酸菌活菌数、流变学性质

ph不同多糖含量对发酵乳的ph的影响如表8，可看出，随着多糖浓度的增加，发酵乳的ph先下降后有所回升，这表明添加一定量的多糖可以促进干酪乳杆菌的产酸能力，但超过一定范围，可能对乳酸菌的生长有一定的抑制作用，从而导致发酵乳的ph有所回升。

持水力称量15ml的ep管的质量记为w0，分别再称量每种酸奶样品10g于ep管中，5000r/min离心5min，弃乳清后倒置ep管10min后，称量总质量记为w。平行测3次取平均值，持水力＝(w-w0)/10×100％。不同多糖含量对发酵乳持水力的影响如表8，从中可以看出，添加多糖不会影响发酵乳的持水力，均约在99.0％左右。

表8多糖含量对干酪乳杆菌发酵乳的ph、持水力、活菌数的影响

乳酸菌活菌数取出上述制备的发酵乳样品1ml与9ml灭菌的生理盐水混合，即此时稀释倍数为10¹，再依次取前一个稀释样品1ml与9ml灭菌的生理盐水混合，即得到稀释倍数为10²的样品，依此类推，稀释至10¹⁰倍，取稀释后的发酵乳1ml于平皿中，然后倾入mrs固体培养基覆盖于菌液表面，置于37℃恒温培养24h后进行菌落计数。多糖含量对发酵乳的干酪乳杆菌的影响如表8，随多糖含量增加，乳酸菌的活菌数在增加，再次证实多汁乳菇多糖可以促进干酪乳杆菌的生长繁殖，多糖含量为0.10％时，活菌数最大为2.01×10¹⁰cfu/ml，4种配方的发酵乳都满足发酵乳国家标准gb19302-2010的要求。

游离氨基酸称取10g的酸奶与5ml的蒸馏水混合，充分搅拌后，于4500r/min冷冻离心5min，取上清4ml与1ml的15％的磺基水杨酸溶液混合，于4℃放置6h以上，然后于10000r/min离心15min，取上清，重复离心一次，通过凯氏定氮法确定样品含氮量后，再将样品稀释至含氮量在0.6～1.0％之间。用0.22μm过滤膜过滤后装进样品瓶中，使用c18的柱子，四元泵，紫外检测，opa自动衍生装置，自动进样分析。多糖含量对干酪乳杆菌发酵乳中游离氨基酸的影响如表9，当多糖含量为0.05％时，必需氨基酸的净含量比对照组(不加多糖)增加了1809.46nmol/l，每一种必需氨基酸的含量均有大幅度的增加；与对照组相比，总游离氨基酸含量也在增加，3781.93nmol/l，远远超过了对照组总游离氨基酸的含量。但多糖添加量为0.10％和0.15％的发酵乳与对照组相比，总的游离氨基酸含量有所降低，可能与多糖的抗菌活性有关，当多糖浓度超出一定范围时，将不再促进干酪乳杆菌的生长繁殖。再次表明，一定浓度的多汁乳菇多糖才能促进干酪乳杆菌的生长繁殖，从而更多地产生了必需氨基酸和游离氨基酸，提高了发酵乳生物效价。

表9多糖对干酪乳杆菌发酵乳中17种游离氨基酸的影响(m±sd)(nmol/l)

流变学性质取发酵乳5ml于哈克流变仪的载物台，选择适宜的程序对样品的抗形变能力及黏度等参数进行测定，每做完一组程序，打开探头，小心处理掉探头及载物台上的样品，更换试样，保存所有的测定数据，应用origin8.5对其进行分析处理。多糖含量对干酪乳杆菌发酵乳的流变学性质影响如图2和图3。可知，随着剪切速率的增大，表观粘度(图2a)和剪切应力均呈现减小的趋势，且各组发酵乳的表观粘度区别不大。当剪切速率控制在20s^-1以上三时，添加多糖可提高发酵乳的剪切应力(图2b)，当多糖含量为0.15％时，其表观粘度和剪切应力均最高且变化较为缓慢，多糖可增加乳酸菌的活力，改善发酵乳的质构。图3为干酪乳杆菌发酵乳经频率扫描后的测定结果，g′、g″分别表示弹性模量和粘性模量，可分别表征发酵乳抗形变能力和黏度。从图3可以看出，多糖添加量为0.10％干酪乳杆菌发酵乳抗形变能力最好，黏度最大，交联情况最佳，这可能与多糖促进乳酸菌产生大量的胞外多糖所致，从而改善了发酵乳的交联结构。综合上述，在干酪乳杆菌发酵乳中，多糖乳菇多糖的添加量推荐为0.05％～0.10％。

实施例4

多汁乳菇多糖提取和在发酵乳中的应用

第一步洗涤多汁乳菇，将其烘干去柄，用子实体部分磨粉，然后过150目筛网，得到多汁乳菇细粉，在85℃回流4h进行脱脂后，按料液比1:30浸泡2h后，用100w超声波处理10min，于90℃水浴浸提5h，用150目滤袋过滤，收集浸提液，于55℃旋转蒸发仪中浓缩至15倍，再加入1/3倍体积的sevag试剂(正丁醇:氯仿的体积比为1:4)脱蛋白质，在低温下用5000r/min离心5min后得到上层浸提液，用适量的蒸馏水稀释，再用旋转蒸发仪去除有机试剂，于多汁乳菇多糖浓缩液i中加入2倍体积的95％乙醇，于4℃放置18h后用5000r/min离心5min得多汁乳菇多糖浓缩液ii，再用75％乙醇洗涤多汁乳菇多糖浓缩液ii数2～3次，重新溶解于水后在低温下用5000r/min离心5min去除不溶物，再将上清液其预冻后进行真空冷冻干燥，得多汁乳菇多糖粉iii，置于密封袋中4℃保存，多糖得率为2.01％(以干重计)。

第二步发酵剂制备及与多糖混合：用1ml无菌水重悬干酪乳杆菌冻干粉，然后全部转接至mrs液体培养基中，于37℃下培养16h～20h，再以5％～10％接种量转接至新鲜的mrs液体培养基中活化3次，于4000r/min低温离心收集菌体，并将其全部转接至发酵用奶液在35℃下活化培养2～3次，即得干酪乳杆菌发酵剂；所述活化用奶液为12.5％的全脂乳粉、8.5％蔗糖混合后，经消毒而成。

第三步发酵用奶液制备：将鲜奶、8.5％的蔗糖、0.1％的稳定剂粉，按质量体积比加入0.05％多汁乳菇多糖粉iii混合均匀后，预热至60℃在18mpa下均质，并于95℃消毒5min后降温至35℃，备用；

第四步接种和发酵：按体积比5％的干酪乳杆菌发酵剂加入发酵用奶液中，于35℃进行发酵，当滴定酸度达到75°后终止发酵，得到多汁乳菇多糖发酵乳，发酵终点的ph、持水力和活菌数分别为4.33、99.60％和1.06×10¹⁰cfu/ml，口感质量符合要求。若将经过上述步骤得到的凝固型发酵乳，经过蠕动泵破乳，即为搅拌型发酵乳。

实施例5

多汁乳菇多糖提取和在发酵乳中的应用

第一步洗涤多汁乳菇，将其烘干去柄，用子实体部分磨粉，然后过150目筛网，得到多汁乳菇细粉，在95℃回流3h进行脱脂后，按料液比1:30浸泡1h后，用100w超声波处理20min，于93℃水浴浸提3.5h，用200目滤袋过滤，收集浸提液，于55℃旋转蒸发仪中浓缩至25倍，再加入1/4倍体积的sevag试剂(正丁醇:氯仿的体积比为1:4)脱蛋白质，在低温下用5000r/min离心5min后得到上层浸提液，用适量的蒸馏水稀释，再用旋转蒸发仪去除有机试剂，于多汁乳菇多糖浓缩液i中加入4倍体积的95％乙醇，于3℃放置15h后用5000r/min离心5min得多汁乳菇多糖浓缩液ii，再用75％乙醇洗涤多汁乳菇多糖浓缩液ii数2～3次，重新溶解于水后在低温下用5000r/min离心5min去除不溶物，再将上清液其预冻后进行真空冷冻干燥，得多汁乳菇多糖粉iii，置于密封袋中4℃保存，多糖得率为2.15％(以干重计)。

第二步发酵剂制备：用1ml无菌水重悬干酪乳杆菌冻干粉，然后全部转接至mrs液体培养基中，于37℃下培养16h～20h，再以5％～10％接种量转接至新鲜的mrs液体培养基中活化3次，于4000r/min低温离心收集菌体，并将其全部转接至发酵用奶液在35℃下活化培养2～3次，即得干酪乳杆菌发酵剂；所述活化用奶液为10.0％的全脂乳粉、7.5％蔗糖混合后，经消毒而成。

第三步发酵用奶液制备及与多糖混合：将鲜奶、8.5％蔗糖、0.1％稳定剂粉，按质量体积比加入0.05％多汁乳菇多糖粉iii混合均匀后，预热至60℃在18mpa下均质，并于95℃消毒5min后降温至37℃，备用；

第四步接种和发酵：按体积比5％的干酪乳杆菌发酵剂加入发酵用奶液中，于37℃进行发酵，当滴定酸度达到75°后终止发酵，得到多汁乳菇多糖发酵乳，发酵终点的ph、持水力和活菌数分别为4.35、99.50％和1.25×10¹⁰cfu/ml，口感质量符合要求。若将经过上述步骤得到的凝固型发酵乳，经过蠕动泵破乳，即为搅拌型发酵乳。

实施例6

多汁乳菇多糖提取和在发酵乳中的应用

第一步洗涤多汁乳菇，将其烘干去柄，用子实体部分磨粉，然后过180目筛网，得到多汁乳菇细粉，在90℃回流3.5h进行脱脂后，按料液比1:30浸泡2h后，用100w超声波处理18min，于95℃水浴浸提3h，用200目滤袋过滤，收集浸提液，于55℃旋转蒸发仪中浓缩至20倍，再加入1/3倍体积的sevag试剂(正丁醇:氯仿的体积比为1:4)脱蛋白质，在低温下用5000r/min离心5min后得到上层浸提液，用适量的蒸馏水稀释，再用旋转蒸发仪去除有机试剂，于多汁乳菇多糖浓缩液i中加入3.5倍体积的95％乙醇，于4℃放置15h后用5000r/min离心5min得多汁乳菇多糖浓缩液ii，再用75％乙醇洗涤多汁乳菇多糖浓缩液ii数2～3次，重新溶解于水后在低温下用5000r/min离心5min去除不溶物，再将上清液其预冻后进行真空冷冻干燥，得多汁乳菇多糖粉iii，置于密封袋中4℃保存，多糖得率为2.05％(以干重计)。

第二步发酵剂制备：用1ml无菌水重悬干酪乳杆菌冻干粉，然后全部转接至mrs液体培养基中，于37℃下培养16h～20h，再以5％～10％接种量转接至新鲜的mrs液体培养基中活化3次，于4000r/min低温离心收集菌体，并将其全部转接至发酵用奶液在41℃下活化培养2～3次，即得干酪乳杆菌发酵剂；所述活化用奶液为11.0％的全脂乳粉、8.0％蔗糖混合后，经消毒而成。

第三步发酵用奶液制备及与多糖混合：将8.5％脱脂奶粉、3.0％稀奶油、7.5％的蔗糖、0.1％的稳定剂粉，按质量体积比加入0.10％多汁乳菇多糖粉iii混合均匀后，预热至60℃在18mpa下均质，并于95℃消毒5min后降温至41℃，备用；

第四步接种和发酵：按体积比5％的干酪乳杆菌发酵剂加入发酵用奶液中，于41℃进行发酵，当滴定酸度达到75°后终止发酵，得到多汁乳菇多糖发酵乳，发酵终点的ph、持水力和活菌数分别为4.30、99.40％和3.20×10¹⁰cfu/ml，口感质量符合要求。若将经过上述步骤得到的凝固型发酵乳，经过蠕动泵破乳，即为搅拌型发酵乳。