专利名称：特异性胰脂酶抑制剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及特异性胰脂酶抑制剂及其在治疗和预防心血管疾病、高脂血症和肥胖症中的应用，以及作为诊断试剂和在甘油三酯的控制脂解方法中作为调控因子的应用。
食物脂肪是人体有效的能量来源。确实，来自脂类代谢的能量明显大于来自碳水化合物或蛋白质代谢的能量。然而，如果基本所有被摄入的脂类都被身体吸收了，食物脂类过量能引起重要的健康紊乱心血管疾病、高脂血症和肥胖症等。
这些疾病在工业化国家中常会遇到，那里的人们常食用含有过量饱和脂肪的食物。
为了防止这些致病，注意限制摄入脂肪类物质的饮食是必要的。但这不总是足够的。实际上，有些脂类物质容易察觉出来并从食物中去掉(黄油、油类等等)，而结合到食物里去的那些脂仿类物质(肉，奶制品等)就并非如此。
在证明注意食谱不是很有效的情况下，有人提出药物治疗。目前大多数药物治疗特别着眼于通过使用胆固醇合成抑制剂来战胜高脂血症。
但是，目前的研究越来越集中在能更普遍地抑制脂肪分解活性的产物上。
以这种观点，特别加以研究的一个方向就是对胰脂酶的抑制作用。胰脂酶是消化饮食中甘油三酯的一个关键性酶。甘油三酯是脂肪的主要成分(约占95％)，它的消化通过十二指肠前来源的脂酶(人是胃脂酶)起始于上消化道，但主要在胰脂酶作用下在肠内进行。这种胰脂酶能把甘油三酯转变为游离脂肪酸和α-单油酸甘油酯这些极性更强的水解产物。掺入胆盐和磷脂的混合微胶粒(micelles)中后，它们就能穿过肠细胞刷状缘膜。
因此，胰脂酶在因过量脂类而出现的如心血管疾病、高脂血症和肥胖症等疾病中起一定作用，它使得基本所用摄入的甘油三酯都被吸收了。此外，它还促进肠道对胆固醇的吸收，因为胆固醇在高脂肪酸的混合微胶粒中溶解度增加了。
胰脂酶的作用包括几个阶段在有胆盐和辅脂酶(colipase)存在下，脂酶吸附到脂类界面上。辅脂酶的作用就是将胰脂酶锚定到脂类界面上(C.Chapus等，FEBS Letters，1975，58，1，155-158)。随后水解甘油三酯的sn-1，3酯键。
这样，甘油三酯的消化包括由脂类界面调节的脂酶和辅脂酶的相互作用。
例如，猪的脂酶是一种含有449个氨基酸的糖蛋白，聚糖链连接在166位的天冬酰胺(Asn)上。猪脂酶含有两个被Phe336-Ala337键隔开的功能区(M.Bousset-Risso等，FEBS Letters，1985，182，2，323-326)。每个功能区都带有一个识别位点，即水解本身之界面识别位点(N-末端功能区)和其蛋白配体辅脂酶的识位点(C-末端功能区)。带有脂酶活性中心的N-末端功能区(残基1-335)，被一个对蛋白质水解很有抗性的较窄的区域与C-末端功能区(残基336-449)分开。这样构成的两个功能区是与上述两个特异性功能相对应的即N-末端功能区是负责催化作用，而C-末端功能区是参与辅脂酶的识别作用的(A.Abousalham等，蛋白质工程(Protein Engineering)，1992，5，1，105-111)。
辅脂酶是一种因有5个二硫键而高度交联的小分子多肽(10kDa)。它有3个对其功能很重要的识别位点，即一个界面识别位点(H.VanTibbeurgh等，自然(Nature)，1993，362，814-820)，一个脂酶识别位点(C.Chaillan等，FEBS Letters，1989，257，2，443-446；H.Van Tibbeurgh等，自然，1992，359，159-162)和一个微胶粒的识别位点(J.Hermoso等，EMBO J.，1997，16，18，5531-5336)。这三个识别位点空间结构(拓扑学)是不同的。
由于有多年的广泛研究，使人们有可能对胰脂酶/辅脂酶系统中的结构与功能之间的关系有更深了解(C.Claillan等，1989，同上)。
对人脂酶(Winkler.F.K.等，自然，1990，343，771-774)和马脂酶(B.Kerfelec等，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)，1992，206，279-287；Y.Bourne等，分子生物学杂志(J.Mol，Biol.)，1994，238，709-732)的进一步结构研究，使人们可能证实在不同来源的脂酶中都有上述两种功能区。
脂酶和辅脂酶之间的识别特别涉及疏水性相互作用(N.Mahe-Gouhier等，BBA.1998，962，91-97)和静电相互作用。
胰脂酶和辅脂酶两者的共价连接试验(C.Chaillan等，1989，同上)以及脂酶和辅脂酶复合物在3.1埃水平的三维结构解析(H.VanTibbeurgh等，19992，同上)导致液相中鉴定了这两种分子上的识别区。
为了抑制胰脂酶活性进而达到治疗高脂血症和肥胖症的作用，人们曾提出过许多方法-使用能结合到此酶活性中心上的共价抑制物，例如可已提到四氢制胰脂菌素(THL)[美国专利4 598 089；P.Hadvary等，生物化学杂志(J.Biol.Chemistry)1991，266，4，2021-2027；D.Hermier等，FEBSLetters，1991，286，1，186-188〕；按1摩尔THL/摩尔酶的剂量(P.Hadvary等，1991，同上)或每天二次10到400mg的剂量(J.Hauptman等，美国临床营养学杂志(Am.J.Clin.Nutr.)，1992，55，309s-313s)完全抑制了脂肪分解活性；这种方法有一些缺点，主要的一个就是缺乏特异性；THL对胰脂酶确实不特异，也能抑制其他脂酶诸如羧酸酯脂酶、胃脂酶以及人奶中由胆盐刺激产生的脂酶等。
-通过加入两亲性蛋白质(Gargouri Y.等，生物化学杂志，1985，260，2268-2273)、去污剂(Gargouri Y.等，脂类研究杂志(J.Lip.Res.)，1983，24，1336-1342)或纤维(Borel P.等，美国临床营养学杂志，1989，49，1192-1202)来修饰界面的特性。这种方法效力很有限。
此外，上述这两种方法都有明显的不良反应(恶心等)。
因此，本申请人的目标是提供一种新型的胰脂酶抑制剂，它比现有脂酶抑制剂更适宜实际应用，特别是对胰脂酶的作用表现出真正的特异性。
本发明的主题是一种用作药物，特别是用于治疗高脂血症、心血管疾病和肥胖症的由包括辅脂酶识别位点的胰脂酶C-末端片段组成的肽(以下称为C-末端肽)。
根据本发明的一种有利的实施方案，所述肽是选自纯化的或重组的人、猪或马胰脂酶的一种胰脂酶的C-末端片段。
出人意外的是，这些不同胰脂酶的C-末端肽能有效地作为诱饵，并见；建立这种多肽与天然脂酶之间对辅脂酶的竞争，从而明显降低了上述脂酶的脂类分解作用。
服用这种多肽可降低胰脂酶的作用，并意外地至少是部分地抑制饮食中甘油三酯的水解，这样它就不被吸收了(C-末端多肽对脂解的抑制作用)。
实际上在体外，这种C-末端肽的亲和性-在溶液中对辅脂酶亲和性是106M数量级，-在脂类界面上C-末端肽的亲和性为2×108M数量级。
要得到理想的活性，即在界面上亲和性为2×108M数量级，所述C-末端肽的剂量优选为每天0.5到10mg，分1-3次服用，相应于每次0.2-10mg的剂量。
本发明的主题也在于一种含有如上所定义的包括辅脂酶识别位点的胰脂酶C-末端多肽及至少一种药用载体的药物组合物。
上述药物组合物有利地制成可口服给药的单位形式，选自软明胶胶囊、硬明胶胶囊、片剂、溶液、悬液和乳液。
这种药物组合物优选用于口服给药的胃耐受形式。
本发明的主题还在于所述胰脂酶C-末端多肽的其他应用，例如作为诊断试剂，特别是在用竞争法进行脂酶活性测定的免疫酶学试验和在进行甘油三酯底物的控制性脂肪分解方法中。
除前述特征外，本发明还含有从随后的描述可以看出的其他特征，其中参考本发明的具体实施例以及附图，其中-
图1和图2表示由差示光谱得到的Scatchard图〔(辅脂酶-C-末端多肽)-C-末端多肽〕。图1是在水相中，图2是存在三丁酸甘油脂/水界面。
-图3和图4表示脂酶C-末端多肽对脂酶活性的抑制作用(底物三油酸甘油酯、磷脂、总胆盐)，图3是无油酸，图4是有油酸。
但是，应清楚这些实例仅用于说明本发明的主题，而不对其构成任何限制。
实施例1猪C-末端多肽的分离-胰脂酶和辅脂酶的纯化按Rovery M.等人(生物化学生物物理学学报，1978，525，373-379)介绍的方法，从丙酮处理的胰粉中纯化猪胰脂酶。
猪胰辅脂酶的纯化按C.Chapus等人(欧洲生物化学杂志，1982，115，99-105)的方法进行。
分别用6.65×104M-1cm-1和0.4×104M-1cm-1分子吸收系数，在波长280nm处测定胰脂酶和辅脂酶的蛋白浓度。
-猪胰脂酶C-末端多肽的生产、纯化和分析将100mg猪胰脂酶溶解在含有1mM苯甲脒的20ml 60mM碳酸氢铵pH8.5的缓冲液中，加入1mg TLCK(甲苯磺酰基-赖氨酸-氯甲基酮)处理的胰凝乳蛋白酶，混合物在37℃保温18小时。在不同时间里收集样品，用SDS-PAGE电泳分析并检测它们的脂酶活性。
通过加入0.2mM PMSF(苯甲基磺酰基氟)来终止胰凝乳蛋白酶的酶解作用。
酶消化过的混合物加到Ultrogel AcA54柱上(2.5×200mm)过分子筛，用含有0.2M NaCl和1mM苯甲脒的10mM Tris-HCl pH7.5缓冲液平衡，用相同缓冲液进行洗脱。
样品水解24小时后，用自动分析仪(Beckman 6300型)，在含有6M三蒸盐酸的封闭管中进行氨基酸分析。按Edman的方法，用测序仪(Applied Biosystems 470A型)，通过降解得到脂酶C-末端多肽的N-末端序列。用高压液相色谱(HPLC)(C18柱，Brownlee，5μm，2.1×2200mm)对得到的苯基硫代乙内酰脲作了分析。它们是用5mM醋酸钠pH4.84的缓冲液中的甲醇梯度(10～46％)洗脱出来的。
按照LaemmLi U.K.的方法(自然，1970，227，680-685)对得到的片段进行凝胶电泳(SDS-PAGE)。用考马斯兰(Coomassiebrillant blue)对蛋白质和多肽片段进行染色。用乙醇∶醋酸∶水的混合液(体积比为5∶7.5∶87.5)对凝胶进行脱色。
把经蛋白酶酶解的多肽以双份上样到18％的聚丙烯酶胺凝胶中，并在SDS存在下电泳分离这些多肽。
转移到PVDF(聚亚乙烯二氟)膜上后，对一个泳道染色以定出C-末端多肽的位置，另一泳道被切出以便测序用。
对分离、纯化的C-末端多肽的SDS-PAGE凝胶电泳分析及其氨基酸分析表明，这种多肽具有预期的分子量和氨基酸组合物(见N.Mahe-Gouhier等人，1988，同上；M.Bousset-Risso等，1985，同上)。这个多肽链N-末端部分测序结果显示如下序列Ala-Arg-Trp-Arg-Tyr-Lys-Val-Ser，这清楚的表明胰凝乳蛋白酶的酶解位点是在Phe336-Ala337键上，这个键是胰脂酶C-末端和N-末端功能区的接连处。
实施例2在水相中，猪脂酶C-末端多肽和辅脂酶相互作用的验证用分光荧光法对水性介质中(无脂类界面)的C-末端功能区和辅脂酶的相互作用进行了测定。
C-末端多肽的荧光发射光谱用配有一个恒温池和一个磁力搅拌系统的Kontron分光荧光计(SFM235)记录。这台分光荧光计与计算机(Apple IIe)相连。
所有实验均在25℃和pH7.5下进行。选择的激发波长为290nm，因为猪胰辅脂酶不含色氨基酸残基，当脂酶C-末端多肽和辅脂酶相互作用了，则荧光发射上的变化就是由脂酶C-末端上的色氨酸引起的。
在含有0.1M NaCl的10mM Tris-HCl pH7.5缓冲液中，在300和400nm之间测定终农度为0.26×10-6M的C-末端多肽的荧光发射光谱。用相同的缓冲液配制辅脂酶贮存液，辅脂酶的浓度从2.8×10-8到1.4×10-6M不等。
用下列Scatehard公式确定解离常数LbLf=nPoKd-LbKd]]>其中Lb和Lf为平衡状态下结合的辅脂酶和游离的辅脂酶浓度，Po是C-末端多肽的总浓度，Kd为解离数常。
-结果差示光谱〔(辅脂酶-C-末端多肽)-C-末端多肽〕显示荧光发射的减少。从这些光谱中得出的Scatchard图可以用于评价在上述特定条件下辅脂酶/C-末端多肽在10-6M溶液中的解离常数(图1)。
在图1中，x-轴表示结合的C-末端多肽的数量〔辅脂酶/C-末端肽复合物(TC)〕，y-轴表示结合的C-末端多肽/游离的C-末端多肽的比值〔辅脂酶/C-末端肽复合物(TC)与游离C-末端肽(C)的比值(TC/T)〕。
实施例3猪脂酶C-末端功能区和辅脂酶的相互作用及其在界面上(底物为三丁酸甘油酯)于体外对脂酶活性的抑制作用的验证-在有界面情况下，测定脂酶C-末端多肽抑制脂酶和辅脂酶活性的条件。
用滴定法，在25℃下于含有终浓度为1mM的牛磺脱氧胆酸钠(NaTDC)和0.1M NaCl、5mM CaCl2的1mM Tris-HCl pH7.5缓冲液组成的介质中测定脂酶的活性。
辅脂酶活性是在除NaTDC浓度改为4mM外的相同条件下测定的。
终体积为15ml，所用底物是乳化过的三丁酸甘油酯，终浓度为0.11M。
在有、无递增量C-末端多肽(10-6M)贮存液的情况下测定了这些活性。
-脂酶C-末端多肽对脂酶活性的抑制作用脂酶和辅脂酶摩尔比率等于1，脂酶和辅脂酶的终浓度是0.19×10-9MC-末端多肽浓度从0.2×10-9到30×10-9M不等。
在这样的条件下记录的脂酶活性最大抑制率约为50％。
-脂酶C-末端多肽对辅脂酶活性的抑制作用脂酶和辅脂酶摩尔比率等于0.75(脂酶是0.19×10-9M，辅脂酶是0.25×10-9M)。C-末端多肽浓度同上述不等。记录的辅脂酶活性的最大抑制率也是50％。由Scatchard图解中计算的解离常数为2×10-8M(图2)。
这些结果表明，在溶液中辅脂酶对C-末端肽的亲和性与辅脂酶对脂酶的亲和性处于相同数量级，在有三丁酸甘油脂/水界面时，这种亲和性可提高50到100倍。
实施例4脂酶C-末端功能区在有脂类界面时与辅脂酶的相互作用的验证体外C-末端功能区对脂酶活性的抑制作用(生理性底物乳化的三油酸甘油脂)在比实施例3更为生理性的脂类界面存在下，进行了C-末端功能区对脂酶的抑制作用的动力学研究，所用的底物是乳化的三油酸甘油酯。
借助pH计，在脂酶的活性严格依赖于辅脂酶存在的条件下，用滴定法在25℃时测定了脂酶对三油酸甘油酯乳液的活性。
反应介质(15ml)含有-8mM三油酸甘油酯-4mM牛磺脱氧胆酸钠-1mM Tris-HCl，pH7.5，5mM CaCl2，0.1M NaCl。
用天然的脂酶和辅脂酶与由蛋白质分解得到的C-末端功能区进行竞争性试验。
C-末端功能区对脂酶活性的抑制作用脂酶和辅脂酶的终浓度分别为1.7×10-9M和1.4×10-9M。
脂酶和辅脂酶摩尔比率等于1.2，C-末端功能区浓度等于2×10-7M，观察到的最大抑制率约为50％。
实施例5猪脂酶C-末端功能区与辅脂酶相互作用以及在体外有界面存在时在更生理性条件下的脂酶抑制作用的验证(底物三油酸甘油酯，磷脂和总胆盐)-按实施例3中介绍的方法，测定脂酶C-末端多肽对脂酶活性的抑制作用，但所用的底物是由磷脂(三油酸甘油酯和卵磷脂比率为20)和总胆盐(6mM)混合物存在下的长链甘油三酯(10mM三油酸甘油酯)的乳液组成，图3是没有油酸时，图4是有5mM油酸时。油酸是脂类分解产物。当食物团到达十二脂肠时，部分食物甘油三酯被水解，在十二指肠中出现长链脂肪酸(如油酸)。这些游离脂肪酸就与胆泌物结合，它们也部分出现在脂类界面上。可见，它们在脂类分解中起一定的作用。
-结果不论在什么情况下，2×10-7M的C-末端多肽都会使脂类分解被抑制50％，这表明在脂类界面存在时与无脂类界面存在时相比，C-末端功能区对辅脂酶的亲和性增加5倍(图1)。
如上所述，本发明完全不限于刚较清楚介绍过的实施方案、实施例和应用，正相反，它还包括本领域专家可能想到的各种方案而不脱离本发明的框架或范围。
权利要求
1.作为药物的由包括辅脂肪酶识别位点的胰脂酶C-末端片段组合物的肽。
2.根据权利要求1的肽，其特征是它相应于选自纯化的或重组的人、猪或马胰酯酶的胰酯酶的片段。
3.根据权利要求1或2的肽，它用以治疗高脂血症。
4.根据权利要求1或2的肽，它用以治疗肥胖症。
5.根据权利要求1或2的肽，它用以治疗心血管疾病。
6.含有权利要求1至5中任何一项的肽和至少一种药用载体的药物组合物。
7.根据权利要求6的药物组合物，其特征是所述肽的量在0.2到10mg之间。
8.根据权利要求6或7的药物组合物，其特征是它呈便于口服的单位形式，并选自软明胶胶囊、硬明胶胶囊、片剂、溶液、悬液和乳液。
9.根据权利要求8的药物组合物，其特征在于所述单位形式是胃耐受性的。
10.诊断试剂，其特征在于它是由权利要求1或2的肽组成。
11.甘油三酯底物的控制脂解方法，其特征在于它使用权利要求1或2的肽。
全文摘要
本发明涉及特异性胰脂酶抑制剂及其在治疗和预防心血管疾病、高脂血症和肥胖症中的应用,以及作为诊断试剂和在甘油三酯的控制脂解方法中作为调控因子的应用。所述抑制剂尤其为含有辅脂酶识别位点的胰脂酶C－末端片段组成的肽。
文档编号C12N9/20GK1248264SQ9880170
公开日2000年3月22日 申请日期1998年1月6日 优先权日1997年1月7日
发明者C·查普斯 申请人:拉法尔实验室(应用药学实验室)