专利名称：重组日本七鳃鳗口腔腺Grimin蛋白诱导细胞凋亡及其抗肿瘤的作用的制作方法
技术领域：
日本七鳃鳗口腔腺GRIMIN蛋白的基因克隆与表达属于生物技术领域，涉及到日本七鳃鳗口腔腺中GRIMIN蛋白的cDNA序列及克隆、与之对应的蛋白质序列及其在大肠杆菌或毕赤酵母中的表达，及该重组蛋白通过抑制STAT3(Signal transduceran activator of transcription，信号转导与转录活化因子)的活性而特异性诱导肿瘤细胞发生凋亡，从而“杀死”肿瘤细胞，而且可以利用质脂体进行包被作为药物剂型在抗肿瘤药物中应用。
背景技术：
日本七鳃鳗(Lampetra japonica)属圆口纲(Cyclostomata)、七鳃鳗目、七鳃鳗科、七鳃鳗属，是迄今发现的最古老的无颌脊椎动物。其为海洋洄游性鱼类，成体生活在海洋，经常用吸盘附在其它鱼体上吸食其血与肉，七鳃鳗的这种独特的生活习性暗示着其体内必定含有某些不同于其它生物物种的生物活性物质。
GRIMIN为源自于日本七鳃鳗口腔腺的GRIM-19样抗肿瘤基因重组蛋白。GRIM-19因可被干扰素beta和视黄酸所诱导表达而得名，其能通过抑制STAT3(Signal transduceran activator of transcription，信号转导与转录活化因子)的活性而特异性诱导肿瘤细胞发生凋亡，从而“杀死”肿瘤细胞。因此，GRIM-19被认为是一种新的细胞死亡调节因子。
由于GRIM-19能特异性抑制STAT3分子发挥作用来阻断肿瘤细胞的信号传递途径，促进肿瘤细胞凋亡或者逆转恶性表现型，而日本七鳃鳗GRIMIN与GRIM-19具有相同的功能结构域及较高的序列同源性，这使得GRIMIN有望成为高效低毒、副作用小的抗肿瘤基因工程新药。
发明内容
本发明于日本七鳃鳗口腔腺cDNA文库中发现了一条能翻译出GRIMIN蛋白的开放阅读框，经对其mRNA全长的进行钓取、测序及cDNA克隆，对其重组蛋白在大肠杆菌中进行了高效诱导表达。这个重组蛋白的生物学活性涉及到通过抑制STAT3的活性而特异性诱导肿瘤细胞发生凋亡，从而“杀死”肿瘤细胞，因此，有望开发临床治疗肿瘤新的蛋白药物。
本发明从日本七鳃鳗口腔腺中分离提取mRNA，利用从前期构建的cDNA文库、EST文库中获得的生物学信息及mRNA全长钓取的测序结果选取开放阅读框设计引物，采用RT-PCR方法获得了GRIMIN蛋白的cDNA及其序列，本发明还提供了在大肠杆菌Rosetta菌中成功表达的蛋白及其序列，该GRIMIN重组蛋白具抗肿瘤的生物学活性，可利用脂质体包被作为药物剂型在抗肿瘤药物中应用。
GRIMIN蛋白的cDNA序列及由其推导的蛋白质氨基酸序列如下1.GRIMIN的cDNA序列435bp长，其蛋白质由144个氨基酸组成，蛋白分子量为20.42051KD。其cDNA序列及由其推导的蛋白质氨基酸序列为
1 atggcggcgtccaaggtgaagcaggacatgcctccgccgggaggtM A A S K V K Q D M P P P G G46 tacgggcccgtggactacaaacgaaacctccccaagaggggcctcY G P V D Y K R N L P K R G L91 tctggatactccatgtttgccattgggattggactcatgttatacS G Y S M F A I G I G L M L Y136 ggccagtataggattttcaagtggaaccgagagagaaggcggttgG Q Y R I F K W N R E R R R L181 cagattgaagagttggaatctcggattgcaatcttgccccttctgQ I E E L E S R I A I L P L L226 caagcggagcaagatagacatgttttgcagcaggtgcgcgagaacQ A E Q D R H V L Q Q V R E N271 ctggaggaggaggccaagatcatgaaggacgtgcccgggtggaagL E E E A K I M K D V P G W K316 gttggcgagagcgtgtacaactcgaaccgctggcacacgcccaccV G E S V Y N S N R W H T P T361 attgaccagctctacttcctgagggacgacgtcgacttggctcgcI D Q L Y F L R D D V D L A R406 gataagctcaaccacctcttccacgtgtag 435D K L N H L F H V *GRIMIN蛋白抑制肿瘤细胞生长并促进其凋亡的生物学活性实验如下培养人脐静脉内皮细胞ECV304，收集细胞。未加蛋白作用的细胞作阴性对照；未加蛋白仅加脂质体的细胞做脂质体对照；加入蛋白和脂质体混合物的结果与对照相比；结果显示经过脂质体包裹的蛋白作用的细胞出现明显的细胞凋亡，而同时证明脂质体对细胞没有作用。这说明GRIMIN蛋白具有能够诱导细胞发生凋亡的活性。
图1为本发明实验流程图。
图2为细胞凋亡测定实验。
(1)MTT法测定结果显示，纯化并复性后的脂质体包被GRIMIN对人白血病细胞HL60及人脐静脉血管内皮细胞ECV304增殖均具有显著抑制作用，对HL60及ECV304作用的半剂量效应IC50分别为4.6umol/L及5umol/L。
(2)纯化并复性后的脂质体包被GRIMIN能诱导人白血病细胞HL60及人脐静脉内皮细胞发生凋亡。
图3为DNA LADDER法示脂质体包被的5umol/L的GRIMIN能诱导HL60及ECV304细胞发生凋亡。
(1)ECV304细胞发生DNA断裂；(2)HL60细胞发生DNA断裂。
图4为流式细胞仪测定脂质体包被的5umol/L的GRIMIN诱导HL60细胞发生凋亡。
III区示HL60部分细胞发生早期凋亡；IV区示部分HL60细胞发生了晚期凋亡。
图5为Hoechst染色法示脂质体包被GRIMIN诱导ECV304细胞发生凋亡(Olympus荧光显微镜，400X)(1)PBS对照示正常ECV304细胞的细胞核只被染成淡蓝色；
(2)脂质体作用对照ECV304细胞的细胞核只被染成淡蓝色，表明脂质单独作用细胞不发生凋亡。
(3)脂质体包被的8umol/L的GRIMIN诱导发生凋亡细胞核由于致密浓缩，吸收Hoechst染料能力增强，细胞核发出亮蓝色荧光。
具体实施例方式
1.总RNA的提取采用GIBCOBRL的Trizol试剂。具体如下(1)取日本七鳃鳗口腔腺迅速置于液氮中保存；(2)称取0.2g口腔腺组织，加1ml TRIzol试剂制备毒腺匀浆，4℃孵育5min；(3)加0.2ml氯仿，盖紧盖后用力振摇15sec，然后置于冰上5min；(4)4℃，12000xg，离心15min；(5)将上层水相移入另一离心管，加0.5ml异丙醇，并在冰上孵育10min；(6)4℃，12000xg，离心15min；(7)弃上清，在沉淀(含RNA)中加1ml 75％乙醇洗涤，旋涡混匀；(8)4℃，10000xg离心5min，得到RNA沉淀；(9)空气干燥后，用适量TE或无Rnase水溶解备用。
2.以自行设计的引物进行RT-PCR扩增，以获得日本七鳃鳗口腔腺GRIMIN蛋白的cDNA；按以下条件进行反转录反应42℃20min，99℃5min，5℃5min引物序列如下P1-15’-XXcatatggcggcgtccaaggtgaagcag-3’P1-25’-XXaagcttcacgtggaagaggtggttgag-3’3.将获取的目的cDNA与pET23b(Novagen公司产品)载体相连接，转化入克隆菌DH5a后进行阳性转化子的筛选鉴定。
为产生带有组氨酸标签的融合蛋白，选择pET23b做为基因克隆的载体，克隆具体操作如下(1)目的基因的回收与测序目的基因的回收采用TaKaRa PCR Fragment Recovery Kit进行，对回收DNA进行测序。
(2)质粒的提取采用宝生物的质粒提取试剂盒进行。
(3)目的基因DNA片段与载体pET23b的连接由于所设计的引物分别带有Nde I和Hind III酶切位点，而这两个酶切位点也是pET23b的多克隆位点，这使得将目的基因DNA片段与载体pET23b的连接成为可能。
(4)将连接产物CaCl2法转化至克隆菌E.coli Rosetta菌中。
(5)阳性转化子的筛选鉴定利用T7通用引物法和双酶切法进行阳性转化子的筛选鉴定。
4.对阳性重组子进行终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达。诱导表达条件为37℃诱导5h。
5.对表达的重组蛋白进行组氨酸亲和层析纯化。
1)10000g离心10min收获菌体，弃上清，并使残液尽量流出。以每100ml的原培养液加40ml冰冷的1X Binding buffer的比例重悬细胞。
2)将上述样品置于冰上超声裂解细胞，直至溶液不再粘稠。
3)再以每100ml的原培养液加20ml冰冷的1X Binding buffer的比例重悬细胞。
4)10000g离心15min收集菌体，弃上清，以每100ml加5ml的比例加入6M尿素Binding buffer冰浴1h，进行变性。
5)14000g离心30min以去除细胞碎片。
6)上清以0.45μm的滤膜过滤。
7)吸去His.Bind Column上室的贮液，并打开下面管口；8)用10ml的1x Binding Buffer对柱子进行平衡；
9)将过滤好的上清液上样；10)用10ml的1x Binding Buffer(含6M尿素)洗柱；11)用10ml的20mM 1x Wash Buffer(含尿素)洗柱；12)用5ml的1x Elute Buffer(含尿素)洗脱目的蛋白。
6.培养细胞进行细胞凋亡测定.
具体实验步骤如下MTT实验(1)培养人白血病细胞HL60及人脐静脉内皮细胞ECV304，收集细胞。
(2)于96孔板中种好细胞，留出PBS对照，然后分别以2、4、6、8、10、12、14、16、18、20微升浓度加入蛋白，于CO2浮箱中孵育4h。
(3)酶标仪检测蛋白对细胞增殖的抑制作用。
DNA lader实验(1)收集人白血病细胞HL60及人脐静脉内皮细胞ECV304。
(2)分别取一瓶作对照，然后分别在另一瓶细胞中加入160微升蛋白和40微升脂质体的混合的物，于CO2浮箱中孵育24h。
(3)按说明书提取DNA lader。
(4)电泳观察照相。
流式细胞仪实验(1)收集人白血病细胞HL60。
(2)种于六孔板中，加入100微升蛋白，CO2浮箱孵育过夜，蛋白作用16h。
(3)流式细胞仪检测细胞凋亡程度。
Hoechst染色实验(1)培养人脐静脉内皮细胞ECV304，收集细胞。
(2)以未加蛋白作用的和只加脂质体的细胞株分别作对照；另一株则加入160微升蛋白和40微升的脂质体混合物，于CO2浮箱中培养48h。
(3)取出细胞，分别进行普通光学染色和荧光染色处理。
(4)分别进行普通光学和荧光显微镜观察照相。
权利要求
1.一种来源于日本七鳃鳗口腔腺被命名为GRIMIN，具如下氨基酸序列的GRIM-19蛋白，它由144个氨基酸组成，蛋白分子量为20.42051KD，其蛋白质的氨基酸序列为，M A A S K V K Q D M P P P G GY G P V D Y K R N L P K R G LS G Y S M F A I G I G L M L YG Q Y R I F K W N R E R R R LQ I E E L E S R I A I L P L LQ A E Q D R H V L Q Q V R E NL E E E A K I M K D V P G W KV G E S V Y N S N R W H T P TI D Q L Y F L R D D V D L A RD K L N H L F H V
2.根据权利要求1所述的日本七鳃鳗口腔腺GRIM-19蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的日本七鳃鳗口腔腺GRIM-19蛋白基因连接于pET23b载体的重组质粒。
4.根据权利要求3所述的日本七鳃鳗口腔腺GRIM-19蛋白基因连接于pET23b载体的重组质粒转化的基因工程菌。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌重组蛋白的制备方法。
6.根据权利要求1所述来源于日本七鳃鳗口腔腺的GRIM-19蛋白，其生物学活性涉及到通过抑制信息转导与转录活化因子(STAT3)的活性而特异性诱导肿瘤细胞发生凋亡，从而“杀死”肿瘤细胞，利用质脂体进行包被作为药物剂型在抗肿瘤药物中应用。
全文摘要
一具抗肿瘤作用的“日本七鳃鳗口腔腺GRIMIN蛋白的基因克隆与表达”属于生物技术领域，涉及到日本七鳃鳗口腔腺中GRIMIN蛋白的cDNA序列及克隆、与之对应的蛋白质序列及其在大肠杆菌或毕赤酵母中的表达，及该重组蛋白通过抑制STAT3(Signal transduceran activator of transcription，信息转导与转录活化因子)的活性而特异性诱导肿瘤细胞发生凋亡，从而“杀死”肿瘤细胞，而且可以利用质脂体进行包被作为药物剂型在抗肿瘤药物中应用。
文档编号C12N1/21GK101033253SQ20061013468
公开日2007年9月12日 申请日期2006年12月8日 优先权日2006年12月8日
发明者李庆伟, 王继红, 麻晓庆 申请人:辽宁师范大学