七鳃鳗crbgp在制备抗血管新生药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种七鳃鳗CRBGP在制备抗血管新生药物中的应用。本发明发现了七鳃鳗天然及重组CRBGP能够抑制由bFGF诱导的人脐静脉血管内皮细胞（HumanUmbilicalVeinEndothelialCells，HUVEC）的增殖，并呈剂量依赖性，其IC50为4.8μmol/L；同时发现七鳃鳗天然及重组CRBGP对由bFGF诱导的六日龄鸡胚绒毛尿囊膜（chickenchorioallantoicmembrane，CAM）血管新生具有抑制作用，可应用于制备低毒、高效的抗血管新生药物。
【专利说明】七鳃鳗CRBGP在制备抗血管新生药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种七鳃鳗CRBGP的用途，尤其是一种七鳃鳗CRBGP在制备抗血管新生药物中的应用。
【背景技术】
[0002]血管新生指从已存在的血管中发展出新的微血管，在一些正常的生理过程中(诸如胚胎发育、伤口愈合、黄体形成)扮演重要角色。然而，非预期的血管新生也会导致多种疾病发生，如慢性炎症、糖尿病引起的视网膜病、脉络膜新生血管、银屑病、骨髓增生异常综合症、类风湿性关节炎以及肿瘤等，严重危害人类的生命健康和生活质量。因此，开发低毒、高效的抗血管新生药物是目前治疗与炎症相关血管新生异常疾病的热点。
[0003]富含半胱氨酸分泌蛋白(Cysteinerich secretory proteins, CRISP)是一类在进化上高度保守的蛋白质，含有16个高度保守的半胱氨酸残基，可形成8对二硫键。空间结构主要由 N 端的 PR-1 结构域(pathogenesis-related group I domain)、C 端的 CRD 结构域(cysteine-rich domain)以及连接这两个结构域的铰链区域三部分组成。近年来研究发现，哺乳动物中的CRISP家族各成员主要分布于生殖道中，在精子的成熟、精卵融合以及免疫系统中发挥着非常重要的作用；而非哺乳动物中的CRISP家族成员则主要分布于腺体的分泌液中，能够阻断K+、Ca2+及环核苷酸门控通道等，并与炎症反应密切相关。
[0004]七觸鳗CRBGP是从日本七觸鳗(ZaffijDeira japonica) 口腔腺中分离纯化出的一种新型富含半胱氨酸分泌蛋白，因与CRISP家族成员具有高度同源性，同样具有16个高度保守的半胱氨酸残基，因此将其命名为富含半胱氨酸的口腔腺分泌蛋白(cysteine-richbuccal gland protein, CRBGP)。
[0005]七鳃鳗CRBGP的cDNA序列(开放阅读框)含有774bp，其蛋白质有257个氨基酸组成，质谱测定分子量为25.6 kDa，其cDNA序列及由其推导的蛋白质氨基酸序列如下:
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目前，已经发现七鳃鳗天然CRBGP是Na+通道阻断剂，能够阻断海马神经元和背根神经元的Na+电流，降低海马神经元和背根神经元的动作单位从而抑制神经元的兴奋性；此外还发现七鳃鳗CRBGP对海马神经元的K+通道也具有阻断作用。迄今为止，尚未见有关富含半胱氨酸分泌蛋白抑制血管新生功能的报道。
【发明内容】
[0006]本发明发现了七鳃鳗CRBGP的抗血管新生功能，从而发明了七鳃鳗CRBGP在制备抗血管新生药物中的应用。
[0007]本发明的技术解决方案是一种七鳃鳗CRBGP在制备抗血管新生药物中的应用。
[0008]本发明发现了七鳃鳗天然及重组CRBGP能够抑制由bFGF诱导的人脐静脉血管内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)的增殖,并呈剂量依赖性,其IC50为4.8 μ mol/L ;同时发现七鳃鳗天然及重组CRBGP对由bFGF诱导的六日龄鸡胚绒毛尿囊膜(chicken chor1allantoic membrane,CAM)血管新生具有抑制作用，可应用于制备低毒、高效的抗血管新生药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1七鳃鳗CRBGP对由bFGF诱导的HUVEC细胞增殖的抑制作用效果图。
[0010]图2七鳃鳗CRBGP对由bFGF诱导的六日龄鸡胚绒毛尿囊膜血管新生的抑制作用效果图。
【具体实施方式】
[0011]本发明通过分子筛层析技术(S^hadex G75)从日本七鳃鳗口腔腺中分离得到电泳纯度的七鳃鳗天然CRBGP。
[0012]利用基因克隆手段将七鳃鳗CRBGP基因连接至pEGX-4T-l表达载体(或其他形式载体)于疋coli Rosetta中进行诱导表达，并采用GST亲和层析方法纯化重组七鳃鳗CRBGP, 12%聚丙烯酰胺凝胶电泳和质谱检测目的蛋白质，其纯度及准确性与目标蛋白相一致。
[0013]实验:
1.MTT法测定七鳃鳗CRBGP对HUVEC细胞增殖的抑制作用。
[0014](I)将状态良好的HUVEC细胞接种于96孔板中，并在含有bFGF (终浓度为3ng/mL)的RPMI 1640培养液中培养24小时；
(2)实验组依次加入不同浓度梯度(5μ L、10 μ L、15 μ L、20 μ L)的七鳃鳗天然CRBGP，对照组加入等体积的PBS，继续培养24小时；
(3)加入终浓度为0.5 mg/mL的MTT溶液10 μ L，于37°C，CO2培养箱中继续培养4小时；
(4)轻轻吸去培养液，并向96孔板中加入DMSO(100 μ L)，在37°C的摇床中振荡培养10分钟； (5)利用酶标仪测定对照组和实验组细胞在492nm处的吸收值；
(6)每组实验均为3次实验取平均值；
(7)细胞的杀伤率=(对照组吸光度的平均值-实验组吸光度的平均值)/对照组吸光度的平均值X 100%。
[0015]实验结果如图1所示:表明七鳃鳗CRBGP能够抑制由bFGF诱导的人脐静脉血管内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)的增殖,并呈剂量依赖性,其IC50 为 4.8 μ mol/Lo
[0016]2.利用鸡绒毛尿囊膜系统进行体内抗血管新生功能测定。
[0017]选用鸡绒毛尿囊膜(chicken chor1allantoic membrane, CAM)模型观察七觸鳗CRBGP对鸡胚血管新生的抑制作用。CAM模型是目前筛选研究抗血管新生药物和作用机制的最佳模型之一，具有实验周期短、结果快等特性，被广大学者认可。通常情况下，正常鸡胚的血管从第6日开始便迅速形成和扩张，此时血管发育旺盛，主要以芽生、套叠方式生成。首先采用bFGF (200 ng/embryo)诱导鸡胚血管新生，24小时后采用不同浓度的七鳃鳗CRBGP或等量的PBS作用于鸡胚。具体步骤如下:
(1)采用75%的酒精棉球将刚购入的六日龄鸡胚表面擦拭干净；
(2)使用锉刀在距离胚头的1/3处挫出Icm2的小窗；
(3)将无菌的玻璃纤维滤纸片置于CAM内有血管处，并在滤纸片上加入bFGF(200 ng)或等量PBS ；
(4)用透明胶带将小窗封好，于37°C恒温箱中孵育24小时；
(5)在滤纸片上加入不同浓度梯度(0.5 μ g>l μ g>5 μ g>10 μ g、20 Ug的七觸鳗天然CRBGP或等量的PBS，并用透明胶带封好；
(6)继续放入37°C恒温箱中孵育24小时；
(7)24小时后，将滤纸片小心揭除，随即进行拍照。
[0018]结果如图2所示:与PBS对照组相比，经bFGF处理的CAM血管更加清晰，呈叶脉状且分枝繁多，血管的数目和直径都明显的增加。当于第7日加入0.5 yg的七鳃鳗CRBGP时，鸡胚血管的数目减少、在药物处理周围无放射状的密集血管网络、血管稀疏并细小。随着七鳃鳗CRBGP浓度的增加(I μ g,5 μ gUO μ g)，鸡胚血管的主枝出现明显地断裂，血管的数目也明显地减少，血管色淡且呈浅黄。当于第7日加入20 μ g的七鳃鳗CRBGP时，鸡胚的血管完全被破坏，出现了明显的无血管区域，且血管壁完全溶解。这表明七鳃鳗CRBGP对由bFGF诱导的鸡胚血管新生具有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性。
【权利要求】
1.一种七鳃鳗CRBGP在制备抗血管新生药物中的应用。
【文档编号】A61K38/17GK104288753SQ201410528552
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月10日 优先权日:2014年10月10日
【发明者】李庆伟, 肖蓉, 刘宇, 姜琪, 王红艳 申请人:辽宁师范大学