本发明属于有益微生物筛选
技术领域：
：，具体涉及一株高产蛋白酶的纳地青霉及其应用。
背景技术：
：：纳地青霉是一种霉菌发酵剂，纳地青霉能长期发酵可增加干酪、火腿的芳香和活性成分，提高其贮藏品质；研究发现，人工接种纳地青霉发酵金华火腿的品质明显优于自然成熟的金华火腿。纳地青霉在发酵过程中不产生毒素，安全性高。但是，纳地青霉霉菌发酵剂普遍存在蛋白酶活力不高，发酵性能不佳的问题，因而急需筛选获得具高产蛋白酶特性且发酵性能优良的发酵剂菌株。技术实现要素：本发明提供一株高产蛋白酶的纳地青霉及其应用，从而弥补现有技术的不足。本发明所提供的纳地青霉(Penicilliumnalgiovense)QAUS012株，于2016年7月21日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCCNo.12777。本发明的纳地青霉QAUS012株，是通过紫外诱变方法获得的；上述的纳地青霉可以用于制备干粉制剂；本发明筛选获得的纳地青霉(Penicilliumnalgiovense)QAUS012株可用于食品发酵；所述的发酵剂干粉制剂，其制备方法如下：将诱变纳地青霉菌株接入到液体培养基(配方为硝酸钠3.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30.0g，蒸馏水1000mL，pH7.3，121℃，0.1MPa灭菌15min)中，置于摇床中，28±1℃培养3～5d，无菌条件下导入玻璃安瓶，液面高度为0.8～1.0cm，加盖瓶塞后将玻璃安瓶放入冻干机冷冻干燥，得到高产蛋白酶诱变纳地青霉发酵剂干粉制剂。发酵剂干粉制剂密封保藏。本发明利用紫外线照射诱变纳地青霉，利用明胶-琼脂平板法对诱变纳地青霉菌株产胞外蛋白酶水平进行测定，用透明环直径与产生该环的菌落直径的比值来表示产酶量，最终筛选获得高产蛋白酶的纳地青霉菌株。其制备的发酵剂干粉制剂为高效浓缩发酵剂，含有较多活菌丝体和孢子，蛋白酶量更高，蛋白酶活力显著增强，且使用方便，发酵时用量更少。该发酵剂干粉制剂可经活化后用于发酵畜禽的心、脾、胗为原料的糜类饼状产品，发酵后产品质构更好；也可用于提取、分离加工成蛋白酶酶制剂。具体实施方式下面以实施例进一步对本发明进行说明，但本发明不受实施例限制。实施例1：纳地青霉的诱变筛选(1)原始纳地青霉菌株活化：制备察氏琼脂培养基试管斜面，无菌条件下将原始菌株分离划线，在28℃培养箱中培养4d。(2)原始纳地青霉菌株扩大培养：挑取活化后的原始菌株接种在察氏琼脂培养基平板上，在28℃培养箱中培养4d，筛选出生长较好的平板供诱变使用。(3)原始纳地青霉菌株紫外灯照射诱变：在正式诱变前，将15W紫外灯开启，进行30min的预热，再用预热后稳定的光波照射平板内的原始纳地青霉菌株。进行紫外灯照射诱变的菌株分为五组(每组6个平板)，五组平板照射时间分别为：60s，120s，180s，240s，300s，照射距离为30cm。照射结束后菌株避光。(4)诱变纳地青霉菌株扩大培养：选取步骤(3)中每个平板上四个相同位置挑取菌落制备菌悬液(108cfu/mL)，每份菌悬液取1mL接种在察氏琼脂培养基平板中，涂布均匀，在28℃培养箱中培养4d。(5)诱变纳地青霉菌株筛选：挑取扩大培养的诱变纳地青霉菌落制备菌悬液(108cfu/mL)，每份菌悬液取5μL点滴在明胶-琼脂平板上，在28℃培养箱培养4d后用显液(15％的氯化汞溶于2mol/L的盐酸)处理，测量菌落周围产生透明环的直径。选取透明环直径与产生该环的菌落直径之比最大的菌株为高产蛋白酶目标诱变纳地青霉菌株。(6)步骤(5)中选取的高产蛋白酶目标诱变纳地青霉菌株，重复操作步骤(3)、(4)、(5)，直至得到透明环直径与产生该环的菌落直径之比大于2.0的为高产蛋白酶诱变纳地青霉菌株。筛选获得的该高产蛋白酶诱变纳地青霉菌株于2106年7月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.12777。该纳地青霉(Penicilliumnalgiovense)QAUS012株的孢子呈青色，直立菌丝顶端的孢子呈扫帚状，无膨大。通过福林法测定纳地青霉菌株蛋白酶活力，方法如下。分别取不同质量浓度的酪氨酸标准溶液(0，10，20，30，40，50mg/L)各1mL，加入5mL浓度为0.4mol/L的碳酸钠溶液、1mL福林试剂混合后，40℃保温发色20min，在660nm下测定其吸光度。根据酪氨酸不同浓度对应的吸光度值绘制标准曲线。取1mL纳地青霉(Penicilliumnalgiovense)QAUS012菌悬液(108cfu/mL)，加入10g/L的酪蛋白溶液1mL，在40℃下反应10min，立即再各加入0.4mol三氯乙酸2mL，以终止反应，静置后过滤。再取1mL滤液与5mL浓度为0.4mol/L的碳酸钠溶液、1mL福林试剂混合后，40℃保温发色20min，在660nm下测定其吸光度。40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位。蛋白酶活力式中：X为蛋白酶活力(u/g干基)；A为由样品测得的吸光度值再查标准曲线得相当的酪氨酸微克数；4为4mL反应液取出1mL测定(即4倍)；10为纳地青霉产生的蛋白酶与酪蛋白反应时间；W为菌悬液水分百分含量。由福林法测得，高产蛋白酶诱变纳地青霉菌株蛋白酶活力为135800u/g干基，显著高于原始纳地青霉菌株蛋白酶活力84610u/g干基。实施例2：高产蛋白酶诱变纳地青霉菌株制备发酵剂干粉制剂将高产蛋白酶诱变纳地青霉菌株接入到液体培养基(配方为硝酸钠3.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30.0g，蒸馏水1000mL，pH7.3，121℃，0.1MPa灭菌15min)中，置于摇床中，28℃培养4d，无菌条件下导入玻璃安瓶，液面高度为1.0cm，加盖瓶塞后将玻璃安瓶放入冻干机冷冻干燥，得到高产蛋白酶纳地青霉发酵剂干粉制剂。发酵剂干粉制剂密封保存。该方法制得的发酵剂干粉制剂为高效浓缩发酵剂，含有较多活菌丝体和孢子，蛋白酶量更高，蛋白酶活力显著增强，且使用方便，发酵时用量更少。实施例3高产蛋白酶诱变纳地青霉发酵鸡胗产品用料理机将鸡胗斩为糜状，取30g鸡胗糜置于10cm培养皿中，均匀摊成饼状，在121℃，0.1MPa灭菌15min。取2mL由发酵剂干粉制剂活化的高产蛋白酶诱变纳地青霉菌悬液(108cfu/mL)均匀接种于灭菌后的鸡胗糜表面，对照组接种2mL原始纳地青霉菌悬液(108cfu/mL)，置于28℃培养箱中培养4d后，无菌条件下转移至密闭玻璃瓶中，置于32℃培养箱中后发酵14d，得到发酵鸡胗产品。挑取培养4d鸡胗糜表面的纳地青霉制备菌悬液(108cfu/mL)，通过福林法测定鸡胗糜表面纳地青霉菌株蛋白酶活力。采用TPA二次下压法，利用物性分析仪(购于英国StableMicroSystems公司)测定高产蛋白酶诱变纳地青霉、原始纳地青霉发酵鸡胗产品的硬度(g)、粘性(g·s)。具体参数：探头型号为P/0.5R柱状，以1.0mm/s速度进入测试发酵鸡胗样品，再恢复至初位，下压距离5mm。测定结果如表1。表1高产蛋白酶诱变纳地青霉和原始纳地青霉发酵鸡胗产品硬度、粘性(n＝3)结果表明，培养4d鸡胗糜表面高产蛋白酶诱变纳地青霉菌株蛋白酶活力为140500u/g干基，显著高于原始纳地青霉菌株蛋白酶活力83600u/g干基(P＜0.05)。因此，高产蛋白酶诱变纳地青霉菌株应用于发酵时，蛋白酶活力仍保持在较高水平；高产蛋白酶诱变纳地青霉发酵鸡胗产品比原始纳地青霉发酵鸡胗产品的硬度小，粘性大，说明高产蛋白酶诱变纳地青霉产蛋白酶能力更强，对鸡胗蛋白质的降解程度更大，能够显著改善产品质构。因此，高产蛋白酶诱变纳地青霉比原始纳地青霉更适于鸡胗等原料发酵。当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3