一株17β-雌二醇降解菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于环境污染生物修复领域，涉及一株17 β-雌二醇降解菌株及其应用。
【背景技术】
[0002] 环境雌激素（EEs)是指：进入生物体内，可通过干扰生物体自身激素的合成、分 泌、转运、结合、活性反应、代谢、消解或产生类似生物体自身激素的作用，对生物有机体维 护正常的动态平衡、繁殖、生长及行为有不利影响的环境化学物质。雌激素不需要大量存在 就会给生物机体造成很强的危害，譬如使得生物体的性激素分泌紊乱、精子数量减少、雄性 动物雌性化、癌症等发病率增加，造成生殖、免疫、神经等系统的多种病变。每年都有大量的 雌激素排入环境中，对土壤、地表水和地下水环境造成污染，严重威胁人类和动物的安全与 健康。虽然有研宄表明，雌激素在自然环境下由于光照、酸碱、微生物等因素能部分降解，但 降解效率非常低，其残存效应风险仍很大。因此，单纯依靠自然降解是无法达到彻底清除环 境雌激素的目的。
[0003] 17 β -雌二醇（17 β - Estradiol，Ε2)是一种由卵巢分泌的天然雌激素。人类和 动物正常的生理活动会释放17 β -雌二醇。排入环境中的17 β -雌二醇可通过模拟、干扰 或对抗机体原有内生激素的正常合成、运输和释放，使人和动物无法维持自身激素的平衡 和调节，从而引起生殖器官病变和雌性化现象。17 β -雌二醇是如今诸多环境雌激素中作 用最强的一种，作用强度是其代谢产物雌酮（El)和雌三醇（Ε3)的5 - 1000倍。例如当水 体中雌激素-雌二醇浓度仅为Ing · I/1时，就会干扰鱼类的内分泌系统，造成雄鱼的 雌性化。如今，17 β -雌二醇已普遍存在于各类环境，特别是水环境中，由于17 β -雌二醇 具有潜在的内分泌干扰作用，并且普通水处理技术难以有效地去除水中-雌二醇，因 此用微生物降解包括17β -雌二醇在内的环境雌激素逐渐引起了人们的重视，但此项技术 前提是获得高效稳定的降解菌。然而目前国内关于-雌二醇降解菌的报道相对较少， 因此，筛选出能适应中国本土环境的17 β -雌二醇高效降解菌显得尤为重要。
[0004] 微生物降解修复技术是近几十年才兴起的一种新型的环境污染修复技术。该技术 和物理化学方法相比，具有很多无可比拟的优点，如处理效果好，适合有毒有害有机污染物 大面积面源污染的降解修复，修复费用较低（仅为传统的物理化学修复花费的10%左右）， 且不产生二次污染等。在国内外，生物修复技术已经广泛应用于环境有机污染物的清除。由 于17β -雌二醇是一种不可避免产生和排放的雌激素，且性质比较稳定，不易发生自然降 解，因此，对环境中雌二醇进行微生物降解的研宄具有重要的意义。而目前，国内还鲜少有 关于17 β -雌二醇微生物降解菌株的专利研宄和应用报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对上述技术问题，提供一种17β_雌二醇降解菌。
[0006] 本发明的另一目的是提供该降解菌的应用。
[0007] 本发明的又一目的是提供该17 雌二醇降解菌生产的固定化菌剂。
[0008] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：
[0009] -株红球菌JX-2,2014年9月4日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通 微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO. 9636。
[0010] 所述的菌种保藏号为CGMCC NO. 9636的红球菌JX - 2在降解雌激素17 - β雌二 醇中的应用；优选在降解水体环境或固体废弃物中雌激素17β -雌二醇的应用。
[0011] 所述的红球菌JX - 2在制备降解雌激素17 - β雌二醇的微生物制剂中的应用。
[0012] 一种用本发明所述的红球菌JX - 2所生产的固定化17 - β雌二醇降解菌剂。
[0013] 一种用权利要求1所述的红球菌JX - 2所生产的固定化17 - β雌二醇降解菌剂， 是通过以下方法生产而成：
[0014] 1)将保藏编号为CGMCC NO. 9636的红球菌JX - 2试管种接种于发酵培养基中，振 荡培养至对数期；
[0015] 2)将上述培养好的菌种按5% (v/v，以培养基体积为基准，下同）的接种量接种入 种子罐，培养至对数期；
[0016] 3)将种子液按10 %的接种量接入生产罐培养；
[0017] 4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:1，搅拌速度为180转/ 分，培养温度为30°C，全流程培养时间为50小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以 上；其中，所述的发酵培养基，种子罐所用的培养基和生产罐所用的培养基相同，配方均为： 蛋白胨 10.0 g · L - 1，酵母 5. Og · L -S NaCl 10.0 g · L -S pH 7. 5 - 8. 0 ;
[0018] 5)发酵完成后培养液出罐，用发酵培养基调节培养液浓度至0D600nm= 1.0,将该 菌悬液与质量浓度为4%的海藻酸钠溶液按体积比I - 1. 5:1混合均匀，以质量浓度为5% 的CaCl2溶液为交联剂，将菌悬液-海藻酸钠混合液滴入CaCl 2溶液中交联5. 5 - 6. 5h (菌 悬液-海藻酸钠混合液与CaClJ^体积比1:10)，得到直径约为3 - 5mm固定化小球，即为固 定化修复菌剂。
[0019] 本发明所述的降解菌剂在降解雌激素17 β -雌二醇中的应用；优选在降解水体环 境或固体废弃物中雌激素17 β -雌二醇的应用。
[0020] 有益效果
[0021] 本发明筛选获得一株红球菌（Rhodococcus sp. ) JX - 2 (CGMCC 9636)，利用该菌株 制备的固定化菌剂在实验室摇瓶培养条件下7d内对初始浓度为30mg · L1的17 β -雌二 醇降解率可达90%以上。将固定化菌剂直接施用于17 β -雌二醇污染的水体以及畜禽粪 便中，能够在短时间内使其中的-雌二醇残留降低60%以上，解决了雌激素17β -雌 二醇对水体环境，畜禽粪便和人体健康的危害问题。
[0022] 本发明描述的环境修复菌剂可以用发酵工业通用发酵设备进行生产，具有生产成 本低，使用方便，去除效果好的优点，适合治理水体环境以及畜禽粪便中17β -雌二醇造成 的雌激素污染。本发明中的技术可直接应用于我国畜禽粪便的无害化和资源化处理过程， 具有广阔的产业前景和重要的环境、经济和社会效益。
【附图说明】
[0023] 图1菌株JX-2的菌落照片和透射电镜照片
[0024] A图为菌株JX-2的菌落照片，B图为菌株JX-2的菌透射电镜照片
[0025] 图2菌株JX-2以30mg · 17如为唯一碳源时的生长和降解曲线
[0026] 生物材料保藏信息
[0027] JX-2,分类命名为红球菌Rhodococcus sp.，保藏于中国微生物菌种保存管理委员 会普通微生物中心（CGMCC)，地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物 研宄所，保藏编号为CGMCC NO. 9636,保藏日期为2014年9月4日。
【具体实施方式】
[0028] 实施例1菌株的分离和鉴定
[0029] 取临安某污水处理厂活性污泥5g，加入到IOOmL的无机盐培养基中，添加17β -雌二醇（Ε2)至30mg · I/1作为唯一碳源，于30°C，150r · min ^1摇床培养7d，以5%的接种 量转接到相同的培养基中，连续转接三次后，梯度稀释富集液，取IO 4- IO 7稀释度的富 集液各〇. ImL涂布于添加30mg · L -?2的无机盐平板上，于30°C恒温培养3d后，挑取长出 的单菌落接种于含有30mg · 1/沱2的无机盐液体培养基中，于30°C，150r · mirT1摇床培 养7d，验证其对E2的降解效果。无机盐培养基配方为：NH4NO 3L Og · L1，KH2PO4O. 5g · L1， K2HPO4L 5g · L -S NaCl 1.0 g · L -S MgSO4 · 7Η200· 2g · L -S pH 8. 0 ;固体培养基加 20g · L -1 琼脂。
[0030] 降解效果的验证方法：向培养液中加入等体积色谱甲醇后，超声处理30min混匀， 12000r ·π?η 1离心去除沉淀后取上清液用滤膜过滤（孔径0. 22 μ m)，用高效液相色谱法测 定其中的E2含量。高效液相色谱（岛津LC - 20AT)设定参数为：Inertsil ODS - SP - C18 反相色谱柱（150臟\4.6111111，5 4111)，流动相为乙腈：水=70:30，流速1.0001]11^111；[]1 - 1，柱温 40°C，紫外检测波长280nm。外标法按峰高定量。
[0031] 从富集液中分离到一株E2降解菌，命名为菌株JX-2。菌株JX-2降解E2前后的 液相色谱检测结果表明菌株JX -2在7d内对初始浓度为30mg吨1的E2降解率大于90%。 菌株JX - 2在固体LB培养基上生长3d后，菌落为圆形，表面隆起，湿润光滑，呈橙黄色，菌 体易挑起。在透射电子显微镜下该菌呈短杆状，大小为（〇. 6~1. 0) μ mX (1. 4~2.