的溶液测酶活和蛋白质分析。
[0037] 分别测定以上几个步骤样品的酶活力和蛋白质含量并进行SDS-PAGE。纯化结果见 表1，粗酶液经过几步纯化后，比活从4. 72U/ μ g提高到38. 78U/ μ g，纯化倍数为8. 22倍。 蛋白电泳结果（图1)表明，纯化后的脂肪酶在电泳上为一条带，分子量约为25kDa。
[0038] 切取电泳胶中的蛋白酶蛋白酶条带进行质朴鉴定，鉴定结果显示该蛋白序列属于 肽酶S8家族。鉴定序列见表2。
[0039] 表1脂肪酶的纯化步骤及结果
[0040]
[0041] 表2蛋白酶质谱鉴定序列
[0042]
[0043] 实施例3 :本发明脂肪酶的酶学性质（30、40、50、60、70、80°C )
[0044] (1)蛋白酶分子量的测定
[0045] 在SDS-PAGE电泳中蛋白质的迀移率与其相对分子质量的对数成正比。因此可以 通过SDS-PAGE测定目标蛋白的相对分子质量。根据SDS-PAGE中标准分子量蛋白和目标蛋 白的相对迀移率计算出目的蛋白的相对分子量为25kDa。
[0046] (2)蛋白酶的最适pH及pH稳定性
[0047] 纯化后的蛋白酶在不同的pH下进行酶活测定，结果如图4所示。NH54PC02蛋白 酶pH适用范围比较宽，pH 10. 0为其最适反应pH，在pH 7-11之间均保留90%以上的酶活 力。PH稳定性是将酶液在不同的pH缓冲液中进行10倍稀释，4°C放置过夜，然后在标准条 件下测定残余酶活。结果显示在PH 6-11的范围内其能够保持70%以上的活力。具有较好 的pH稳定性。
[0048] (3)蛋白酶最适温度及温度稳定性
[0049] 纯化后的蛋白酶在不同的温度（30、40、50、60、70、80°C )下测定酶活，结果如图4 所示。NH54PC02蛋白酶最适的反应温度为50°C，温度过高或过低对酶活力影响明显，温度 高于70°C基本丧失酶活力。
[0050] 酶的温度稳定性是将酶在不同的温度（30、40、50、60、70、80°C )中保温lh，结果见 图4。NH54PC02蛋白酶在10-40°C时稳定性较好，保温Ih能够维持85%以上的活力。在 50 °C保温Ih基本丧失所有酶活。
[0051] (4)酶的抑制剂对蛋白酶的影响
[0052] 将纯酶与蛋白酶抑制剂混合反应，结果如表3所示：半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64 对该本发明蛋白酶基本没有抑制作用，胃蛋白酶抑制剂和PMSF在终浓度为100 μ g/mL和 IOmM时具有强烈的抑制作用，但在低浓度时抑制作用不强，且PMSF的抑制作用要低于胃蛋 白酶抑制剂。当PMSF浓度达到ImM时，蛋白酶NH54PC02依然可以保持56%的酶活力，而当 存在ImM金属蛋白酶抑制剂EDTA时，该蛋白酶完全丧失活力。
[0053] (5)有机试剂和表面活性剂对蛋白酶的影响
[0054] 将纯酶与表面活性剂和有机试剂按一定比例混合反应，结果如表2所示：当添加 非离子表面活性剂曲拉通X-100,吐温-80和司班-80时，蛋白酶活力均有轻微的下降。但 离子表面活性剂SDS则对该蛋白酶有较强烈的抑制作用，当SDS终浓度达到IOmM时，蛋白 酶活力仅剩余57%。
[0055] 有机试剂对蛋白酶的活力影响显著，甲醇，乙醇和异丙醇均具有明显的抑制作用， 但是，在20% DMSO中，蛋白酶可以保持85%的酶活力。
[0056] 表3蛋白酶抑制剂、表面活性剂和有机试剂对蛋白酶影响
[0057]
[0058] (6)金属离子对蛋白酶的影响
[0059] 将本蛋白酶纯酶与不同金属离子混合反应，结果如表4所示：Fe2+，Ni 2+，Cu2+和Zn2+ 在高浓度时，对蛋白酶活性有强烈的抑制作用，酶活力只剩下40%，但Mn 2+对酶活有极大地 促进作用，当Mn2+浓度达到IOmM时，酶活力提高到原来的1. 5倍，K +，Mg2+和Ba 2+等对酶活 的影响则相对较弱，在这些金属离子中蛋白酶可以保留80%以上的酶活力。
[0060] 表4金属离子对蛋白酶影响
[0061]
[0062] 实施例4 :本发明蛋白酶用于水产蛋白的水解
[0063] 用发酵的蛋白酶酶解包括虾头，虾粉和鲳鱼蛋白在内的水产品，通过测定水解前 后氨基态氮和多肽含量来检测水解效果。实验结果如图5显示，水解后，所有水产品的氨基 态氮含量和多肽含量均增加。对虾粉水解前后的游离氨基酸含量进行测定，测定结果如下 表5所示。水解后，虾粉中出现了原本没有的游离氨基酸，且部分氨基酸含量显著增加，如 天冬氨酸增加了三倍多，谷氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸均增加近两倍。
[0064] 表5水解前后虾粉中游离氨基酸含量
[0065]
【主权项】
1. 一种藤黄微球菌，其特征在于，所述的藤黄微球菌的保藏编号为CGMCCNO. 10238。2. -种蛋白酶，其特征在于，所述的蛋白酶是从权利要求1所述的藤黄微球菌中分离 的。3. 如权利要求2所述的蛋白酶，其特征在于，所述蛋白酶的酶学性质如下： 1. SDS-PAGE电泳分子量为25kDa.， 2) 乙二胺四乙酸二钠、苯甲基磺酰氟、胃蛋白酶抑制剂能够完全抑制酶活， Fe2+，Ni2+，Cu2+、Zn2+、二甲基亚砜、甲醇、乙醇和异丙醇能够部分抑制酶活， Mn2+可以很好的促进酶活， 3) 其在pH6~11的范围内具有较强的酶活力，最适的pH为10.0 ; 4) 上述的蛋白酶，在40°C保温Ih后，酶活力保留90%。4. 如权利要求2所述的蛋白酶，其特征在于，所述蛋白酶的最适的pH为10. 0。5. 如权利要求2所述的蛋白酶，其特征在于，所述蛋白酶最适的反应温度为50°C。6. 权利要求2所述的蛋白酶在水解水产蛋白中的应用。7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的水产蛋白为虾头、虾粉或鲳鱼蛋白。
【专利摘要】本发明的目的是提供一种蛋白酶及其生产菌株，本发明首先提供一种藤黄微球菌(Micrococcus luteus)NH54PC02，该菌株保藏于2014年12月23日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，保藏编号为CGMCCNO.10238。本发明还提供一种从上述藤黄微球菌中分离的蛋白酶，该蛋白酶可以用于水产蛋白的水解。CGMCC NO.1023820141223
【IPC分类】C12P21/06, C12R1/265, C12N9/52, C12N1/20
【公开号】CN104894020
【申请号】CN201510290686
【发明人】毛相朝, 夏涛, 薛长湖
【申请人】中国海洋大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月30日