本发明涉及一种酶的制备方法及应用，尤其涉及一种细菌中细胞色素p450酶的制备方法及应用，属于生物技术领域。
背景技术：
磺胺类抗生素具有疗效良好、使用方便、性质稳定、价格低廉等优点，在水产养殖的疾病控制中起着不可替代的作用。但是，同样由于其广泛使用，造成磺胺类抗生素对海水养殖生态环境造成严重破坏。
磺胺类抗生素的有效去除成为亟待解决的难题。目前，国内外关于利用生物降解抗生素的研究报道较少。张树清等发现高温堆肥对鸡粪中四环素类抗生素具有降解效果，且外源添加有益降解菌剂(芽孢杆菌)有助于抗生素药物残留的去除。teruya等从海水鱼养殖场的淤泥筛选出能降解氨苄西林、强力霉素、氧四环素(土霉素)、甲砜氯霉素的菌株，经外形、分类学和16srdna分析鉴定，这些菌株为flavobacterium-cytophaga-bacteroidesgroup和proteobacterialsubdivisions。但少有关于利用生物降解磺胺类抗生素的研究报道。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提出了一种纯度高、活性好的细菌中细胞色素p450酶的制备方法。
本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种细菌中细胞色素p450酶的制备方法，所述制备方法主要包括以下步骤：
a.冷冻-破碎处理：将菌液恒温离心获得菌体，菌体在-15℃～-20℃的温度下冷冻4-5h，然后在冰水浴下破碎处理，得到提取液；
b.浓缩透析：将上述提取液浓缩，经透析12-24h得到细胞色素p450酶粗品；
c.纯化：将细胞色素p450酶粗品经纯化后制得细胞色素p450酶成品。
在上述的一种细菌中细胞色素p450酶的制备方法中，步骤a中所述菌液的制备方法为：将细菌接种于细菌培养液中，在温度为20-30℃、盐度为20-35‰、ph值为7.0-8.5的环境下培养7-16天，得到菌液。
在上述的一种细菌中细胞色素p450酶的制备方法中，所述细菌为芽孢杆菌b-1。芽孢杆菌b-1可以降解磺胺嘧啶，细胞色素p450酶是其分泌的一种酶，可以氧化磺胺嘧啶的活性基团。
在上述的一种细菌中细胞色素p450酶的制备方法中，所述细菌培养液的组成成分为：磺胺嘧啶：1-5mg/l，乙酸钠：1-3g/l，硝酸钠：0.1-0.2g/l，氯化铵：0.1-0.2g/l，磷酸氢二钾：0.05-0.1g/l，酵母浸粉：0.05-0.1g/l，溶剂为海水。不同的细菌的培养方式，细菌中细胞色素p450酶具有不同的活性。在本发明的细菌培养液中进行培养的细菌，其细胞色素p450酶活性能够进一步得到提升。
在上述的一种细菌中细胞色素p450酶的制备方法中，所述细菌在细菌培养液中的接种量为2-5wt％。
在上述的一种细菌中细胞色素p450酶的制备方法中，步骤a中所述菌液恒温离心的温度为3-8℃。
在上述的一种细菌中细胞色素p450酶的制备方法中，步骤a中所述的破碎处理采用超声波破碎仪，所述超声波破碎仪的功率为1000-1200w，温度为10-20℃，频率为20-25khz(10s/10s)，时间为15-25min。
在上述的一种细菌中细胞色素p450酶的制备方法中，步骤c中所述的纯化进行至少一次及以上。优选两次，分别为：
用缓冲液对deae纤维素柱平衡后，将细胞色素p450酶粗品上样，用缓冲液洗脱，经浓缩后，用缓冲液透析12-24h，再次浓缩。
用缓冲液对monoq柱平衡后，将前一次纯化后的细胞色素p450酶粗品上样，用缓冲液洗脱，用缓冲液透析12-24h，浓缩、干燥后制得成品。
在上述的一种细菌中细胞色素p450酶的制备方法中，缓冲液洗脱的流速为3.5-4.5ml/min。缓冲液优选为磷酸缓冲液。
在上述的一种细菌中细胞色素p450酶的制备方法中，透析后的浓缩使用超滤膜浓缩，超滤膜的分子截留量为10000。
本发明另一个目的在于提供上述细菌中细胞色素p450酶的制备方法制成的细胞色素p450酶的应用，所述细胞色素p450酶用于降解磺胺类抗生素。
在上述的细胞色素p450酶的应用中，所述磺胺类抗生素与细胞色素p450酶的质量比为(100-300)：1。
本发明细胞色素p450酶是芽孢杆菌b-1分泌的一种酶，芽孢杆菌b-1可以降解磺胺嘧啶，所以细胞色素p450酶可以氧化磺胺嘧啶的活性基团，而磺胺嘧啶为磺胺类抗生素的一种。因此，本发明细胞色素p450酶降解磺胺类抗生素的原理为：细胞色素p450酶是石油烃降解的起端酶，在常温、海水介质的弱碱性环境中，将质量比为(100-300)：1的磺胺类抗生素与细胞色素p450酶混合，细胞色素p450酶会发生α氧化或β氧化，将磺胺嘧啶中的活性胺基部分水解氧化，而磺胺嘧啶的活性基团为活性胺基，当活性胺基部分被氧化，磺胺嘧啶就失去抗生素的作用，从而达到生物降解的作用。
与现有技术相比，本发明细菌中细胞色素p450酶的制备方法提取率高，且制备的细胞色素p450酶纯度高、活性好，对磺胺嘧啶具有高效的降解效果，对5mg/l的磺胺嘧啶作用24h，降解率可达21-30％，对1mg/l磺胺嘧啶作用24h，降解率可达45-70％。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1：
菌液的培养：将芽孢杆菌b-1以3wt％的接种量接种于细菌培养液中，在温度为20℃、盐度为30‰、ph值为8的环境下培养16天，得到菌液。其中，细菌培养液的组成成分为：磺胺嘧啶1mg/l，乙酸钠2g/l，硝酸钠0.1g/l，氯化铵0.1g/l，磷酸氢二钾0.05g/l，酵母浸粉0.05g/l，溶剂为海水。
冷冻-破碎处理：用冷冻离心机4℃恒温离心，离心转速为15000r/min，离心5min，去上清液，用无菌的人工海水洗涤获得的菌体再离心2次，去除培养基。离心管在-18℃的温度下冷冻4.5h，接着取出控制在冰水浴下用超声波破碎仪20khz(10s/10s)破碎15min(功率为1000w、温度为15℃)，接着重新在-18℃的温度下冷冻、破碎，反复3次，得到提取液。
浓缩透析：提取液经0.22μm滤膜过滤去除破碎后的菌体残余细胞壁，再经聚乙二醇peg20000浓缩，并用10mmol/l的磷酸钾缓冲液透析18h，得到细胞色素p450酶粗品。
纯化：用10mmol/l，ph7.2的磷酸缓冲液对deae纤维素柱平衡后，将细胞色素p450酶粗品上样，用20mmol/l，ph7.2的磷酸缓冲液以4.5ml/min的流速洗脱；经聚乙二醇peg20000浓缩后，用5mmol/l的磷酸缓冲液透析24h，用分子截留量为10000的超滤膜再次浓缩。用5mmol/l，ph7.2的磷酸缓冲液对monoq柱平衡后，将首次纯化后的细胞色素p450酶粗品上样，用20mmol/l，ph7.2的磷酸缓冲液以4.5ml/min的流速洗脱；用5mmol/l，ph7.2的磷酸缓冲液透析18h，用分子截留量为10000的超滤膜浓缩，干燥后制得成品。
实施例2：
菌液的培养：将芽孢杆菌b-1以4wt％的接种量接种于细菌培养液中，在温度为25℃、盐度为20‰、ph值为7.5的环境下培养10天，得到菌液。其中，细菌培养液的组成成分为：磺胺嘧啶1mg/l，乙酸钠2g/l，硝酸钠0.1g/l，氯化铵0.1g/l，磷酸氢二钾0.05g/l，酵母浸粉0.05g/l，溶剂为海水。
冷冻-破碎处理：用冷冻离心机4℃恒温离心，离心转速为15000r/min，离心5min，去上清液，用无菌的人工海水洗涤获得的菌体再离心3次，去除培养基，离心管在-15℃的温度下冷冻5h，接着取出控制在冰水浴下用超声波破碎仪25khz(10s/10s)破碎15min(功率为1200w、温度为20℃)，接着重新在-18℃的温度下冷冻、破碎，反复2次，得到提取液。
浓缩透析：提取液经0.22μm滤膜过滤去除破碎后的菌体残余细胞壁，再经聚乙二醇peg20000浓缩，并用10mmol/l的磷酸钾缓冲液透析24h，得到细胞色素p450酶粗品。
纯化：用10mmol/l，ph7.2的磷酸缓冲液对deae纤维素柱平衡后，将细胞色素p450酶粗品上样，用20mmol/l，ph7.2的磷酸缓冲液以4.5ml/min的流速洗脱；经聚乙二醇peg20000浓缩后，用5mmol/l的磷酸缓冲液透析24h，用分子截留量为10000的超滤膜再次浓缩。用5mmol/l，ph7.2的磷酸缓冲液对monoq柱平衡后，将首次纯化后的细胞色素p450酶粗品上样，用20mmol/l，ph7.2的磷酸缓冲液以4ml/min的流速洗脱；用5mmol/l，ph7.2的磷酸缓冲液透析18h，用分子截留量为10000的超滤膜浓缩，干燥后制得成品。
实施例3：
菌液的培养：将芽孢杆菌b-1以5wt％的接种量接种于细菌培养液中，在温度为30℃、盐度为35‰、ph值为7的环境下培养8天，得到菌液。其中，细菌培养液的组成成分为：磺胺嘧啶1mg/l，乙酸钠2g/l，硝酸钠0.1g/l，氯化铵0.1g/l，磷酸氢二钾0.05g/l，酵母浸粉0.05g/l，溶剂为海水。
冷冻-破碎处理：用冷冻离心机4℃恒温离心，离心转速为15000r/min，离心5min，去上清液，用无菌的人工海水洗涤获得的菌体再离心3次，去除培养基，离心管在-20℃的温度下冷冻4h，接着取出控制在冰水浴下用超声波破碎仪22khz(10s/10s)破碎18min(功率为1000w、温度为10℃)，接着重新在-18℃的温度下冷冻、破碎，反复3次，得到提取液。
浓缩透析：提取液经0.22μm滤膜过滤去除破碎后的菌体残余细胞壁，再经聚乙二醇peg20000浓缩，并用10mmol/l的磷酸钾缓冲液透析24h，得到细胞色素p450酶粗品。
纯化：用10mmol/l，ph7.2的磷酸缓冲液对deae纤维素柱平衡后，将细胞色素p450酶粗品上样，用20mmol/l，ph7.2的磷酸缓冲液以4.5ml/min的流速洗脱；经聚乙二醇peg20000浓缩后，用5mmol/l的磷酸缓冲液透析24h，用分子截留量为10000的超滤膜再次浓缩。用5mmol/l，ph7.2的磷酸缓冲液对monoq柱平衡后，将首次纯化后的细胞色素p450酶粗品上样，用20mmol/l，ph7.2的磷酸缓冲液以4.5ml/min的流速洗脱；用5mmol/l，ph7.2的磷酸缓冲液透析24h，用分子截留量为10000的超滤膜浓缩，干燥后制得成品。
对比例1：
对比例1与实施例1的区别仅在于，对比例1的细菌培养液的组成成分为：磺胺嘧啶0.8mg/l，乙酸钠2g/l，硝酸钠0.3g/l，氯化铵0.3g/l，磷酸氢二钾0.05g/l，酵母浸粉0.05g/l，溶剂为海水。
对比例2：
对比例2与实施例1的区别仅在于，对比例2的细菌培养液的组成成分为：磺胺嘧啶6mg/l，乙酸钠2g/l，硝酸钠0.1g/l，氯化铵0.1g/l，磷酸氢二钾0.05g/l，酵母浸粉0.05g/l，溶剂为海水。
对比例3：
对比例3与实施例1的区别仅在于，对比例3的细菌培养液的组成成分为：磺胺嘧啶5.5mg/l，乙酸钠5g/l，硝酸钠0.3g/l，氯化铵0.3g/l，磷酸氢二钾0.03g/l，酵母浸粉0.15g/l，溶剂为海水。
对比例4：
对比例4与实施例1的区别仅在于，对比例4在纯化过程中，没有进行第二次纯化。
对比例5：
对比例5与实施例1的区别仅在于，对比例5在纯化过程中，没有进行第一次纯化，直接进行第二步纯化。
将本发明实施例1-3和对比例1-5制成的细胞色素p450酶进行基本性能测试，测试结果如表1所示。
表1：
应用实施例1-3：
将上述实施例1-3制成的细胞色素p450酶用于降解磺胺类抗生素，条件为：常温，海水介质的弱碱性环境中，磺胺嘧啶的浓度分别为1mg/l和5mg/l，磺胺嘧啶与细胞色素p450酶的质量比为100：1，降解时间为24h，降解率见表2。
应用实施例4-6：
将上述实施例1-3制成的细胞色素p450酶用于降解磺胺类抗生素，条件为：常温，海水介质的弱碱性环境中，磺胺嘧啶的浓度分别为1mg/l和5mg/l，磺胺嘧啶与细胞色素p450酶的质量比为200：1，降解时间为24h，降解率见表2。
应用实施例7-9：
将上述实施例1-3制成的细胞色素p450酶用于降解磺胺类抗生素，条件为：常温，海水介质的弱碱性环境中，磺胺嘧啶的浓度分别为1mg/l和5mg/l，磺胺嘧啶与细胞色素p450酶的质量比为300：1，降解时间为24h，降解率见表2。
应用对比例1-5：
将上述应用对比例1-5制成的细胞色素p450酶用于降解磺胺类抗生素，条件为：常温，海水介质的弱碱性环境中，磺胺嘧啶的浓度分别为1mg/l和5mg/l，磺胺嘧啶与细胞色素p450酶的质量比为200：1，降解时间为24h，降解率见表2。
表2：
在上述实施例及其替换方案中，细菌在细菌培养液中的接种量还可以为2wt％、2.5wt％、3.5wt％、4.5wt％以及2-5wt％中的任一值；细菌培养的温度还可以为21℃、22℃、23℃、24℃、26℃、27℃、28℃、29℃以及20-30℃中的任一值；盐度还可以为21‰、23‰、26‰、28‰、32‰、33‰以及20-35‰中的任一值；ph值还可以为7.1、7.3、7.6、7.8、8.2、8.5以及7-8.5中的任一值；培养的时间还可以为7天、8.5天、10天、12天、15天、16天以及7-16天中的任一值；细菌培养液中磺胺嘧啶的浓度还可以为2mg/l、3mg/l、4mg/l、5mg/l以及1-5mg/l中的任一值；乙酸钠的浓度还可以为1g/l、1.5g/l、2.5g/l、3g/l以及1-3g/l中的任一值，硝酸钠的浓度还可以为0.15g/l、0.2g/l以及0.1-0.2g/l中的任一值，氯化铵的浓度还可以为0.15g/l、0.2g/l以及0.1-0.2g/l中的任一值，磷酸氢二钾的浓度还可以为0.06g/l、0.07g/l、0.08g/l、0.09g/l、0.1g/l以及0.05-0.1g/l中的任一值，酵母浸粉的浓度还可以为0.06g/l、0.07g/l、0.08g/l、0.09g/l、0.1g/l以及0.05-0.1g/l中的任一值。
在上述实施例及其替换方案中，恒温离心的温度还可以为3℃、5℃、6℃、7℃、8℃以及3-8℃中的任一值；菌体的冷冻温度还可以为-16℃、-17℃、-19℃以及-15℃～-20℃中的任一值；菌体的冷冻时间还可以为4-5h中的任一值；超声波破碎仪的功率还可以为1050w、1100w、1150w以及1000-1200w中的任一值；超声波破碎仪的温度还可以为12℃、16℃、18℃以及10-20℃中的任一值；超声波破碎仪的频率还可以为21khz(10s/10s)、23khz(10s/10s)、24khz(10s/10s)以及20-25khz(10s/10s)中的任一值；超声波破碎仪的时间还可以为16min、20min、23min、25min以及15-25min中的任一值。
在上述实施例及其替换方案中，浓缩透析的时间还可以为12h、15h、20h、22h以及12-24h中的任一值。
在上述实施例及其替换方案中，纯化过程中缓冲液透析的时间还可以为12h、15h、20h、22h以及12-24h中的任一值；缓冲液洗脱的流速还可以为3.5ml/min、3.8ml/min、4.2ml/min以及3.5-4.5ml/min中的任一值。
在上述应用实施例及其替换方案中，磺胺类抗生素与细胞色素p450酶的质量比还可以为150:1、180:1、220:1、280:1以及(100-300)：1中的任一值。
鉴于本发明方案实施例众多，各实施例实验数据庞大众多，不适合于此处逐一列举说明，但是各实施例所需要验证的内容和得到的最终结论均接近。故而此处不对各个实施例的验证内容进行逐一说明，仅以实施例1-3和应用实施例1-9作为代表说明本发明申请优异之处。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。