专利名称:重组日本七鳃鳗口腔腺分泌具抗炎功效l－251蛋白的制作方法
技术领域：
重组日本七鳃鳗口腔腺分泌PR-1蛋白L-251中性粒细胞抑制活性鉴定属于生物技术领域：
，涉及日本七鳃鳗口腔腺分泌L-251蛋白cDNA的序列及克隆，与cDNA对应的氨基酸序列及其在大肠杆菌或毕赤酵母中的表达，以及L-251蛋白作为CD11a和CD11b β2整合素的结合蛋白可以阻断中性粒细胞特异表达的CD11b/CD18和CD11a/CD18整合素(CR3受体)，从而抑制中性粒细胞跨内皮细胞迁移，到达炎症位点。提示七鳃鳗这种寄生性生物以此逃避宿主的炎症反应，这是除了病毒，蠕虫等物种之外，发现的具有逃逸宿主免疫监测机制的新物种，也是潜在的治疗和预防由炎症反应造成的免疫病理损伤新药。
背景技术：
中性粒细胞在外周血粒细胞中数量最多，约占外周血白细胞的60％-70％，在先天免疫中具有重要的作用，是机体抗细菌和真菌的主要免疫细胞。中性粒细胞在促炎细胞因子、趋化性物质、和趋化细胞因子的作用下可发生活化，穿过血管内皮单层，进入局部组织，发挥杀菌、细胞毒和致炎症作用。
中性粒细胞穿越血管内皮实际上是中性粒细胞和内皮细胞表面一系列黏附分子及其配体之间相互作用的过程中性粒细胞的滚动和最初的黏附主要是选择素家族P选择素、E选择素和L选择素及其配体在起作用。选择素家族分子与细胞表面的碳水化合物配体相互作用的特点是结合的亲和力很低，从而保证细胞滚动得以进行。当炎症发生时，趋化性细胞因子和趋化性物质可吸引中性粒细胞向感染或损伤部位募集，这时血管内皮细胞黏附分子(ICAM-1)的表达上调，同时中性粒细胞表面整合素β2LFA-1(CD11a/CD18)和Mac-1(CD11b/CD18)的表达增高，LFA-1与ICAM-1、Mac-1与iC3b以及Mac-1与ICAM-1之间的相互作用使中性粒细胞与活化内皮细胞发生高亲和力结合。接下来，在趋化因子梯度作用下，中性粒细胞穿过内皮细胞单层和结缔组织进入炎症部位，在炎症组织中，中性粒细胞与细胞外基质结合，定居在组织中发挥生物学作用。由此可以看出中性粒细胞表面β2整合素LFA-1和Mac-1在致炎症过程中发挥重要作用。
炎症反应一方面可以清除外来抗原或病原微生物，但另一方面可造成组织、细胞的损伤。中性粒细胞与多种疾病状态下的病理损伤有关，如局部缺血再灌注损伤、呼吸窘迫综合征、类风湿关节炎、肺气肿等。例如局部缺血再灌注损伤通常伴随着中性粒细胞的活化及向局部组织的浸润。在急性细菌感染患者和成人呼吸窘迫综合征患者体内均发现了呼吸爆发能力增强的中性粒细胞亚群，提示这些中性粒细胞亚群的大量浸润造成了肺部组织的损伤。因此，阻断白细胞与血管内皮细胞的黏附和白细胞的渗出有可能成为预防和治疗炎症性疾病的一种新的手段，并能改善在疾病状态下，由中性粒细胞造成的病理损伤。
本项研究涉及重组日本七鳃鳗(Lampetra japonica)口腔腺分泌的致病相关蛋白(PR-1)家族成员—L-251中性粒细胞抑制活性，表明L-251蛋白具有潜在的抗炎药用价值。
日本七鳃鳗，属圆口纲，七鳃鳗科。七鳃鳗为典型的洄游性、肉食性动物。既营独立生活，又营寄生生活，经常用吸盘附在其它鱼体上，用吸盘内和舌上的角质齿锉破鱼体，吸食其血与肉，有时被吸食之鱼最后只剩骨架。营独立生活时，则以浮游动物为食。仔鳗期以腐植碎片和丝状藻类为食。生殖时期的成鱼停止摄食。
1994年美国科学家首次从狗钩虫(Ancylostoma caninum)分离并克隆了中性粒细胞抑制因子(Neutrophilinhibitory factor NIF)。NIF以nmol浓度就可以抑制中性粒细胞与内皮细胞的黏附以及黏附依赖的H2O2的产生。在一个猪肺模型体内实验中，可以看到NIF灌注可以防止中性粒细胞介导的肺血管损伤。此外，NIF在转基因鼠中释放，可以防止脂多糖诱导的中性粒细胞向肺内浸润而导致的肺血管损伤。在对局部大脑缺血鼠模型研究中显示，NIF可以阻断中性粒细胞渗入缺血的脑组织。1999年，SIU K.LO等人的研究结果显示，NIF是通过拮抗CD11a/CD18和CD11b/CD18 β2整合素而阻断中性粒细胞与内皮细胞的黏附。
通过对七鳃鳗口腔腺发现的L-251蛋白进行大量的同源序列比对和结构分析，发现L-251蛋白与NIF同属PR-1蛋白亚家族成员，有着相似的α-β-α三明治立体结构，在C末端是一个半胱氨酸丰富区。它们共同拥有PR-1蛋白家族高度保守的GHF(Y)TQI(V/M)VW序列，和共同的两个组氨酸、两个谷氨酸残基，Glu109，His69，His129，Glu96，这是所有PR-1蛋白如蛇毒ablomin、人肠道寄生虫分泌蛋白Na-ASP-2、狗钩虫分泌蛋白NIF、烟草NtPR-a、番茄致病相关蛋白P14a共同的特征性保守残基，这些保守残基形成网络，成簇环绕成一个电负性腔隙，这个腔隙对L-251蛋白结合CD11b/CD18β2整合素起着关键作用。
我们从七鳃鳗口腔腺分泌物钓取L-251蛋白cDNA，在大肠杆菌中进行克隆和表达，通过组氨酸亲和层析得到L-251蛋白纯品，进行了L-251蛋白抑制人外周血中性粒细胞趋化活性检测，结果显示，L-251蛋白可以抑制人外周血由fMLP活化的中性粒细胞跨3.0μM微孔纤维素滤膜迁移，说明L-251蛋白具有中性粒细胞抑制活性，这是首次在七鳃鳗这一物种中发现具有中性粒细胞抑制活性的L-251蛋白，也是继NIF后，发现的第二个外在的具有潜在抗炎药用价值的中性粒细胞抑制剂。
发明内容本项发明在日本七鳃鳗口腔腺cDNA文库中发现L-251蛋白的开放阅读框，经对其mRNA全长的进行钓取、测序及cDNA克隆，其重组蛋白在大肠杆菌中进行高效表达。L-251重组蛋白生物学活性涉及作为CD11a和CD11b β2整合素的结合蛋白，它可以拮抗中性粒细胞特异表达的CD11b和CD11a β2整合素(CR3受体)与ICAM-1结合，从而阻断中性粒细胞与内皮细胞的黏附和跨血管内皮细胞迁移、浸润到达炎症位点，具有抗炎功效。
本发明涉及日本七鳃鳗口腔腺分泌L-251蛋白的cDNA序列及克隆、与之对应的蛋白质序列及其在大肠杆菌或毕赤酵母中的表达，及其抑制中性粒细胞与内皮细胞的黏附和跨血管内皮细胞迁移、浸润到达炎症位点的生物学活性。
本发明从日本七鳃鳗口腔腺中分离提取mRNA，利用前期构建的cDNA文库、EST文库中获得的生物学信息及mRNA全长钓取的测序结果选取开放阅读框设计引物，采用RT-PCR方法获得了L-251蛋白的cDNA及其序列，本发明还提供了L-251在大肠杆菌BL21中成功表达的蛋白及其序列，L-251蛋白具有抑制中性粒细胞迁移的生物学活性，可作为抗炎药物进行开发。
L-251蛋白cDNA序列推导的蛋白质氨基酸序列如下L-251蛋白cDNA序列738bp，其蛋白质由246个氨基酸组成，蛋白分子量为27,948kDa。
其cDNA序列推导的蛋白质氨基酸序列如下atg gcg agc gtc gtg gcg gcg aca tcc gtc naa cga ctg gaa gct cct gga cac gaa gct 60Met Ala Ser Val Val Ala Ala Thr Ser Val Xaa Arg Leu Glu Ala Pro Gly His Glu Alagtc ggc gaa ccg gaa ggt cat ncg tgg acg ttc aca acg agc tgc ggc gcg gcg tgg tgc 120Val Gly Glu Pro Glu Gly His Xaa Trp Thr Phe Thr Thr Ser Cys Gly Ala Ala Trp Cyscca ccg cca gca nac atg ctc aag atg gcg tac aac gaa cag gca gca gag acc agc cgc 180Pro Pro Pro Ala Xaa Met Leu Lys Met Ala Tyr Asn Glu Gln Ala Ala Glu Thr Ser Argttg ntg ggc cgc cgc ctg cag ctt ctc gca cag ccc cag caa cac gcg cac ctg nga aga 240Leu Xaa Gly Arg Arg Leu Gln Leu Leu Ala Gln Pro Gln Gln His Ala His Leu Xaa Argcgc cgc aag cag agt ggg act gcg gag aga acc tct tca tgt cca ngc aac cca cgg tcg 300Arg Arg Lys Gln Ser Gly Thr Ala Glu Arg Thr Ser Ser Cys Pro Xaa Asn Pro Arg Sertgg gac gag gca gtg cgc agc tgg tac gac gag gtc nac ctc ccc cgg ctt cca gta cgg 360Trp Asp Glu Ala Vla Arg Ser Trp Tyr Asp Glu Val Xaa Leu Pro Arg Leu Pro Val Argcac ggg ggc tgt ggg gcc cgg ggc cgt ngg gac act aca ctc agg tgg tgt ggt aca aag 420His Gly Gly Cys Gly Ala Arg Gly Arg Xaa Asp Thr Thr Leu Arg Trp Cys Gly Thr Lystcc cac cag gtg ggc tgc gcc gtc asc tac tgc ccc aac cac ccc ggc gcc ctc aag ttc 480Ser His Gln Val Gly Cys Ala Val Asn Tyr Cys Pro Asn His Pro Gly Ala Leu Lys Phectc tac gtg tgc cac tac tgc ccc gca ggg aac ctg gtc acc agg atc aac aaa ccc tac 540Leu Tyr Val Cys His Tyr Cys Pro Ala Gly Asn Leu Val Thr Thr Ile Asn Lys Pro Tyr
gac ctg ggg act ccg tgc cag gcc tgc ccc cat agc tgc gac aac aac ctg tgc acc aac 600Asp Leu Gly Thr Pro Cys Gln Ala Cys Pro His Ser Cys Asp Asn Asn Leu Cys Thr Asnccg tgc ccc tac gtg gac cag ttc agc aac tgc ccg cag ctg ttc agc gcc cac ggc tgc 660Pro Cys Pro Tyr Val Asp Gln Phe Set Asn Cys Pro Gln Leu Phe Ser Ala His Gly Cysgcg aac gac ggc gcg ggg gga acc ttc gtg cag aca aac tgc cct gcc acg tgc agc tgc 720Ala Asn Asp Gly Ala Gly Gly Thr Phe Val Gln Thr Asn Cys Pro Ala Thr Cys Ser Cysacg acg gat gtg cag tgaThr Thr Asp Val Gln 738L-251蛋白中性粒细胞抑制生物学活性如下本发明采用Boyden chamber检测技术，用德国ORPEGEN Pharma公司出品的中性粒细胞趋化性定量检测试剂盒(Migratest chemotaxis)定量检测中性粒细胞趋化性。本实验取健康人外周肝素化全血，用试剂盒中的培养基分离出白细胞，放入3.0μM微孔纤维素滤膜包被的细胞培养插件中，用带有抗LECAM抗体的荧光染料染色，在24孔板底部加入趋化性三肽fMLP(N-formyl-Met-Leu-Phe)，使中性细胞沿fMLP浓度梯度迁移，通过流式细胞仪分析488nm氩离子激光激发的荧光信号，确定中性粒细胞趋化性，实验结果显示，L-251蛋白在70nmol/L浓度可抑制50％中性粒细胞迁移，在119nmol/L浓度可抑制75％中性粒细胞迁移，表明L-251蛋白是中性粒细胞抑制剂，具有潜在的抗炎药用价值。
图1、本发明实验流程图图2、pET23b质粒图谱图3、重组pET23b-L251双酶切鉴定图4L-251蛋白SDS-PAGE图5、流式细胞仪中性粒细胞趋化性检测结果图6、流式细胞仪检测原始数据统计表图7、L-251中性粒细胞抑制图表具体实施方式
1.总RNA的提取采用GIBCO BRL的Trizol试剂。具体如下(1)取日本七鳃鳗口腔腺迅速置于液氮中研磨；(2)称取0.2g腺体组织和分泌物，加1ml TRIZOL试剂制备匀浆，4℃孵育5min；(3)加0.2ml氯仿，盖紧盖后用力振摇15second，然后置于冰上5min；(4)4℃，12000g，离心15min；
(5)将上层水相移入另一离心管，加0.5ml异丙醇，并在冰上孵育10min；(6)4℃，12000g，离心15min；(7)弃上清，在沉淀(含RNA)中加1ml 75％乙醇洗涤，旋涡混匀；(8)4℃，10000g离心5min，得到RNA沉淀；(9)空气干燥后，用适量TE或无RNase水溶解备用。
2.以自行设计的引物进行RT-PCR扩增，以获得日本七鳃鳗口腔腺L-251蛋白的cDNA；按以下条件进行反转录反应42℃20min，99℃5min，5℃5min引物序列如下P15’-XXcatatggcgagcgtcgtggcggcgaca-3’P25’-XXaagcttctgcacatccgtcgtgcagct-3’3.将获取的目的cDNA与pET23b载体相连接，转化入克隆菌DH5a后进行阳性转化子的筛选鉴定；为产生带有组氨酸标签的融合蛋白，选择pET-23b(+)做为基因克隆的载体，克隆具体操作如下(1)目的基因的回收与测序目的基因的回收采用TaKaRa PCR Fragment Recovery Kit进行；对回收DNA进行测序，此项工作由大连宝生物工程有限公司完成。
(2)质粒的提取采用宝生物的质粒提取试剂盒进行。
(3)目的基因DNA片段与载体pET23b的连接由于所设计的引物分别带有Nde I和Hind III酶切位点，而这两个酶切位点也是pET23b的多克隆位点，这使得将目的基因DNA片段与载体pET23b的连接成为可能。
(4)将连接产物CaCl2法转化至克隆菌E.coli BL21中。
(5)阳性转化子的筛选鉴定利用T7通用引物法和双酶切法进行阳性转化子的筛选鉴定。
4.对阳性重组子进行终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达。诱导表达条件为37℃，5h。
5.对表达的重组蛋白进行变性条件下的组氨酸亲和层析纯化。
(1)10000g离心10min收获菌体，弃上清，并使残液尽量流出。以每100ml的原培养液加40ml冰冷的1×Binding buffer的比例重悬细胞。
(2)将上述样品置于冰上超声裂解细胞。
(3)5000g离心15min弃上清，每100ml的原培养液加20ml含1KU/ml溶菌酶的1×Bindingbuffer重悬细胞。
(4)再次破碎，以释放更多的目的蛋白。
(5)重复上述操作直至菌体充分裂解。
(6)将破碎完全的菌体沉淀按每100原液加入5ml含6mol尿素的1×Bindingbuffer重悬细胞。
(7)冰上1h，使蛋白充分融解。
(8)16000g离心30min，取上清以0.45μm的滤膜过滤。
(9)吸去His.Bind Column上室的贮液，并打开下面管口；(10)用10ml的1×Binding Buffer对柱子进行平衡；(11)将过滤好的上清液上样；用10ml的1×Binding Buffer洗柱；(12)用10ml的1×Wash Buffer洗柱；(13)用5ml的1×Elute Buffer洗脱目的蛋白；(14)透析缓慢除去变性剂。
6.分离白细胞用无菌技术收集5ml健康人外周肝素化全血，不要用EDTA或枸橼酸抗凝。
(1)小心将1ml肝素化全血铺在白细胞分离培养基上；(2)室温下放置40mim，不要摇动，40mim后自动分层，上层是白细胞丰富血浆，含有白细胞和血小板，下层是红细胞。如果用陈旧的血，红细胞沉淀反应需要的时间长；(3)吸出500ul上层白细胞丰富血浆，在1h内用于中性粒细胞趋化活性检测。
7.中性粒细胞趋化活性检测(1)将incubation buffer或fMLP加入24孔板的孔中，阴性对照加350ul inbubation buffer，阳性对照加350ul fMLP工作液；(2)将细胞培养插件(预先用3.0μM微孔纤维素滤膜包被)插入每一个孔中，并在两个对照和三个实验插件上分别加入100ul白细胞丰富血浆，再在三个实验孔分别加入20ul，30ul，40ul L-251蛋白；(3)将板放入37℃，水浴30mim，不要摇晃；(4)将细胞培养插件取出，吸出底部细胞悬液，放于冰上，同时在未刺激的培养插件中取出20ul细胞悬液于350ul incubation buffer中，作为LECAM-1对照；(5)在每一个孔中加入20ul荧光染料/计数试剂，旋涡混匀，冰浴10mim，闭光；(6)每孔加20ul 1×DNA染料，冰浴5mim，闭光。
在120mim内进行流式细胞仪检测。
8.流式细胞仪检测通过蓝-绿激发光(488nm氩离子激光)在流式细胞仪进行细胞分析。数据的获取是通过在FL3c通道触发荧光。首先以白细胞和记数珠设A门，再以记数珠设B门，最后以中性粒细胞设C门。
9.流式细胞仪检测结果分析
权利要求
重组日本七鳃鳗(Lampetra japonica)口腔腺分泌具抗炎功效L-251蛋白1.一条来源于日本七鳃鳗口腔腺分泌物致病相关蛋白PR-1亚家族新成员的cDNA序列及其蛋白质的氨基酸序列，特将此蛋白命名为L-251，其cDNA序列及由其推导的蛋白质氨基酸序列如下L-251蛋白cDNA序列738bp，其蛋白质由246个氨基酸组成，蛋白分子量为27.948kDa。其cDNA序列推导的蛋白质氨基酸序列如下M A S V V A A T S V X R L E A P G H E AV G E P E G H X W T F T T S C G A A W CP P P A X M L K M A Y N E Q A A E T S RL X G R R L Q L L A Q P Q Q H A H L X RR R K Q S G T A E R T S S C P X N P R SW D E A V R S W Y D E V X L P R L P V RH G G C G A R G R X D T T L R W C G T KS H Q V G C A V N Y C P N H P G A L K FL Y V C H Y C P A G N L V T R I N K P YD L G T P C Q A C P H S C D N N L C T NP C P Y V D Q F S N C P Q L F S A H G CA N D G A G G T F V Q T N C P A T C S CT T D V Q *
2.编码根据权利要求
1所述的日本七鳃鳗口腔腺L-251蛋白的基因。
3.根据权利要求
2所述的基因，其特征在于其核苷酸序列如下1 atggcgagcgtcgtggcggcgacatccgtcnaacgactggaagct46 cctggacacgaagctgtcggcgaaccggaaggtcatncgtggacg91 ttcacaacgagctgcggcgcggcgtggtgcccaccgccagcanac136 atgctcaagatggcgtacaacgaacaggcagcagagaccagccgc181 ttgntgggccgccgcctgcagcttctcgcacagccccagcaacac226 gcgcacctgngaagacgccgcaagcagagtgggactgcggagaga271 acctcttcatgtccangcaacccacggtcgtgggacgaggcagtg316 cgcagctggtacgacgaggtcnacctcccccggcttccagtacgg361 cacgggggctgtggggcccggggccgtngggacactacactcagg406 tggtgtggtacaaagtcccaccaggtgggctgcgccgtcaactac451 tgccccaaccaccccggcgccctcaagttcctctacgtgtgccac496 tactgccccgcagggaacctggtcaccaggatcaacaaaccctac541 gacctggggactccgtgccaggcctgcccccatagctgcgacaac586 aacctgtgcaccaacccgtgcccctacgtggaccagttcagcaac631 tgcccgcagctgttcagcgcccacggctgcgcgaacgacggcgcg676 gggggaaccttcgtgcagacaaactgccctgccacgtgcagctgc721 acgacggatgtgcagtga 738
4.一种重组质粒，其特征在于它含有权利要求
2或3的基因。
5.根据权利要求
4所述的重组质粒，其特征在于所述基因连接于pET23b载体上。
6.一种基因工程菌，其特征在于它被根据权利要求
4或5所述的重组质粒转化。
7.根据权利要求
6所述的基因工程菌，其特征在于其宿主细胞为E.coli BL21。
8.根据权利要求
L所述的日本七鳃鳗口腔腺L-251蛋白在治疗和预防由炎症反应造成的免疫病理损伤药物上的应用。
9.根据权利要求
8所述的应用，其中所述用于抑制免疫病理损伤的药物为抗炎的药物。
专利摘要
重组日本七鳃鳗口腔腺分泌PR－1蛋白L－251中性粒细胞抑制活性鉴定属于生物技术领域：
，涉及日本七鳃鳗口腔腺分泌L－251蛋白cDNA的序列及克隆，与cDNA对应的氨基酸序列及其在工程菌中的表达，以及L－251蛋白作为CD11a和CD11b β2整合素的结合蛋白可以阻断中性粒细胞特异表达的CD11b/CD18和CD11a/CD18整合素(CR3受体)，从而抑制中性粒细胞跨内皮细胞迁移、浸润到达炎症位点。提示七鳃鳗这种寄生性生物以此逃避宿主的炎症反应，这是除了病毒，蠕虫等物种之外，发现的具有逃逸宿主免疫监测机制的新物种，L－251蛋白具有潜在的治疗和预防由炎症反应造成的免疫病理损伤的药用价值。
文档编号C07K14/435GK1995345SQ200610047596
公开日2007年7月11日 申请日期2006年8月31日
发明者李庆伟, 吴毓, 白洁, 王继红 申请人:辽宁师范大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan