七鳃鳗口腔腺寄生菌株lj1、分泌蛋白、分离方法及用图
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种分泌蛋白活性高，即能够同时降解纤维蛋白原Aa链、Ββ链和γ链，又能够降解纤维蛋白的七鳃鳗口腔腺寄生菌株LJ1、分泌蛋白、分离方法及用途。
【背景技术】
[0002]随着人类平均寿命的延长、生活环境以及膳食习惯的变化，心、脑血管疾病的发病率、死亡率和致残率正逐年增高。最常见的是血栓性心脑血管疾病，通常表现为心肌梗死、脑卒中以及周围血管病变。据世界卫生组织统计，全球每年平均有1700万人被心脑血管血栓疾病夺走生命，占世界总死亡人数的30%。市场上对预防和治疗血栓性疾病药物的需求量已呈现出逐年增长之势。纤维蛋白原和纤维蛋白是凝血级联反应过程中两个关键的底物蛋白质。目前，研宄人员已从蛇的毒腺、吸血动物的唾液腺、植物以及细菌中分离得到了多种具有纤溶活性的水解酶一纤溶酶，用于制备抗凝溶栓药物。但是现有纤溶酶活性较低，只能降解纤维蛋白原，多数对纤维蛋白并无作用。且大多只能降解纤维蛋白原的Aa链和Ββ链，基本不降解纤维蛋白原的γ链。只有来源于真菌(/7Zetfroiw1S osireaiiAs)、植物{Car i ca caflt/afflarceflsis)、蜜蜂毒腺(Cb/ws和粉正虫引rube I Ius)的蛋白酶才能够全部降解纤维蛋白原Aa链、Ββ链和γ链。
【发明内容】
[0003]本发明为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种分泌蛋白活性高，即能够同时降解纤维蛋白原Aa链、Ββ链和γ链，又能够降解纤维蛋白的七鳃鳗口腔腺寄生菌株LJl、分泌蛋白、分离方法及用途。
[0004]本发明的技术解决方案是:一种七鲍饅口腔腺寄生菌株LJl (Stenotrophomonasmaltophilia )，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.10680。
[0005]一种上述七鳃鳗口腔腺寄生菌株LJl的分泌蛋白，其特征在于其cDNA序列及氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0006]一种上述七鳃鳗口腔腺寄生菌株LJl的分离方法，其特征在于按照如下步骤进行:
a.取七鳃鳗口腔腺分泌液；
b.用pH7.4、含有50 mM NaCl的50 mM Tris-HCl将分泌液稀释100倍，
然后涂LB平板于37°C恒温培养过夜；
c.从LB平板上挑取单克隆菌落于含有5ml LB的培养基中，28°C摇床中培养12~48
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[0007]一种上述七鳃鳗口腔腺寄生菌株LJl的分泌蛋白在制备抗血栓类药物中的应用。
[0008]本发明从七鳃鳗口腔腺分泌液中分离得到具有高纤溶活性的菌株，属于嗜麦芽寡养单胞菌，菌株代码LJ1，拉丁文学名maltophilia，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.10680，菌种保藏日期:2015年4月2日。该菌株所分泌天然蛋白是一种高活性纤溶酶，能够在几秒钟内迅速降解血液中的纤维蛋白原的三条多肽链，从而有效抑制血液凝固及血栓形成；并且还能够通过直接降解纤维蛋白或激活纤溶酶原从而具有溶栓作用；对血液中的其他组分均无明显的降解作用，表明该分泌蛋白具有较强的专一性，在抗血栓类药物领域有较高的应用前景。
【附图说明】
[0009]图1是本发明实施例分泌蛋白的纤维蛋白原水解酶活性效果示意图。
[0010]图2是本发明实施例分泌蛋白的纤维蛋白水解酶活性检测效果图。
[0011]菌种保藏日期:2015-04-02。
[0012]保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。
[0013]菌种保藏代号:CGMCC 10680。
保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号
【具体实施方式】
[0014]七鳃鳗口腔腺寄生菌株LJl的分离:
a.在中国黑龙江省松花江同江流域捕获处于洄游期的成体日本七鳃鳗数条，在无菌条件下剥离位于眼眶下、口腔内、呈豆子形状的口腔腺体，将腺体内的液体(分泌液)抽出；
b.无菌条件下，将分泌液用无菌的、含有50mM NaCl的50 mM Tris-HCl (pH 7.4)稀释100倍，然后涂LB平板于37°C恒温培养过夜；
c.从LB平板上挑取单克隆菌落于含有5ml LB的培养基中，于28°C摇床中培养12~48h，获得菌株。
[0015]对所获得菌株进行了 16S rDNA鉴定、生理生化性质分析及菌株的保存。
[0016]该菌株的16S rDNA如SEQ ID NO:1所示，属于嗜麦芽寡养单胞菌，菌株代码LJ1， 文学名Stenotrophomonas maltophilia，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.10680，菌种保藏日期:2015年4月2日。
[0017]七鳃鳗口腔腺寄生菌株LJl分泌蛋白的制备:
采用硫酸铵沉淀富集活性菌株上清，经透析及冷冻干燥后，运用离子交换层析(DEAE-Sephadex) /疏水层析(Phenyl Sepharose ? CL-4B)分离纯化得到电泳纯蛋白；经质谱鉴定、N末端测序及基因克隆方法获得该蛋白的cDNA序列。BCA法测定分泌蛋白质的浓度；12%十二烷基磺酸钠聚丙酰胺凝胶电泳和质谱检测目的蛋白质的纯度。
[0018]七鳃鳗口腔腺寄生菌株LJl分泌蛋白的开放阅读框序列为1854 bp长，蛋白质有617个氨基酸组成，其cDNA序列及由其推导的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0019]实验:
1.本发明实施例分泌蛋白的纤维蛋白原水解酶活性实验:
将人纤维蛋白原(2.5mg/ml)与本发明实施例的分泌蛋白(10 μ g)于37°C反应，并于10秒、30秒、I分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟和30分钟时取样，采用12%十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。结果如图1所示:1，纤维蛋白原对照；2-9依次为本发明实施例的分泌蛋白与纤维蛋白原反应时间为10秒、30秒、I分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟和30分钟结果。结果表明当本发明实施例分泌蛋白与纤维蛋白原反应10秒时，大部分纤维蛋白原的Aa链已发生降解；小部分的Ββ链发生降解；反应时间为30秒时，Aa链已完全被降解；反应时间为2分钟时，B β链被完全降解；反应时间为10分钟时，γ链开始发生降解；反应时间为15分钟时，该分泌蛋白对纤维蛋白原γ链的降解反应已达到平衡，在35 kDa-45 kDa之间产生很明显的降解带。
[0020]2.纤维蛋白平板法检测本发明实施例分泌蛋白的纤维蛋白水解酶活性及纤溶酶原激活剂活性。
[0021]纤维蛋白平板法是目前最为经典的测定纤溶酶活力的方法，其原理是利用凝血酶引起纤维蛋白原形成纤维蛋白制成平板以检测纤维蛋白水解酶活性。以标准蚓激酶和标准尿激酶作为对照，测定本发明分泌蛋白的纤维蛋白水解酶活性。
[0022]缓冲液A20 mM Tris-HCl，pH 8.0
缓冲液 B20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，pH 8.0
琼脂糖溶液75 mg/mL溶于缓冲液B
纤维蛋白原溶液50 mg/mL溶于缓冲液A
凝血酶200 U/mL溶于缓冲液A
纤溶酶原溶液60 U/mL溶于缓冲液A
a.琼脂糖溶液100mL在微波炉中加热溶解，在60°C的水浴中至少保温25分钟；
b.迅速加入15.0 mL的纤维蛋白原溶液，0.5 mL凝血酶溶液和1.0 mL的纤溶酶原溶液，轻轻晃动混匀；
c.将混合液迅速倒入8块灭菌的塑料平皿中(=5.0 cm)，待其冷却凝固后，于4°C下保存备用，此平板为富含纤溶酶原的平板，记为阳性板(+);
d.制作不含纤溶酶原的阴性(一)平板时，不加纤溶酶原溶液；为避免市售的纤维蛋白原中可能含有的纤溶酶原，将制好的平板须放在80°C下灭活30分钟；
e.测活时，在平板上打孔，加入待测样品，37°C下温箱保温16小时后取出观察是否有溶圈出现。
[0023]结果如图2所示:图2中A:不含有纤溶酶原的纤维蛋白平板(阴性)。B:含有纤溶酶原的纤维蛋白平板(阳性)。1，尿激酶(25 U);2，蚓激酶(2 U) ;3，本发明实施例分泌蛋白(10 μ g)o
[0024]显示:在不含有纤溶酶原的纤维蛋白平板上(阴性纤维蛋白平板)，本发明实施例分泌蛋白能够像蚓激酶(阳性对照)一样在阴性纤维蛋白平板上形成明显的纤维蛋白溶圈，表明该组分能够直接水解纤维蛋白；此时，尿激酶由于需要通过依赖激活纤溶酶原从而在纤维蛋白平板上形成溶圈，因此不能在阴性纤维蛋白平板上形成溶圈。在含有纤溶酶原的纤维蛋白平板上(阳性纤维蛋白平板)，本发明实施例分泌蛋白依然能够在阳性纤维蛋白平板上形成纤维蛋白溶圈，表明其具有纤维蛋白水解酶活性。此外，阳性纤维蛋白平板上的溶圈面积比阴性纤维蛋白平板上的溶圈面积大，提示本发明实施例分泌蛋白还具有激活纤溶酶原的活性。
【主权项】
1.一种七鲍饅口腔腺寄生菌株LJl ( Stenotrophomonas maltophiIia )，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.10680。2.一种如权利要求1所述七鳃鳗口腔腺寄生菌株LJl的分泌蛋白，其特征在于其cDNA序列及氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.一种如权利要求1所述七鳃鳗口腔腺寄生菌株LJl的分离方法，其特征在于按照如下步骤进行: a.取七鳃鳗口腔腺分泌液； b.用pH7.4、含有50 mM NaCl的50 mM Tris-HCl将分泌液稀释100倍，然后涂LB平板于37 °C恒温培养过夜；c.从LB平板上挑取单克隆菌落于含有5ml LB的培养基中，28°C摇床中培养12~48h04.一种如权利要求2所述七鳃鳗口腔腺寄生菌株LJl的分泌蛋白在制备抗血栓类药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开一种七鳃鳗口腔腺寄生菌株LJ1（Stenotrophomonas maltophilia ），已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 10680。该菌株所分泌天然蛋白是一种高活性纤溶酶，能够在几秒钟内迅速降解血液中的纤维蛋白原的三条多肽链，从而有效抑制血液凝固及血栓形成；并且还能够通过直接降解纤维蛋白或激活纤溶酶原从而具有溶栓作用；对血液中的其他组分均无明显的降解作用，表明该分泌蛋白具有较强的专一性，在抗血栓类药物领域有较高的应用前景。CGMCC No. 1068020150402
【IPC分类】A61P7/02, C12N1/02, A61K38/16, C07K14/195, C12N1/20
【公开号】CN104894013
【申请号】CN201510255294
【发明人】李庆伟, 肖蓉, 唐敏, 李丽
【申请人】辽宁师范大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月19日