专利名称：植物细胞培养期间改变培养基温度来大量生产紫杉醇的方法
背景技术：
发明领域本发明涉及一种大量生产植物细胞培养次级代谢物——紫杉醇的方法。
现有技术描述紫杉醇是一种从美国太平洋红豆杉(Taxus brevifolia)树皮中提取的紫杉烷类化合物，它可有效治疗癌症，如白血病。据报道紫杉醇通过抑制微管解聚分别可治愈30％、50％和20％的卵巢癌，乳腺癌和肺癌。通常情况下，可通过化学全合成，利用前体如巴卡亭进行半合成，从红豆杉属植物中直接提取紫杉醇或培养产生紫杉醇的细胞等方法生产紫杉醇。在这些方法中，通过植物细胞培养来生产紫杉醇的方法具有以下优点。首先，生产可连续进行而不必考虑由于枯萎、有害昆虫或自然灾害造成杉树供应的波动。第二，细胞培养可在大生物反应器中进行，通过控制培养条件可大量生产紫杉醇。第三，细胞培养法与其它方法相比所产生的化合物种类更为简单，从而大大简化了分离和提纯工作。第四，细胞培养法与其它方法相比对于快节奏的供求变化适应更快。第五，细胞培养法不仅可生产紫杉醇，而且还可生产出可转化为紫杉醇的紫杉烷前体如巴卡亭。
以下为本领域中已有的通过植物细胞培养生产紫杉醇的方法USP 5,019,504中公开了一种采用美国太平洋红豆杉培养细胞生产紫杉醇及其衍生物的方法。其中所描述的紫杉醇产量为1～3mg/L，生物体系倍增的时间为7-12天，这不足以供工业生产。而且紫杉醇的植物培养产量不稳定，甚至通过选择获得高产率母代细胞后，其子代培养仍难以保持该产率(E.R.M.Wickremesine等人，World Congress onCell and Tissue Culture(1992))。
WO 93/17121提供了一种通过红豆杉属植物细胞培养生产紫杉醇的方法，但改变了培养基的组成、生长速率和产率等。对于中国红豆杉(Taxus chinensis)，在18天的培养中可获得24.1mg/L的紫杉醇，每2.5天生物体系培增一次。
所有这些描述紫杉醇大量生产方法的专利均控制细胞培养温度为25℃；并且所述专利中对此未作说明，而且也已未预计当培养温度改变时生长速率和产率如何改变。
发明简述本发明的目的是提供一种方便和有效的、用于大量生产紫杉醇的方法。
本发明的另一目的是提供一种方便的生产紫杉醇的方法，其中通过控制植物细胞培养期间的温度可达到高产率。
本发明的又一目的是提供一种更为高产的生产紫杉醇的方法，其是通过接种可产生紫杉醇的高浓度的细胞株来进行。
附图简述以下描述和附图将使本发明的上述以及其它的目的及特征更为明晰，其中
图1显示温度对产生紫杉醇的细胞系——中国红豆杉SYG-1生长速率的影响。
图2显示中国红豆杉SYG-1培养期间温度改变对紫杉醇产量的影响。
图3显示温度改变的时间点对中国红豆杉SYG-1生长的影响发明详述本发明涉及一种在植物细胞培养期间通过改变温度增加紫杉醇产量水平的方法。更具体而言，本发明包括一种大量生产紫杉醇的方法，其是在红豆杉属植物细胞充分生长后通过改变培养基的培育温度来高产率地生产紫杉醇。
一般来说，植物中产生的次级代谢物是不影响其生长的。一些次级代谢物参与保护植物免受环境的影响。在植物细胞培养中，通过调节与植物防御机制有关的代谢可提高次级代谢物的产量。本发明开发了一种在细胞培养期间改变温度而最大化紫杉醇产量的方法。本发明还开发一种增加紫杉醇产量的方法，其中通过增加初始培养细胞的数量并调节细胞培养基中糖的浓度来达到目的，而糖浓度的调整是依据初始培养细胞的数量进行的，糖的初始浓度可影响代谢。
本发明的发明者们首先优化了细胞生长的温度，然后试图找出通过抑制细胞生长而增加紫杉醇产量的培养温度。为此，发明者们在最佳生长温度下培养红豆杉属植物细胞直至获得足量细胞，然后在另一温度下培养细胞以增加包括紫杉醇在内的次级代谢物的产量水平。
依据本发明，紫杉醇的生产包括以下步骤(ⅰ)在培养基中于约20至25℃、优选为约20至24℃下培养红豆杉属植物细胞；和(ⅱ)当植物细胞充分生长后，将培养温度变为约26至32℃、优选为约28至30℃并继续培养以生产紫杉醇。
依赖于植物细胞种类、培养温度、培养基组成及其它条件，细胞充分生长的时间点有变化。根据本发明的实施例，在开始培养l0天后、优选为14天或更优选为2l天后改变细胞培养温度。
根据本发明的方法，当细胞在一略低的温度下充分生长后，增加培养温度可增加紫杉醇产量。接种细胞后，需将温度转变为高于生长温度，为26至32℃、优选为28至30℃。认为转变后的温度最适于紫杉醇的生成或使参与紫杉醇生物合成的酶的活性最高。
本发明的方法不受限制地用于红豆杉属中的任何植物。例如本发明的方法可用于美国太平洋红豆杉、加拿大红豆杉(Taxus canadensis)、东北红豆杉(Taxus cuspidata)、浆果红豆杉(Taxus baccata)、Taxusglobosa、佛罗里达红豆杉(Taxus floridana)、西藏红豆杉(Taxuswallichiana)、Taxus x media和中国红豆杉。
本发明的植物细胞培养基为补充酪蛋白水解物的B5培养基(Gamborg等人，Exp.Cell Res.50:151-158(1968))。为增加紫杉醇产量水平，优选使用表1所示的优化B5培养基。此外，可在第5至30天内加入一种糖，优选为麦芽糖，至少添加一次，优选添加二次；一次在培养开始后第7至12天，而另一次在第18至24天，每次添加量为10至100g/L，优选为10至40g/L的单剂量。
表1红豆杉属植物细胞培养基组成 浓度(mg/L)无机盐无水CaCl2113.23
CoCl2·6H2O0.025CuSO4·5H2O0.025FeSO4·7H2O27.8H3BO33.0KI 0.75KNO32,500MgSO4·7H2O246MnSO4·H2O10NaH2PO4·H2O 150Na2MoO4·2H2O 0.25(NH4)2SO4134ZnSO4·7H2O2维生素肌醇 10烟酸 1戊糖酸钙0.874盐酸维生素B6 1维生素B20.015盐酸维生素B1 10激素萘乙酸盐10μ M苄基氨基嘌呤 0.2μM酪蛋白水解产物500AgNO31-15μM蔗糖 30,000
本发明的另一方法包括比正常值如每升4g干细胞更高浓度接种细胞的步骤。对于较高浓度下接种细胞，要求培养基中糖浓度也较正常值如糖用量为40g/L更高。
采用以下实施例进一步说明了本发明，这些实施例不应被认为是对本发明范围的限制。
实施例1培养温度对红豆杉属细胞的生长以及紫杉醇产量的影响在补充了500mg/L酪蛋白水解物的B5培养基中培养中国红豆杉Hu-1、中国红豆杉SYG-1(KCTC-0232BP)、浆果红豆杉、Taxus x media以及东北红豆杉培养物15天。将每种细胞培养物接种于含75ml表1所列培养基的250ml Erlenmeyer瓶中并于24℃培养20天。在21天时将培养温度变为29℃。在21天和42天时测量干细胞重及紫杉醇产量，结果列于表3中。
采用以下方法测量干细胞重。
首先将一5.5cm滤纸(No.541,Whatman Co.U.S.A)置于一装配有抽滤瓶的多孔滤斗中。在其上喷蒸馏水使滤纸完全贴于漏斗上。然后将5ml待分析植物细胞培养基铺展于滤纸上并于减压下除水。将抽滤过的滤纸置于一铝箔制成的盘中，并在炉中于80℃干燥24小时。经此步操作后，将滤纸从炉中取出并在室温下放置10分钟，然后称出铝箔盘和滤纸的总重。减去铝箔盘和滤纸的预先测定值后再乘以200即得出每升培养基中的干细胞重。
采用表2中HPLC条件定量分析紫杉醇产量。
表2紫杉醇的定量分析条件
表3温度改变对红豆杉属植物细胞生长及紫杉醇产量水平的影响
实施例2温度对植物细胞生长的影响将预先在补充了500mg/L酪蛋白水解物的B5培养基中培养15天的SYG-1细胞培养物接种于含75ml表1所列培养基的250mlErlenmeyer瓶中，于20℃、24℃、29℃、32℃和36℃培养20天。采用实施例1中的方法测量干细胞重以确定最佳生长温度。干细胞重的测量结果显示在图1中(-●-:20℃；-■-:24℃；-_-:29℃；-_-:32℃；-_-:36℃)。
从图1中可见在第13天时20℃、24℃、29℃、32℃和36℃所培养的植物细胞的干细胞重分别为8.23、12.3、6、4.5和3.8g/L。
实施例3植物细胞培养期间温度改变对细胞生长及紫杉醇产量水平的影响为测定细胞在24℃下充分生长后细胞继续生长时的温度改变，将植物细胞——中国红豆杉SYC-1在以下条件下继续生长(1)在培养期间培养基温度为24℃(以下为方便起见将其称为‘24℃对照组’)；(2)保持培养基温度为24℃直至第21天然后改变为29℃(24℃-29℃测试组)；(3)保持培养基温度为24℃直至第21天然后改变为32℃(24℃-32℃测试组)；(4)保持培养基温度为24℃直至第21天然后改变为20℃(24℃-20℃测试组)。测量干细胞重及紫杉醇的产量。
将在补充500mg/L酪蛋白水解物的B5培养基中预培养了14天的SYG-1细胞培养物接种于含75ml表1所列培养基的250ml Erlenmeyer瓶中，然后在24℃下培养。在7天时在每个烧瓶中加入10g/L麦芽糖继续培养。在21天时在每个烧瓶中加入20g/L麦芽糖，并将其中一个组的培养温度维持在24℃。对于其它组，将温度分别变为29℃(24℃-29℃测试组)、32℃(24℃-32℃测试组)和20℃(24℃-20℃测试组)继续培养。细胞培养完成后从每组中取出7ml培养物，采用实施例1中的方法测量干细胞重及紫杉醇的产量。结果显示在表4和图2中。(-●-:24℃对照组；-■-:24℃-29℃测试组；-_-:24℃-32℃测试组；-_-:24℃-20℃测试组)。24℃-29℃测试组具有最高的紫杉醇产量水平。
表4温度改变对生长的影响
实施例4温度改变时间点对生长及紫杉醇产量的影响如实施例3所述培养细胞，但改变温度改变的时间点以及培养温度。测量干细胞重及紫杉醇的产量。
采用实施例1中的方法测量在24℃下49天、在29℃下49天、从第8天为29℃、从第15天为29℃和从第22天为29℃培养时的干细胞重及紫杉醇的产量。结果显示在图3和表5中。
表5温度改变时间点对生长及紫杉醇产量的影响
实施例5高浓度下接种的作用测量高浓度下接种以及培养期间温度改变对细胞生长和紫杉醇产量水平的影响。在测试组1中，将SYG-1在补充了500mg/L酪蛋白水解物的B5培养基中培养14天，以1∶4的比例接种于表1的培养基中，并于24℃下培养14天，然后加入3％麦芽糖于24℃下继续培养。在测试组2中，所有条件与测试组1相同，只是在第14天后将培养温度改为29℃。在测试组3中，将细胞接种浓度加倍并在24℃下培养。在测试组4中，所有条件与测试组3相同，只是在第14天后将培养温度变为29℃。在第14天、第28天和第42天测量4个测试组的干细胞重和紫杉醇产量。结果列于表6和表7中。
表6在高浓度下接种时测试组的干细胞重(g/L)
表7在高浓度下接种时测试组的紫杉醇含量(mg/L)以及每克干细胞的产量水平(mg/g)
实施例6高浓度接种和高糖浓度的影响观测在高浓度细胞接种以及细胞培养期间温度改变和高糖浓度对细胞生长和紫杉醇产量水平的影响。在测试组1中，将SYG-1在补充了500mg/L酪蛋白水解物的B5培养基中培养14天，以1∶4的比例接种于表1的培养基中，并于24℃下培养14天，然后加入3％麦芽糖于24℃下继续培养。在测试组2中，初始培养基中含6％的麦芽糖，在培养期间不再补充麦芽糖。在测试组3中，所有条件与测试组1相同，只是将细胞接种浓度加倍。在测试组4中，所有条件与测试组3相同，只是在14天后将培养温度变为29℃。在第14天、第28天和第42天测量4个测试组的干细胞重和紫杉醇产量。结果列于表8和表9中。
表8在高浓度下接种时测试组的干细胞重(g/L)
表9在高浓度下接种时测试组的紫杉醇含量(mg/L)以及每克干细胞的产量水平(mg/g)
以上事实清楚地说明和证明了本发明提供了一种可供工业用的，有效的方法，用于高产率、大规模地生产紫杉醇。
权利要求
1.一种通过改变培养温度来大量生产紫杉醇的方法，其包括以下步骤(ⅰ)于约20至25℃下培养红豆杉属植物细胞；和(ⅱ)培养开始后，当植物细胞充分生长时，将培养温度变为约26至32℃并继续培养。
2.如权利要求1所述的大量生产紫杉醇的方法，其中，在培养开始后第10天或之后改变培养温度。
3.如权利要求1所述的大量生产紫杉醇的方法，其中，在培养开始后第5天至30天补充的10至100g/L的碳源至少添加一次。
4.如权利要求1所述的大量生产紫杉醇的方法，其中，在步骤(ⅰ)的接种中，以干重计红豆杉属植物细胞的浓度大于或等于4g/L。
5.如权利要求4所述的大量生产紫杉醇的方法，其中，步骤(ⅰ)中所述的培养在糖浓度大于40g/L的培养基进行。
全文摘要
本发明涉及一种生产紫杉醇的方法,其中在植物细胞培养期间通过改变温度增加紫杉醇的产量。依据本发明,紫杉醇的生产包括以下步骤:(i)在培养基中于约20至25℃下培养红豆杉属植物细胞;和(ii)当植物细胞充分生长后,将培养温度变为约26至32℃并继续培养。本发明还包括一种增加紫杉醇产量的方法,其中以高初始浓度接种细胞并增加培养基中糖浓度。依据本发明,可方便地大量生产紫杉醇,并因而具有工业应用价值。
文档编号C12P17/02GK1237210SQ98801232
公开日1999年12月1日 申请日期1998年6月25日 优先权日1997年6月26日
发明者崔豪埈, 崔亨均, 金尚翼, 尹晶焕, 孙朱宣, 张文硕, 崔圻修, 金泓乐, 洪承绪, 李贤秀 申请人:株式会社三养吉耐克斯