一种利用苯乙烯?异戊二烯?苯乙烯嵌段共聚物（sis）固定化微生物细胞的方法及应用
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，特别涉及一种利用苯乙烯?异戊二烯?苯乙烯嵌段共聚物（SIS）固定化微生物细胞的方法及应用。本发明以SIS为原料，通过环氧化反应制备改性SIS材料，以改性SIS为载体采用包埋法制备固定化细胞，并利用固定化细胞转化精氨酸为L?鸟氨酸。本发明工艺简单，固定化细胞寿命长，采用本发明生产L?鸟氨酸，转化液中L?鸟氨酸的含量为20?60g/l，精氨酸摩尔转化率可达到98.5%。
【专利说明】
一种利用苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物(SIS)固定化微生物细胞的方法及应用
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，涉及一种利用苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物(SIS)固定化微生物细胞的方法及应用。
【背景技术】
[0002]在苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯嵌段聚合物(SIS)是一种热塑性弹性体，可以作为亲肤性经皮给药机制，具有高弹性、高强度、无毒害的特点。又因其不易被微生物分解，用于固定化细胞，可以延长固定化细胞寿命。
[0003]L-鸟氨酸主要用于制备保肝、护肝、治疗肝病、抗疲劳、抗虚弱等各种复方氨基酸输液，并因其多功能的保健作用而引起世人的特别关注。目前各国市场上L-鸟氨酸的绝大部分市场份额被日本占据，其主要的生产厂家为味之素、田道制药和协和发酵等3家。国内有少数几家生产，且均采用化学法制备，生产规模均有待扩大，L-鸟氨酸的发酵法和酶法生产目前在国内尚处于实验室研究阶段，离工业化还有很长的路要走。鉴于L-鸟氨酸在国内外市场的供需状况及发展民族氨基酸产业的需要，微生物酶转化法生产鸟氨酸研究具有重大的经济意义和理论。
[0004]现有制备L-鸟氨酸的方法，主要有提取法，化学法，微生物发酵法和酶法。酶法是利用动植物或微生物体内的精氨酸酶作催化剂，水解精氨酸，生成鸟氨酸和尿素。酶法生产L-鸟氨酸专一性强，反应条件温和，避免采用氰化氢等有毒化学品，同时底物转化率高，产品较纯，有利于后续分离，焦庆才等通过固定化L-精氨酸酶生产L-鸟氨酸，转化率可以达到95%。张鹏等利用粪肠球菌体内的精氨酸酶转化生产L-鸟氨酸，最高产量达112 g/Ι，转化率达99.5%。专利CN 101691555 B中利用海藻酸钠固定化苏云金芽孢杆菌生产L-鸟氨酸，转化率达99.5%。以上方法虽然精氨酸转化率较高，但是得到的固定化细胞机械强度还有待提尚O
[0005]本发明以SIS为原料，通过环氧化反应制备改性SIS材料，以改性SIS为载体采用包埋法制备固定化细胞，并利用固定化细胞转化精氨酸为L-鸟氨酸。本发明工艺简单，固定化细胞寿命长，采用本发明生产L-鸟氨酸，转化液中L-鸟氨酸的含量为20-60g/l，精氨酸摩尔转化率可达到98.51%。
[0006]与公知技术相比，本发明具有以下优点:
(I)与其他培养方法相比，本发明所使用的方法采用的材料为高分子材料，具有高弹性、高强度、无毒害的特点。又因其不易被微生物分解，用于固定化细胞，可以延长固定化细胞寿命。
[0007](2)本发明所使用的固定化细胞连续生产L-鸟氨酸的方法减少了生产步骤，降低了成本，有利于工业化生产。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种新型的固定化材料苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物固定化微生物细胞，利用具有高精氨酸酶活性的苏云金芽孢杆菌，制备固定化细胞，并加入含有精氨酸的转化液中，以此获得L-鸟氨酸，实现L-鸟氨酸的连续生产，大大缩短了时间，降低了成本。
[0009]本发明方法包括以下几个步骤:
1、SIS的改性:配置15wt°/c^SIS甲苯溶液，室温搅拌20min，制备均匀反应溶液。在40 °C下加入1ml甲酸，搅拌0.5h。再缓慢加入1ml双氧水，反应结束后洗涤至中性，旋蒸除去甲苯。
[0010]2、发酵获得菌体:取原始菌株制备菌悬液，加入种子培养基中培养。种子液按2%接种量接种至发酵罐中，发酵罐中培养基装液量为有效容积的60%，培养温度32°C，罐压0.04MPa，搅拌速率300r/min，通气比1.5vvm，发酵20h，离心，得菌体。
[0011 ] 3、固定化细胞制备:在500C下迅速加入一定量菌体，充分搅拌均匀，降至室温，将细胞切成2_5mm的立方体，备用。
[0012]4、转化:将制备的固定化细胞投入含有精氨酸浓度为40-60g/L，pH保持在10.0-10.5，28-32°(:，160-180印111的条件下转化2411，离心后取上清液，使用茚三酮显色法即得转化液中L-鸟氨酸含量。
[0013]
具体实施例
[0014]下面结合具体实例进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。下述实施例中的方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0015]实施例1
利用本发明中所述方法，生产L-鸟氨酸的操作工艺如下:
1、种子液培养
取原始菌种制备成菌悬液，液体培养基组成为:葡萄糖20g/L，胰蛋白胨12g/L，K2HPO41.5g/L，MgS04.7H20 0.5g/L,KH2PO4 0.5g/L，35°C，170rpm条件下培养24h备用。
[0016]2、发酵培养
将种子液按2%的接种量接种至发酵罐中，罐中培养基装液量为有效容积I的60%，在320C，搅拌速率300r/min，通气比1.5vvm，罐压0.04MPa条件下发酵20h。发酵液于4000rpm下离心，得菌体。
[0017]3、固定化载体制备
配置15wt°/c^ SIS甲苯溶液，室温下搅拌20min，在40 °C下加入I Oml甲酸，搅拌0.5h，再缓慢加入1ml双氧水，使反应充分。反应结束后洗涤至中性，加热旋蒸除去甲苯，将至室温，加入无水乙醇得白色胶装物质。
[0018]4、固定化细胞制备
将上一步获得的固定化载体加热至50°C，加入5g菌体，充分搅拌、冷却后得固定化细胞，裁剪成边长为2.5mm大小的块状，备用。
[0019]5、固定化细胞制备
将固定化细胞投入含有精氨酸浓度为50g/L，pH保持在10.2的转化液中，在30 °C，170r/min的条件下转化24h，离心后取上清液，使用茚三酮显色法测得转化液中精氨酸摩尔转化率为98.5%。
[0020]
实施例2
利用本发明中所述方法，生产L-鸟氨酸的操作工艺如下:
1、种子液培养
取原始菌种制备成菌悬液，液体培养基组成为:葡萄糖20g/L，胰蛋白胨12g/L，K2HPO41.5g/L，MgS04.7H20 0.5g/L,KH2PO4 0.5g/L，35°C，170rpm条件下培养24h备用。
[0021]2、发酵培养
将种子液按2%的接种量接种至发酵罐中，罐中培养基装液量为有效容积I的60%，在320C，搅拌速率300r/min，通气比1.5vvm，罐压0.04MPa条件下发酵20h。发酵液于4000rpm下离心，得菌体。
[0022]3、固定化载体制备
配置20wt°/c^ SIS甲苯溶液，室温下搅拌20min，在40 °C下加入I Oml甲酸，搅拌0.5h，再缓慢加入1ml双氧水，使反应充分。反应结束后洗涤至中性，加热旋蒸除去甲苯，将至室温，加入无水乙醇得白色胶装物质。
[0023]4、固定化细胞制备
将上一步获得的固定化载体加热至500C，加入1g菌体，充分搅拌、冷却后得固定化细胞，裁剪成边长为3mm大小的块状，备用。
[0024]5、固定化细胞制备
将固定化细胞投入含有精氨酸浓度为50g/L，pH保持在10.2的转化液中，在30 °C，170r/min的条件下转化24h，离心后取上清液，使用茚三酮显色法测得转化液中精氨酸摩尔转化率为96.32%。
[0025]
实施例3
利用本发明中所述方法，生产L-鸟氨酸的操作工艺如下:
1、种子液培养
取原始菌种制备成菌悬液，液体培养基组成为:葡萄糖20g/L，胰蛋白胨12g/L，K2HPO41.5g/L,MgS04-7H20 0.5g/L,KH2PO4 0.5g/L，35°C，170rpm条件下培养24h备用。
[0026]2、发酵培养
将种子液按2%的接种量接种至发酵罐中，罐中培养基装液量为有效容积I的60%，在320C，搅拌速率300r/min，通气比1.5vvm，罐压0.04MPa条件下发酵20h。发酵液于4000rpm下离心，得菌体。
[0027]3、固定化载体制备
配置15wt°/c^ SIS甲苯溶液，室温下搅拌20min，在40 °C下加入15ml甲酸，搅拌0.5h，再缓慢加入15ml双氧水，使反应充分。反应结束后洗涤至中性，加热旋蒸除去甲苯，将至室温，加入无水乙醇得白色胶装物质。
[0028]4、固定化细胞制备
将上一步获得的固定化载体加热至500C，加入1g菌体，充分搅拌、冷却后得固定化细胞，裁剪成边长为4mm大小的块状，备用。
[0029]5、转化
将固定化细胞投入含有精氨酸浓度为50g/L，pH保持在10.2的转化液中，在30 °C，170r/min的条件下转化24h，离心后取上清液，使用茚三酮显色法测得转化液中精氨酸摩尔转化率为95.63%。
【主权项】
1.本发明提供了一种利用苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物(SIS)固定化微生物细胞的方法及应用，其特征在于，包括: (1)将SIS环氧化得到改性的SI S材料； (2)将菌种制备成菌悬液，接入至液体培养基中培养，得种子液;接入发酵罐中，进行发酵培养，发酵结束离心得到菌体； (3 )菌体与改性的SI S共混、冷却、成型，得到固定化细胞； (4)利用固定化细胞转化精氨酸为L-鸟氨酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，固定化载体为苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物(SIS)环氧化改性材料。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，改性SIS与菌体共混比例为1-10:1，冷却后切割成边长为2-5mm的立方体。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，固定化细胞为苏云金芽孢杆菌，转化条件为精氨酸含量40-60g/L，pH10.0-10.5，28-32 °C，160_180rpm，24h ；最终得转化率达98.5%。
【文档编号】C12N11/08GK106086100SQ201610558826
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月17日
【发明人】张鹏, 刘玉龙, 陈毅明, 侯玉庆, 刘彦宏
【申请人】北京化工大学