具有改变的外壳蛋白的非哺乳动物dna病毒的制作方法

专利名称：：具有改变的外壳蛋白的非哺乳动物dna病毒的制作方法根据美国法典第35章第119条，本申请要求于1996年9月11日申请的美国序列号60/026,297的优先权。
背景技术：
：本发明涉及使用非哺乳动物DNA病毒在哺乳动物细胞中表达外源基因。在哺乳动物细胞中表达外源基因的现行方法包括使用哺乳动物病毒载体，例如那些源自反转录病毒、腺病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒或腺伴随病毒的载体。在哺乳动物细胞中表达外源基因的其它方法包括DNA直接注射、使用配体-DNA缀合物、使用腺病毒-配体-DNA缀合物、磷酸钙沉淀、和利用脂质体或聚阳离子-DNA复合物的方法。在一些情况下，脂质体或聚阳离子-DNA复合物可以将外源基因导向特定组织类型，例如肝组织。一般地，通过从已知感染哺乳动物细胞并在哺乳动物细胞中复制的病毒中除去不需要的特征，构建用于表达目的基因的病毒。例如，经常除去编码病毒结构蛋白和参与病毒复制的蛋白的基因以产生缺陷病毒，然后加入治疗基因。已使用该原理从诸如反转录病毒、腺病毒和疱疹病毒的许多类型的动物病毒产生基因治疗载体。该方法亦已用于辛德毕斯病毒，它是RNA病毒，一般感染蚊子，但是可以在人体中复制，导致疹和关节炎综合症。已使用非哺乳动物病毒在非哺乳动物细胞中表达外源基因。例如，已使用杆状病毒科的病毒(通常称为杆状病毒)在昆虫细胞中表达外源基因。研究最多的是苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)。尽管已描述了感染甲壳动物的一些杆状病毒种(Blissard，等，1990，Ann.Rev.Entomology35127)，但杆状病毒AcMNPV的正常宿主范围限于鳞翅目。已报道杆状病毒进入哺乳动物细胞(Volkman和Goldsmith，1983，Appl.andEnviron.Microbiol.451085-1093；CarbonellandMiller，1987，App.AndEnviron.Microbiol.531412-1417；Brusca等，1986，Intervirology26207-222；和Tjia等，1983，Virology125107-117)。尽管出现了一篇哺乳动物细胞中杆状病毒介导的基因表达的早期报道，但其作者后来将明显的报道基因活性归因于细胞与病毒较长期温育后，报道基因产物被带入细胞(Carbonell等，1985，J.Virol.56153-160；和Carbonell和Miller，1987，Appl.andEnviron.Microbiol.531412-1417)。这些作者报道，当所述外源基因做为杆状病毒基因组的一部分得以进入所述细胞时，所述外源基因没有再表达。后续的研究证实了哺乳动物细胞中杆状病毒介导的基因表达(Boyce和Bucher，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.932348-2352)。除杆状病毒科之外，其它的病毒科仅在无脊椎动物中繁殖；在表1中列出了一些这些病毒。目前正在研究基因治疗方法在治疗各种疾病方面的用途。绝大多数的基因治疗方法涉及提供外源基因以克服患者中基因表达的缺陷。其它基因治疗方法被设计为对抗疾病的效应。再有其它的基因治疗方法涉及提供反义核酸(例如，RNA)，以抑制宿主细胞基因(例如，癌基因)的表达或病原(例如，病毒)的基因表达。正在检查某些基因治疗方法纠正例如尿素循环的先天性错误的能力(参见，例如，Wilson等，1992，J.Biol.Chem.26711483-11489)。尿素循环是从机体排除氮废物的主要代谢途径。尿素循环的步骤基本上局限于肝脏，前二步发生在肝线粒体中。在第一步中，在一个反应中合成氨甲酰磷酸，该反应由氨甲酰磷酸合成酶I(CPS-I)催化。在第二步中，在由鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)催化的反应中形成瓜氨酸。然后瓜氨酸被运输至细胞质，与天冬氨酸一起由精氨琥珀酸合成酶(AS)缩合为精氨琥珀酸。在下一步骤中，精氨琥珀酸裂解酶(ASL)将精氨琥珀酸酶切产生精氨酸和延胡索酸。在该循环的最后一步，精氨酸酶将精氨酸转化为鸟氨酸和尿素。参与尿素循环的这五个酶中任何一个的缺陷都有显著的病理效应，例如昏睡、进食不良、精神发育迟缓、昏迷或新生儿期内死亡(参见，例如，Emery等，1990，载于医学遗传学的原理和实践，ChurchillLivingstone，NewYork)。OTC缺乏通常表现为新生儿期内致命的血氨过多性昏迷。AS缺乏导致瓜氨酸血，其特征是血液中瓜氨酸水平高。ASL缺乏导致精氨琥珀酸尿(ASA)，其导致各种病症，包括严重新生儿血氨过多和轻微精神发育迟缓。精氨酸酶缺乏导致血精氨酸过多，其可以表现为儿童早期的进行性痉挛和精神发育迟缓。目前使用的其它肝脏疾病的治疗法包括控制饮食；肝移植；和给予精氨酸游离碱、苯甲酸钠和/或苯乙酸钠。发明概述已发现可以使用携带外源基因表达构建物、或具有“改变的”外壳蛋白的非哺乳动物DNA病毒，增强所述非哺乳动物DNA病毒在哺乳动物细胞中表达外源基因的效率。例如，做为杆状病毒病毒颗粒表面的改变的外壳蛋白表达疱疹性口腔炎病毒糖蛋白G(VSV-G)，增强了所述杆状病毒在哺乳动物细胞中表达外源基因(例如，治疗基因)的能力。虽然没有责任去了解或公开本发明起作用的方式，并且不受任何理论限制，但推测基因表达的增强是由于病毒颗粒进入哺乳动物细胞细胞溶胶的能力增强。因此，在一个方面，本发明描绘了在哺乳动物细胞中表达外源基因的方法，包括(i)将具有改变的外壳蛋白的非哺乳动物DNA病毒导入所述细胞，该病毒的基因组携带在所述细胞中诱导外源基因表达的启动子控制下的外源基因，和(ii)在使得所述外源基因表达的条件下保持所述细胞。在第二个方面，本发明描绘治疗哺乳动物(例如，人或小鼠)中基因缺陷疾病的方法，涉及将治疗有效量的具有改变的外壳蛋白的非哺乳动物DNA病毒导入(体内或活体外)细胞，该病毒的基因组携带外源基因，并在使得所述外源基因在所述哺乳动物中表达的条件下保持所述细胞。本发明还描绘治疗哺乳动物中肿瘤的方法，涉及将具有改变的外壳蛋白的非哺乳动物DNA病毒(例如，杆状病毒)导入哺乳动物的癌性细胞(例如，癌性肝细胞)，该病毒的基因组表达癌症治疗基因(编码，例如，肿瘤坏死因子、胸苷激酶、白喉毒素嵌合体或胞苷脱氨酶)。所述外源基因可以在各种细胞中表达，例如，肝细胞；中枢神经系统细胞，包括诸如大脑、脊髓或外周神经的神经元；肾上腺髓质细胞；神经胶质细胞；皮肤细胞；脾细胞；肌肉细胞；肾细胞和膀胱细胞。因此，本发明可以用于治疗各种癌性或非癌性肿瘤，包括癌(例如，肝细胞癌)、肉瘤、神经胶质瘤和神经瘤。本发明包括治疗肺癌、乳腺癌和前列腺癌的方法。在本发明的这一方面，可以使用或者体内或者体外方法将所述病毒导入所述细胞。最好是，所述外源基因可操作地连接至在所述哺乳动物的癌性细胞中而不在其它细胞中有活性的启动子。例如，甲胎蛋白启动子在肝细胞癌和胎儿组织的细胞中有活性，而在成熟组织中无活性。因此，为治疗肝细胞癌，最好使用这种启动子表达癌症治疗基因。本发明亦描绘治疗哺乳动物中神经疾病(例如，帕金森病、早老性痴呆或由中枢神经系统损伤引起的疾病)的方法。所述方法包括(a)将治疗有效量的具有改变的外壳蛋白的非哺乳动物DNA病毒(例如，杆状病毒)导入细胞，该病毒的基因组包括编码治疗蛋白的外源基因，和(b)在使得所述外源基因在所述哺乳动物中表达的条件下保持所述细胞。特别有用的外源基因包括那些编码治疗蛋白的基因，所述治疗蛋白例如神经生长因子、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、酪氨酸羟化酶、多巴脱羧酶、大脑源神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子、sonichedeghog蛋白、胶质源神经营养因子(GDNF)和RETLI(亦称为GDNFα、GFR-1和TRN1)。神经元细胞和非神经元细胞(例如，成纤维细胞、成肌细胞和肾细胞)都可以用于本发明的这一方面。这类细胞可以是受治疗哺乳动物自体的或异源的。最好是，所述细胞是所述哺乳动物自体的，因为这种细胞排除了对移植排斥的担心。最好是，所述细胞是初级细胞，例如初级神经元细胞或初级成肌细胞。在本发明的每个方面，所述非哺乳动物DNA病毒均最好为“无脊椎动物病毒”(即，感染无脊椎动物并在无脊椎动物中复制的病毒)。例如，列于表1中的DNA病毒可以工程改造使其具有改变的外壳蛋白并用于本发明。最好是，所述无脊椎动物DNA病毒是杆状病毒，例如诸如苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒的核型多角体病毒。如果需要，可以工程改造所述核型多角体病毒，使得其缺失功能性多角体蛋白基因。可以使用病毒(例如，杆状病毒)的包含体型或芽生型之一或二者都用。另一优选的病毒是家蚕核型多角体病毒(BmNPV)。表1.可以用于本发明的非哺乳动物DNA病毒I.科杆状病毒杆状病毒科亚科包含体型杆状病毒EUBACULOVIRINAE属核型多角体病毒(NPV)多核壳病毒(MNPV)1这些病毒列于“国际病毒分类学委员会第五次报告”(ICTV)，CorneliabuchenOsmond，1991，ResearchSchoolofBiologicalSciences，Canberra，Australia。本文列出的大多数病毒可以从美国典型培养物保藏中心得到。)亚属优选种苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)核型多角体病毒(AcMNPV)其它成员云杉卷叶蛾(Choristoneurafumiferana)MNPV(CfMNPV)甘蓝夜蛾(Mamestrabrassicae)MNPV(MbMNPV)花旗松毒蛾(Orgyiapseudotsugata)MNPV(OpMNPV)和约400-500个从七个昆虫目和甲壳纲中分离的种亚属单核壳病毒(SNPV)优选种家蚕(Bombrxmori)S核型多角体病毒(BmNPV)其它成员美洲棉铃虫(Heliothiszea)SNPV(HzSnpv)甘兰尺蠖(Trichoplusiani)SNPV(TnSnpv)和从七个昆虫目和甲壳纲中分离的类似的病毒属颗粒症病毒(GV)优选种印度谷螟(Plodiainterpunctella)颗粒体病毒(PiGV)其它成员甘兰尺蠖颗粒体病毒(TnGV)甘兰菜粉蝶(Pierisbrassicae)颗粒体病毒(PbGV)菜粉蝶(Artogeiarapae)颗粒体病毒(ArGV)苹蠹蛾(Cydiapomonella)颗粒体病毒(CpGV)和鳞翅目的约50个种的类似病毒亚科非包含体型杆状病毒NUDIBACULOVIRINAE属非包含体型杆状病毒(NOB)优选种美洲棉铃虫NOB(HzNOB)其它成员榔二庞独角仙(Oryctesrhinoceros)病毒已在真菌(Strongwellseamagna)、蜘蛛和欧洲蟹(Carcinusmaenas)和蓝蟹(Callinesapidus)中观察到其它的病毒。II.科二十面体胞质型脱氧核糖核酸病毒虹彩病毒科属小虹彩虹彩病毒昆虫病毒群优选种稻螟虹彩病毒其它成员昆虫虹彩病毒1昆虫虹彩病毒2昆虫虹彩病毒6昆虫虹彩病毒9昆虫虹彩病毒10昆虫虹彩病毒16昆虫虹彩病毒17昆虫虹彩病毒18昆虫虹彩病毒19昆虫虹彩病毒20昆虫虹彩病毒21昆虫虹彩病毒22昆虫虹彩病毒23昆虫虹彩病毒24昆虫虹彩病毒25昆虫虹彩病毒26昆虫虹彩病毒27昆虫虹彩病毒28昆虫虹彩病毒29昆虫虹彩病毒30昆虫虹彩病毒31昆虫虹彩病毒32属大虹彩绿虹彩病毒昆虫病毒群优选种蚊虹彩病毒(虹彩病毒-3型，一般毒株)其它成员昆虫虹彩病毒3昆虫虹彩病毒4昆虫虹彩病毒5昆虫虹彩病毒7昆虫虹彩病毒8昆虫虹彩病毒11昆虫虹彩病毒12昆虫虹彩病毒13昆虫虹彩病毒14昆虫虹彩病毒15推定成员飞羽摇蚊虹彩属蛙病毒群蛙病毒优选种蛙病毒3(FV3)其它成员蛙病毒1蛙病毒2蛙病毒5蛙病毒6蛙病毒7蛙病毒8蛙病毒9蛙病毒10蛙病毒11蛙病毒12蛙病毒13蛙病毒14蛙病毒15蛙病毒16蛙病毒17蛙病毒18蛙病毒19蛙病毒20蛙病毒21蛙病毒22蛙病毒23蛙病毒24L2L4L5LT1LT2LT3LT4T21T6T7T8T9T10T11T12T13T14T15T16T17T18T19T20蝾螈蝌蚪水肿病毒牛蛙(Ranacatesbriana)蝌蚪水肿病毒非洲爪蟾属蝌蚪水肿病毒属淋巴囊肿病病毒群淋巴囊肿病病毒优选种川鲽(Flounder)分离物(LCDV-1)其它成员淋巴囊肿病病毒dab分离物(LCDV-2)推定成员真蛸病病毒属金鱼病毒群优选种金鱼病毒1(GFV-1)其它成员金鱼病毒2(GF-2)III.科细小病毒科属昆虫细小病毒群浓病毒属优选种大蜡螟(Galleria)浓病毒其它成员鹿眼(Junonia)浓病毒Agraulis浓病毒家蚕浓病毒伊蚊(Aedes)浓病毒推定成员艾奇塔浓病毒Simulium浓病毒Diatraea浓病毒切根虫(Euxoa)浓病毒Leucorrhinia浓病毒大蠊(Periplanata)浓病毒菜粉蝶(Pieris)浓病毒鞍背毛虫(Sibine)浓病毒PC84(Carcinusmediterraneus蟹细小样病毒)对虾(Penaeidshrimp)肝胰细小样病毒IV.科痘病毒组痘病毒科亚科脊椎动物痘病毒脊椎动物瘟病毒亚科属传染性软疣亚群Molluscipoxvirus优选种传染性软疣病毒亚科昆虫痘病毒昆虫痘病毒亚科推定属昆虫痘病毒属A鞘翅目痘病毒优选种金龟子(Melolontha)痘病毒其它成员鞘翅目大绿丽金龟(Anomalacuprea)塔斯马尼亚金龟(Aphodiustasmaniae)DemodemaboranensisDermolepidaalbohirtum甲虫(Figulussublaevis)Geotrupessylvaticus推定属昆虫痘病毒属B鳞翅目和直翅目痘病毒优选种桑灯蛾(Amasctamoorei)(鳞翅目)痘病毒其它成员鳞翅目Acrobasiszelleri卷叶蛾(Choristoneurabiennis)柳色卷蛾(Choristoneuraconflicta)异色卷蛾(Choristoneuradiversuma)Chorizagrotisauxiliaris冬尺蠖(Operophterabrumata)直翅目Arphiaconspersa蝗虫(Locustamigratoria)迁徙蚱蜢(Melanoplussanguinipes)OedaleussenugalensisSchistocercagregaria推定属昆虫痘病毒属C双翅目痘病毒优选种淡色摇蚊(Chironomusluridus)(双翅目)痘病毒其它成员双翅目埃及伊蚊(Aedesaegypti)Camptochironomustentans弱摇蚊(Chironomusattenuatus)飞羽摇蚊(Chironomusplumosus)摇蚊(Goeldichironomusholoprasimus)痘病毒科的其它成员信天翁痘(albatrosspox)(禽痘病毒属)科蒂亚埃姆布绒猴痘袋鼠痘(澳大利亚“奎欧卡”)黑尾鹿(Muledeer)痘病毒(哥伦比亚黑尾鹿；山羊痘病毒属)Volepox(Microtusoeconomus，Microtuspennsylvanicus)臭鼬(skunk)痘病毒(Mephitis；正痘病毒属)V.花椰菜花椰菜花叶病毒花叶病毒群优选成员花椰菜花叶病毒(CaMV)(cabbageb，davis分离物)其它成员乌饭树(Bluebeery)红环点(327)香石竹蚀环(182)大丽菊花叶(51)玄参花叶辣根潜伏(Horseradishlatene)紫茉莉花叶花生褪绿条死大豆褪绿斑点(331)草莓叶脉带(219)蓟斑点推定成员耧斗菜(Aquilegia)坏死花叶木薯叶脉花叶夜香树(Cestrum)病毒牵牛花脉明车前草病毒4苦苣菜斑点VI.群双病毒亚群I(即，属)玉米线条病毒优选成员玉米线条病毒(MSV)(133)其它成员虎尾草条纹花叶(221)马唐条斑Miscanthus条斑小麦矮缩推定成员Bajra条斑雀麦条纹花叶马唐条纹花叶燕麦褪绿条纹雀稗条点花叶亚群II(即，属)甜菜曲顶病毒优选成员甜菜曲顶病毒(BCTV)(210)其它成员番茄伪曲顶病毒夏季菜豆死病毒烟草黄矮病毒番茄卷叶病病毒亚群III(即，属)菜豆金色花叶病毒优选成员菜豆金色花叶病毒(BGMV)(192)其它成员苘麻花叶病毒非洲木薯花叶病毒棉花叶皱折病毒大戟花叶病毒双花扁豆(Horsegram)黄色花叶病毒印度木薯花叶病毒麻风树(Jatropha)花叶病毒利马豆金色花叶病毒锦葵属缺绿症病毒甜瓜缩叶病病毒绿豆黄色花叶病毒马铃薯黄色花叶病毒Rhynochosia花叶病毒南瓜缩叶病病毒Tigre病病毒烟草缩叶病病毒番茄金色花叶病毒番茄缩叶病病毒番茄黄矮病毒番茄黄色缩叶病病毒番茄黄色花叶病毒西瓜曲斑纹病毒西瓜褪绿矮化病毒忍冬黄叶脉花叶病毒推定成员棉花缩叶病病毒豇豆金色花叶病毒茄子黄色花叶病毒泽兰(Eupatorium)黄叶脉病毒白羽扇豆缩叶病病毒大豆皱叶病病毒茄顶缩叶病病毒隔蒴苘(Wissadula)花叶病毒VII.科dsDNA海藻病毒藻DNA病毒科属dsDNA蓝噬体藻DNA病毒群优选种Parameciumbursaria小球藻病毒-1(PBCV-1)以下的病毒Parameciumbursaria小球藻NC64A病毒(NC64A病毒)Parameciumbursaria小球藻Pbi病毒(Pbi病毒)Hydravirdis小球藻病毒(HVCV)其它成员小球藻NC64A病毒(37个NC64A病毒，包括PBCV-1)小球藻病毒NE-8D(CV-NE8D；异名NE-8D)CV-NYb1CV-CA4BCV-AL1ACV-NY2CCV-NC1DCV-NC1CCV-CA1ACV-CA2ACV-IL2ACV-IL2BCV-IL3ACV-IL3DCV-SC1ACV-SC1BCV-NC1ACV-NE8ACV-AL2CCV-MA1ECV-NY2FCV-CA1DCV-NC1BCV-NYs1CV-IL5-2s1CV-AL2ACV-MA1DCV-NY2BCV-CA4ACV-NY2ACV-XZ3ACV-SH6ACV-BJ2CCV-XZ6ECV-XZ4CCV-XZ5CCV-XZ4A小球藻Pbi病毒CVA-1CVB-1CVG-1CVM-1CVR-1Hydraviridis小球藻病毒HVCV-1HVCV-2HVCV-3VIII.科多DNA病毒组多DNA病毒科属Ichnovirus优选种Campoletissonorensis病毒(CsV-1)其它成员Glyptasp.的病毒属Bracovirus优选种Cotesiamelanoscela病毒(CmV)可以工程改造所述非哺乳动物DNA病毒的基因组，使其包括一个或多个遗传元件。一般地，这些元件的选择是基于它们促进(i)病毒颗粒表面上改变的外壳蛋白的表达和/或(ii)外源基因在哺乳动物细胞中表达的能力。可以使用与靶哺乳动物细胞结合、或介导膜融合以从内体逃逸的任何跨膜蛋白，做为所述非哺乳动物DNA病毒上改变的外壳蛋白。最好是，所述改变的外壳蛋白是天然介导病毒感染哺乳动物细胞的糖蛋白(例如，诸如慢病毒属、流感病毒、肝炎病毒或弹状病毒的哺乳动物病毒外壳蛋白)的多肽(最好为糖基化形式)。其它有用的改变的外壳蛋白包括与哺乳动物细胞上的受体结合并刺激胞吞作用的蛋白质。合适的改变的外壳蛋白的实例包括但不限于列于表2的外壳蛋白，它们源自诸如HIV、流感病毒、弹状病毒和人呼吸道病毒的病毒。典型的疱疹性口腔炎病毒糖蛋白G(VSV-G)由质粒BV-CZPG编码，其核苷酸序列示于图23。如果需要，可以使用多于一个的外壳蛋白做为改变的外壳蛋白。例如，第一个改变的外壳蛋白可以是与哺乳动物细胞结合的跨膜蛋白，第二个外壳蛋白可以介导膜融合和从内体逃逸。表2.合适的改变的外壳蛋白的实例aGenBank登记号指编码病毒外壳蛋白的核酸序列。在推荐实施方案中，将改变的外壳蛋白做为融合(即，嵌合)蛋白产生。特别有用的融合蛋白包括(i)跨膜多肽(例如，诸如IgM、IgG的抗体，和单链抗体)，其融合于(ii)与哺乳动物细胞结合的多肽(例如，VCAM、NCAM、整联蛋白和选择蛋白)或与生长因子结合的多肽。合适的跨膜多肽之中包括自然存在于非哺乳动物病毒或哺乳动物病毒颗粒表面的各种外壳蛋白(例如，杆状病毒gp64、流感血凝素蛋白和疱疹性口腔炎病毒糖蛋白G)。可以使用跨膜多肽的全部或其部分，只要所述多肽跨越该病毒颗粒的膜，使得所述多肽锚定于膜中。亦可以使用非病毒跨膜多肽。例如，可以将膜结合受体与结合哺乳动物细胞的多肽融合，并做为改变的的外壳蛋白使用。最好是，所述融合蛋白包括病毒外壳蛋白(例如，gp64)和导向分子(例如，VSV-G)。包括细胞粘着分子的全部或其细胞结合部分的融合多肽亦包括于本发明中(例如，gp64-VCAM融合蛋白)。一般地，将编码改变的外壳蛋白的基因可操作地连接至启动子，该启动子在欲用所述病毒感染的哺乳动物细胞中无活性，但在用于繁殖所述病毒的非哺乳动物细胞中有活性(即，“非哺乳动物活性”启动子)。与之相反，使用哺乳动物活性的启动子驱动目的外源基因(例如，治疗基因)的表达，如下所述。一般地，源自在非哺乳动物细胞中复制但在哺乳动物细胞中不复制的病毒的启动子，可以做为非哺乳动物活性启动子。例如，当使用杆状病毒做为非哺乳动物DNA病毒时，可以使用杆状病毒多角体蛋白启动子驱动改变的外壳蛋白的表达，因为杆状病毒在哺乳动物细胞中不复制。合适的非哺乳动物活性启动子的其它实例包括p10启动子、p35启动子、etl启动子和gp64启动子，它们在杆状病毒中均有活性。当使用昆虫细胞制备病毒贮液时，该非哺乳动物活性启动子使得所述改变的外壳蛋白能够在产生的病毒颗粒的表面表达。在用具有改变的外壳蛋白的非哺乳动物DNA病毒感染哺乳动物细胞时，所述多角体蛋白启动子无活性。用于驱动改变的外壳蛋白表达的合适的非哺乳动物活性启动子的实例，包括杆状病毒多角体蛋白启动子(例如，得自Pharmingen，Inc.的pAcAb4)、p10启动子(例如，得自Pharmingen，Inc.的pAcAb4)、p39启动子(参见Xu等，1995，J.Virol.692912-2917)、gp64启动子(包括TATA依赖性启动子；参见Kogan等，1995，J.Virol.691452-1461)、杆状病毒IE1启动子(参见Jarvis等，1996，Prot.Expr.Purif.8191-203)和果蝇属乙醇脱氢酶启动子(参见Heberlein等，1995，Cell41965-977)。如果需要，可操作地连接至编码改变的外壳蛋白基因的所述非哺乳动物活性启动子可以是诱导型启动子，该启动子在所述病毒繁殖的非哺乳动物细胞中被激活。合适的诱导型启动子的实例包括基于孕酮受体突变体的启动子(Wang等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.918180-8184)、四环素诱导型启动子(Gossen等，1995，Science2681766-1760；1992，Proc.Natl.Acad.Sci.895547-5551，可以从Clontech，Inc.得到)、纳巴霉素诱导型启动子(Rivera等，1996，Nat.Med.21028-1032)和蜕皮激素诱导型启动子(No等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.933346-3351)。原则上，在或者非哺乳动物细胞或者哺乳动物细胞中可以激活的诱导型启动子可以用于本发明的该实施方案，尽管实际上一般要将所述启动子的诱导物加入所述病毒繁殖的非哺乳动物细胞中，而不是加入所述外源基因表达的哺乳动物细胞中。做为一个实例，可以将编码一个改变的外壳蛋白的基因可操作地连接至可由蜕皮激素诱导的启动子(No等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.933346-3351)。在这种情况下，工程改造该非哺乳动物DNA病毒的基因组，使之包括一个成对的与编码所述改变的外壳蛋白的基因可操作地连接的蜕皮激素效应元件。在存在加入所述细胞的蜕皮激素(或蜕皮激素类似物)的情况下，异二聚体蜕皮激素受体的表达激活了来自与编码改变的外壳蛋白的基因可操作地连接的启动子的基因表达。使用诱导型启动子驱动编码改变的外壳蛋白的基因的表达，提供的优点是提供了控制改变的外壳蛋白表达的另一机制。可以工程改造非哺乳动物DNA病毒的基因组使之包括其它遗传元件，例如转座因子或反转录病毒(例如，劳斯肉瘤病毒)的长末端重复序列的哺乳动物活性启动子；腺伴随病毒和腺伴随rep基因的末端反向重复序列；和/或细胞永生化序列，诸如SV40T抗原或c-myc。如果需要，所述非哺乳动物DNA病毒的基因组可以包括在哺乳动物细胞中起作用的复制起点(例如，EB病毒(EBV)复制起点或哺乳动物复制起点)。哺乳动物复制起点的实例包括靠近二氢叶酸还原酶基因的序列(Burhans等，1990，Cell62955-965)、靠近β-珠蛋白的序列(Kitsberg等，1993，Cell366588-590)、靠近腺苷酸脱氨酶基因的序列(Carroll等，1993，Mol.Cell.Biol.132927-2981)、和其它人类序列(参见Krysan等，1989，Mol.Cell.Biol.91026-1033)。如果需要，所述复制起点可以与促进自主因子复制的因子联合使用，例如EBV的EBNA1基因。用于本发明的非哺乳动物DNA病毒的基因组可以包括多聚腺苷酸化信号和在哺乳动物细胞中起作用的RNA剪接信号(即，“哺乳动物RNA剪接信号)，所述信号为正确加工所述外源基因的产物而定位。另外，可以工程改造所述病毒，以编码正确导向所述基因产物的信号序列。将欲在哺乳动物细胞中表达的外源基因可操作地连接至“哺乳动物活性”启动子(即，指导在哺乳动物细胞中转录的启动子)。在需要细胞类型特异性表达所述外源基因的情况下，可以将病毒基因组中的所述外源基因可操作地连接至哺乳动物活性的细胞类型特异性启动子，例如对肝细胞、大脑细胞(例如，神经元细胞)、胶质细胞、许旺细胞、肺细胞、肾细胞、脾细胞、肌细胞或皮肤细胞特异性的启动子。例如，肝细胞特异性启动子可以包括编码白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、丙酮酸激酶、烯醇丙酮酸磷酸羧化酶、运铁蛋白、运甲状腺素蛋白、甲胎蛋白、α-血纤蛋白原或β-血纤蛋白原的基因的启动子。或者，可以使用肝炎病毒启动子(例如，甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎或丁型肝炎病毒启动子)。如果需要，可以将乙型肝炎病毒增强子与乙型肝炎病毒启动子联合使用。最好是，使用白蛋白启动子。当本发明用于表达治疗肝细胞癌的基因时，甲胎蛋白对驱动外源基因表达特别有用。其它优选的肝脏特异性启动子包括编码以下蛋白的基因的启动子低密度脂蛋白受体、α2-巨球蛋白、α1-抗胰凝乳蛋白酶、α2-HS糖蛋白、触珠蛋白、血浆铜蓝蛋白、纤溶酶原、补体蛋白(C1q、C1r、C2、C3、C4、C5、C6、C8、C9、补体因子I和因子H)、C3补体激活剂、β-脂蛋白和α1-酸性糖蛋白。为特异性地在神经元细胞中表达外源基因，可以使用神经元特异性烯醇化酶启动子(参见Forss-Petter等，1990，Neuron5187-197)。为在多巴胺能神经元中表达外源基因，可以使用酪氨酸羧化酶启动子。为在垂体细胞中表达，可以使用诸如POMC的垂体特异性启动子(Hammer等，1990，Mol.Endocrinol.41689-97)。一般地，与所述外源基因可操作地连接的启动子不同于与编码改变的外壳蛋白的基因可操作地连接的启动子。亦可以使用由外部刺激物诱导的启动子以驱动表达外源基因。这种启动子提供了在细胞培养物或哺乳动物体内的细胞中控制所述外源基因表达的方便手段。优选的诱导型启动子包括脑啡肽启动子(例如，人脑啡肽启动子)、金属硫蛋白启动子、小鼠乳腺瘤病毒启动子、基于孕酮受体突变体的启动子、四环素诱导型启动子、纳巴霉素诱导型启动子和蜕皮激素诱导型启动子。诱导来自每个这种启动子的基因表达的方法是本领域已知的。基本上任何哺乳动物细胞都可以用于本发明；最好是，所述哺乳动物细胞是人细胞。所述细胞可以是初级细胞(例如，初级肝细胞，初级神经元细胞或初级成肌细胞)，或者可以是确立细胞株的细胞。不需要所述细胞具有细胞分裂的能力；终末分化的细胞可以用于本发明。如果需要，可以在初级细胞铺平板后约24小时将所述病毒导入初级细胞。最好是，所述哺乳动物细胞是肝源细胞，诸如HepG2细胞、Hep3B细胞、Huh-7细胞、FTO2B细胞、Hepal-6细胞或SK-Hep-1细胞或Kupffer细胞；肾细胞，诸如肾细胞系293的细胞、PC12细胞(例如，由神经生长因子诱导的分化PC12细胞)、COS细胞(例如，COS7细胞)或Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)；神经元细胞，诸如胎神经元细胞、皮质锥体细胞、僧帽细胞、粒细胞或脑细胞(例如，大脑皮质细胞；星形胶质细胞；许旺细胞)；肌细胞，诸如成肌细胞或肌管细胞(例如，C2C12细胞)；胚胎干细胞、脾细胞(例如，巨噬细胞或淋巴细胞)；上皮细胞，诸如HeLa细胞(人宫颈癌上皮细胞系)；成纤维细胞，诸如NIH3T3细胞；内皮细胞；WISH细胞；A549细胞；或骨髓干细胞。其它优选的哺乳动物细胞包括CHO/dhfr-细胞、Ramos、Jurkat、HL60和K-562细胞。可以体外或体内将病毒导入细胞。在体外将病毒导入细胞时，如果需要，可以将受感染的细胞接着导入哺乳动物。因此，通过体外、体内或体外和体内顺序保持所述细胞，可以完成所述外源基因的表达。类似地，当本发明用于在超过一个细胞中表达外源基因时，可以联合使用体外和体内方法，将所述基因导入一个以上的哺乳动物细胞。如果需要，通过将病毒给予携带所述细胞的哺乳动物，可以将所述病毒导入所述细胞。例如，通过皮下、血管内或腹膜内注射可以将病毒给予哺乳动物。如果需要，可以使用诸如可植入泵的缓释装置，以有助于将所述病毒传递到该哺乳动物的细胞。通过调节给予哺乳动物的病毒量和通过控制传递方法，可以导向哺乳动物体内的特定细胞类型。例如，可以使用血管内将病毒给予至门静脉、脾静脉或肠系膜静脉或给予至肝动脉，以便于将病毒导向肝细胞。在另一方法中，可以在将细胞或器官移植给接受者之前，将病毒给予供体个体(人或非人类)的细胞或器官。在优选的给药方法中，将所述病毒给予哺乳动物的具有靶细胞的组织或器官。通过将含有病毒的溶液注射进入组织，可以完成这种给予，所述组织例如皮肤组织、脑组织(例如，大脑皮质)、肾脏组织、膀胱组织、肝组织、脾组织、肌肉组织、甲状腺组织、胸腺组织、肺组织或结肠组织。或者，或者另外，按照常规灌注方法，通过用含有所述病毒的溶液对器官灌注可以完成给予。在另一优选的方法中，鼻腔内给予所述病毒，例如，将所述病毒的溶液给予哺乳动物的鼻粘膜。可以使用该给药方法促进逆行运输所述病毒至大脑。该方法由此提供了一种手段，以不用对所述哺乳动物进行手术而将所述病毒传递至脑细胞(例如，嗅球的僧帽细胞和颗粒神经元细胞)。在使用所述病毒在大脑中表达外源基因中替代方法中，按照诱导渗压震扰的常规方法，通过渗压震扰将所述病毒传递至大脑。在体外条件下保持所述细胞时，可以使用常规组织培养条件和方法。在优选方法中，在含有诸如I型胶原蛋白或大鼠尾胶原蛋白的胶原蛋白的基质(substrate)或含有层粘连蛋白的基质(matrix)上保持所述细胞。做为体外条件下保持细胞的替代方法或其它方法，可以在体内条件(例如，在人体中)下保持所述细胞。可植入形式的胶原蛋白基质亦适合于在实践本发明的体内条件下保持所述病毒感染的细胞(参见，例如，Hubbell等，1995，Bio/Techonology13565-576和Langer和Vacanti，1993，Science260920-925)。可以使用本发明表达编码诸如多肽或蛋白质、反义RNA和催化性RNA的基因产物的各种外源基因。如果需要，可以从所述哺乳动物细胞纯化所述基因产物(例如，蛋白质或RNA)。因此，本发明可以用于生产在生物学和医学领域有用的广泛种类的蛋白质。当本发明用于表达反义RNA时，优选的反义RNA与哺乳动物细胞的病原体(例如，病毒、细菌或真菌)的核酸(例如，mRNA)互补。例如，本发明可以用于通过表达与必需肝炎病毒基因产物的mRNA(例如，聚合酶mRNA)杂交的反义RNA治疗肝炎病毒感染的方法之中。其它优选的反义RNA包括那些与细胞中天然存在的基因互补的反义RNA，所述基因以不合需要的高水平表达。例如，可以设计反义RNA以抑制哺乳动物细胞中癌基因的表达。类似地，可以使用所述病毒表达催化性RNA(即，核酶)，该催化性RNA通过水解编码靶基因产物的mRNA来抑制细胞中靶基因表达。可以通过采用常规标准设计反义RNA和催化性RNA。如果需要，本发明可以用于在哺乳动物细胞中表达显性失活突变体。例如，通过在细胞表达病毒壳体蛋白的显性失活突变体，可以抑制或防止所述细胞中的病毒装配(参见，例如，Scaglioni等，1994，Virology205112-120；Scaglioni等，1996，Hepatology241010-1017；和Scaglinoni等，1997，J.Virol.71345-353)。本发明可以用于在细胞中表达任何各种“治疗”基因。“治疗”基因是当表达时赋予包含该基因的细胞或组织或该基因在其中表达的哺乳动物有益效果的基因。“有益效果”的实例包括减轻病症或疾病症候或症状、防止或抑制病症或疾病或赋予所需要的特性。治疗基因包括那些纠正细胞或哺乳动物中基因缺陷疾病的基因。例如，氨甲酰合成酶I当其在先前未能表达或不能足量表达氨甲酰合成酶I的细胞中表达时，可以纠正基因缺陷疾病。“纠正”基因缺陷疾病不必等同于治愈患有疾病的患者。所有所需要的是赋予有益效果，甚至包括暂时性地减轻该疾病的症候或症状。亦包括在一种细胞中表达，却赋予第二种细胞有益效果的基因。例如，可以在胰脏细胞中表达编码胰岛素的基因，从胰脏细胞分泌胰岛素，对所述哺乳动物的其它细胞产生效应。其它治疗基因包括编码抑制以不合需要的高水平表达的基因的转录或翻译的反义RNA核酸的序列。例如，抑制编码癌蛋白的基因表达的反义RNA认为是治疗基因。“癌症治疗”基因是那些对癌性细胞或患有癌症的哺乳动物赋予有益效果的基因。特别有用的癌症治疗基因包括p53基因、单纯疱疹病毒胸苷激酶基因和与癌基因互补的反义基因。本发明可以用于表达治疗基因以治疗基因缺陷疾病。特别适于表达的基因包括那些被认为在受治疗的哺乳动物的靶细胞中以低于正常水平表达的基因。特别有用的基因产物包括氨甲酰合成酶I、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨琥珀酸合成酶、精氨琥珀酸裂解酶和精氨酸酶。其它需要的基因产物包括延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α-1抗胰蛋白酶、葡糖-6-磷酸酶、低密度脂蛋白受体、胆色素原脱氨基酶、因子VIII、因子IX、cystathioneβ-合酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰辅酶A脱氢酶、丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶、戊二酰辅酶A脱氢酶、胰岛素、β-葡糖苷酶、丙酮酸羧化酶、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶(亦称为P-蛋白)、H-蛋白、T-蛋白、Menkes病铜运输ATP酶、Wilson病铜运输ATP酶和CFTR(例如，用于治疗囊性纤维化)。本发明亦可以用于在哺乳动物细胞中表达预期在哺乳动物而不是在昆虫中具有生物学效应的基因(即，“哺乳动物特异性”基因)。例如，可以使用杆状病毒基因组表达哺乳动物myoD基因，并由此产生肌肉蛋白；预期这种基因在哺乳动物细胞中而不是在昆虫细胞中具有生物学效应。哺乳动物特异性基因的其它实例包括但不限于在哺乳动物细胞而不是在昆虫细胞中起作用的转录因子。例如，当从哺乳动物细胞中的昆虫基因组(例如，杆状病毒基因组)表达转录因子c/ebp-α和chop10时，所述转录因子将激活肝细胞分化途径。与之相反，在昆虫细胞中表达这些哺乳动物特异性转录因子，预期对所述昆虫细胞具有极小的或没有效应。如果需要，可以使用本发明的载体在非哺乳动物(例如，昆虫)细胞中繁殖遗传构建物，具有抑制该产物DNA甲基化的优点。已观察到启动子在其通常不表达的细胞系或组织中会甲基化，这种甲基化对正常组织特异性表达有抑制性(Okuse等，1997，BrainRes.Mol.BrainRes.46197-207；Kudo等，1995，J.Biol.Chem.27013298-13302)。例如，神经启动子在非神经哺乳动物细胞中会甲基化。通过使用例如昆虫细胞(例如，Sf9细胞)繁殖携带外源基因和哺乳动物启动子(例如，神经启动子)的杆状病毒，本发明提供了在给予欲表达所述外源基因的哺乳动物细胞(例如，神经细胞)所述杆状病毒和外源基因之前、抑制所述启动子DNA甲基化的手段。定义“非哺乳动物”DNA病毒指具有DNA基因组(而不是RNA)、并且天然就不能在脊椎动物(特别是哺乳动物)细胞中复制的病毒。包括昆虫病毒(例如，杆状病毒)、两栖动物病毒、植物病毒和真菌病毒。天然在原核生物中复制的病毒排除在本定义之外。可用于实践本发明的病毒的实例列于表1中。本文使用的“基因组”可以包括天然存在的非哺乳动物DNA病毒中存在的全部或部分核酸序列。如果需要，基因或序列可以从所述病毒基因组除去或失效(例如，通过突变发生)，只要所述病毒保留或通过工程改造保留其在哺乳动物细胞中表达外源基因的能力。例如，可以工程改造所述病毒，使其缺失功能性多角体蛋白基因。通过从病毒基因组(例如，杆状病毒基因组)缺失全部或部分多角体蛋白基因，或通过向多角体蛋白基因内导入突变(例如，移码突变)，产生这种病毒，使得该基因产物的活性受抑制。“昆虫”DNA病毒指具有DNA基因组、并且天然可以在昆虫细胞中复制的病毒(例如，杆状病毒科、虹彩病毒科、痘病毒科、多DNA病毒科、浓病毒科、花椰菜花叶病毒科和藻DNA病毒科)。“外源”基因或启动子指不是非哺乳动物DNA病毒(例如，杆状病毒)基因组的正常部分的任何基因或启动子。这类基因包括那些通常存在于欲感染的哺乳动物细胞中的基因；亦包括通常不存在于欲感染的哺乳动物细胞中的基因(例如，其它细胞或物种的相关或不相关基因)。本文使用的术语“外源基因”排除编码“改变的外壳蛋白”的基因。“改变的外壳蛋白”指这样的任何多肽，所述多肽(i)被工程改造以在病毒颗粒表面表达，(ii)通常不存在于用于感染哺乳动物细胞的非哺乳动物DNA病毒表面和(iii)允许通过与细胞结合进入哺乳动物细胞和/或有助于从哺乳动物内体逃逸进入所述细胞的细胞溶胶。通常，将编码改变的外壳蛋白的基因加入用于本发明的非哺乳动物DNA病毒的基因组中。如果需要，可以构建病毒基因组，使得该病毒表达结合哺乳动物细胞上的哺乳动物受体或反受体的多肽。改变的外壳蛋白可以包括“哺乳动物”病毒的所有或部分外壳蛋白，所述“哺乳动物”病毒即天然感染哺乳动物细胞并在哺乳动物细胞中复制的病毒(例如，流感病毒)。如果需要，所述改变的外壳蛋白可以是“融合蛋白”，即包括源自一个或多个独特来源的二种(或多种)独特蛋白(例如，不同物种的蛋白)的部分或全部的工程改造蛋白。通常，用于本发明的融合蛋白包括(i)具有跨膜蛋白(例如杆状病毒gp64)的跨膜区的多肽，其融合于(ii)结合哺乳动物细胞的多肽(例如，VSV-G的胞外域)。尽管术语“改变的”与外壳蛋白相关使用(因为在通常没有发现这种蛋白的病毒颗粒表面表达的意义上它是改变的)，该蛋白自身不必与所述蛋白的野生型的序列或结构有区别。因此，结合哺乳动物细胞的野生型跨膜蛋白可以做为改变的外壳蛋白使用(例如，野生型流感病毒血凝素蛋白)。实际上，最好使用野生型蛋白。然而，亦可以将非野生型蛋白做为“改变的”外壳蛋白使用，只要该非野生型外壳蛋白保持与哺乳动物细胞结合的能力。非野生型蛋白的实例包括截短的蛋白、突变蛋白(例如，缺失突变体)和结合哺乳动物细胞的跨膜多肽的保守性变异。“保守性变异”指一个氨基酸残基由另一个功能类似的残基置换。保守性变异的实例包括以一个疏水性残基例如丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸置换另一个疏水性残基，或以一个极性残基置换另一个极性残基，例如精氨酸置换赖氨酸、谷氨酸置换天冬氨酸或谷氨酰胺置换天冬酰胺等等。术语“保守性变异”亦包括使用取代的氨基酸(例如，修饰的氨基酸，例如羟赖氨酸)置换未取代的亲代氨基酸。“定位以表达”指包括相关(reference)基因(例如，外源基因)的DNA序列被定位于邻近指导所述DNA转录的DNA序列，如果需要，邻近指导RNA翻译的DNA序列(即，促进末端基因产物的产生)。“启动子”指至少足以指导转录的最小序列。“哺乳动物活性”启动子是可以在哺乳动物细胞中指导转录的启动子。术语“哺乳动物活性”启动子包括源自哺乳动物基因组的启动子即“哺乳动物启动子”和天然可以指导在哺乳动物中转录的病毒启动子(例如，MMTV启动子)。可用于本发明的其它启动子包括足以赋予可控制的依赖启动子的细胞类型特异性、细胞阶段特异性或组织特异性(例如，肝脏特异性启动子)的基因表达的那些启动子、和可以由外源信号或试剂“诱导”的那些启动子(例如，金属硫蛋白启动子、MMTV启动子和pENK启动子)；这类元件可以位于所述天然基因的5’或3’区。所述启动子序列可以不是天然存在的序列，只要它在哺乳动物细胞中起作用。“诱导型”启动子是这样一种启动子，其(a)缺乏诱导物时，不指导表达或指导低水平表达可操作地连接至该诱导型启动子的基因；或(b)存在调节因子时表现出低水平表达，当除去该调节因子时，使得该启动子高水平表达(例如，tet系统)。在存在诱导物时，诱导型启动子指导提高水平的转录。“可操作地连接”指基因或调节序列(例如，启动子)以这种方式连接，使得在适当的分子(例如，转录激活蛋白)与调节序列结合时允许基因表达。“细胞永生化序列”指当存在于哺乳动物细胞中时可以转化所述细胞延长抑制衰老的核酸分子。包括SV40T-抗原、c-mys、端粒酶和E1A。“反义”核酸指与编码目的多肽的靶核酸(例如，基因或mRNA)的全部或部分互补(即，可以杂交)的核酸分子(即，RNA)。如果需要，可以使用常规方法产生具有所需修饰的反义核酸。例如，可以使用硫代磷酸寡核苷酸做为反义核酸，以抑制体内核酸酶降解所述反义寡核苷酸。在所述反义核酸仅与编码欲抑制的多肽的靶核酸的部分互补的情况下，所述反义核酸应与所述靶核酸的一些关键部分(例如，在非编码序列的翻译控制区，或编码序列的5’端)足够近地杂交，使得其抑制功能多肽(即，执行欲抑制的活性(例如，酶活性)的多肽)的翻译。通常，这意味着所述反义核酸应与该反义核酸杂交的靶mRNA的5’一半或三分之一内的序列互补。本文使用的术语“反义基因”是转录成为反义RNA的核酸。通常，这种反义基因包括靶核酸的全部或部分，但是该反义基因可操作地连接至一个启动子，使得该反义基因的定向与天然存在的基因中该序列的定向相反。用途本发明可用于体外或体内在哺乳动物细胞(例如HepG2细胞)中表达外源基因。该方法可以用于生产欲纯化的蛋白，例如做为药物给予的蛋白(例如，胰岛素)。亦可以治疗性地使用本发明的病毒。例如，本发明可以用于在患者中表达编码纠正基因表达缺陷的蛋白的基因。在治疗法的替代方法中，本发明可以用于在细胞中表达任何蛋白、反义RNA或催化性RNA。本发明的非哺乳动物病毒表达系统提供了几个优点。病毒上的改变的外壳蛋白增强了所述非哺乳动物DNA病毒感染哺乳动物细胞和在哺乳动物细胞中表达基因的能力。亦可以使用这种外壳蛋白赋予工程改造的病毒的细胞类型特异性。例如，在细胞上表达CD4+，增强了表达HIV包膜gp120蛋白的病毒感染这种CD4+细胞的能力(Mebatsion等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.9311366-11370)。本发明允许外源基因的从头表达；由此，在受感染的细胞中检测到外源蛋白(例如，β-半乳糖苷酶)代表实际上在受感染细胞中合成的蛋白，与所述病毒异常地携带的蛋白形成对比。因为用于本发明的非哺乳动物病毒通常对人类无致病性，并且不在哺乳动物细胞中复制，因此极大地降低了对安全处理这些病毒的忧虑。类似地，因为大多数天然存在的病毒启动子通常在哺乳动物细胞中无活性，所以极大地降低了不合需要的病毒蛋白的产生。传统的基因治疗载体基于与辅助病毒一起或在包装系上繁殖的缺陷病毒，而本发明采用了对于为繁殖病毒而在昆虫细胞上的生长无缺陷的病毒，但是所述病毒固有的并且是所需要的对在哺乳动物细胞上生长有缺陷。因此，与一些基于哺乳动物病毒的基因治疗方法相反，本发明的基于非哺乳动物病毒的方法应不会引起宿主对病毒在哺乳动物细胞中表达的蛋白的免疫应答。可以用在无血清培养基中生长的细胞繁殖用于本发明的非哺乳动物病毒，消除了有时会存在于血清中的外来感染物质污染病毒制备物的风险。另外，使用无血清培养基消除了哺乳动物病毒的使用者面临的庞大开支。某些非哺乳动物病毒例如杆状病毒可以生长至高滴度(即，108pfu/ml)。一般地，可以用于本发明的大病毒基因组(例如，130kbp的杆状病毒基因组)可以接受大的外源DNA分子(例如，100kb)。在某些实施方案中，本发明使用了其基因组已被工程改造而含有外源复制起点(例如，EBVoriP)的病毒。在病毒基因组上存在这种序列，允许病毒游离型复制，增加了在细胞中的持久性。当本发明用于生产从所述细胞纯化的蛋白时，本发明提供了采用哺乳动物表达系统的优点。因此，可以预期外源基因产物的正确翻译后加工和修饰(例如，糖基化)。根据以下详细描述和权利要求书，本发明的其它特征和优点是显而易见的。附图简述图1是AcMNPVRSV-lacZ转移质粒pZ4的图解表述。图2是包含体型AcMNPVRSV-lacZ转移质粒pZ5的图解表述。图3是游离型转移质粒pZ-EBV#1的图解表述，该质粒是杆状病毒和EB病毒序列的嵌合体。用该转移质粒产生的病毒可以在哺乳动物细胞中复制。图4A是允许切除基因盒的转移质粒的图解表述。图4B是由图4A的转移质粒切除的基因盒的图解表述。所述基因盒的切除由cre-lox重组介导。该策略使得在缺失病毒序列时外源基因持久。图5是转移质粒pBV-AVneo的图解表述，该质粒是杆状病毒和腺伴随病毒序列的嵌合体。该质粒可以整合入受感染细胞的基因组。图6是AcMNPV转移质粒pCMV-BV的图解表述。图7是AcMNPV转移质粒pCMVZ-BV的图解表述。图8是AcMNPV转移质粒pAct-BV的图解表述。图9是AcMNPV转移质粒pAZ-BV的图解表述。图10是AcMNPV转移质粒pIE45-BV的图解表述。图11是AcMNPV转移质粒pNSE4-BV的图解表述。图12是AcMNPV转移质粒pTH/SV40/BP9的图解表述。图13是AcMNPV转移质粒pTH-Lac/BP9的图解表述。图14A-D是用含有RSV-lacZ盒的AcMNPV病毒感染后一天用X-gal染色的细胞照片。表达lac-Z基因的细胞用X-gal染色很深。图14A是以感染复数(multiplicitiesofinfection)15感染的HepG2细胞的典型视野照片。图14B是以感染复数125感染的HepG2细胞的典型视野照片；超过25％的细胞被染色。图14C是以感染复数125感染的Sk-Hep-1细胞的典型视野，显示无阳性染色细胞。图14D是以感染复数125感染的Sk-Hep-1细胞的较不典型的视野，显示阳性染色细胞。条带＝55μm。图15是杆状病毒介导的基因转移进入大鼠肝细胞初级培养物后得到的细胞照片。超过70％的细胞被染成蓝色。图16是一显示杆状病毒介导的基因转移的剂量依赖性的图。这里将106HepG2细胞接种入60mm平皿，一天后将细胞暴露给标明剂量的含有RSV-lacZ盒的AcMNPV病毒(病毒滴度＝1.4×109pfu/ml)。感染后一天时，收获细胞，制备提取物并检测β-半乳糖苷酶活性。如先前定义(Norton和Coffin，1985，Mol.Cell.Biol.5281-290)以β-半乳糖苷酶活性单位表述提取物的活性。相对于每种提取物的蛋白含量将酶活性归一化。每个点是三次独立测定的平均，误差条表示标准差。图17是杆状病毒介导的表达时间进程中获得的结果的图示。于时间零点用含有RSV-lacZ盒的AcMNPV病毒感染HepG2细胞(感染复数＝15)。一小时后，除去含有病毒的培养基并用新鲜培养基替换。在标明的时间点收获受感染的细胞，如上述检测β-半乳糖苷酶活性。每个绘制的点表示三次独立检测的平均，误差条表示标准差。对总细胞蛋白归一化，感染后12-24小时病毒表达达到高峰，其后下降。图18是AcMNPV转移质粒VSVG/BP9的图解表述。图19是AcMNPV转移质粒VGZ3的图解表述。图20是具有改变的外壳蛋白的芽生杆状病毒的图解表述。用“gp64”和“VSVG”代表天然杆状病毒细胞表面蛋白(gp64)和VSV-G蛋白。图21是各种杆状病毒转移载体的图解表述，其中一个外源基因可操作地连接至病毒或哺乳动物启动子。图22是Z4和VGZ3在HeLa和HepG2细胞中相对转导效率的图解表述。用缺失VSFVG的杆状病毒Z4或含有VSVG的杆状病毒BGZ3，以感染复数1、10和100处理HeLa和HepG2细胞。用体外化学发光检测在次日测定lacZ基因的表达。-●-，用VGZ3处理的HepG2细胞；-○-，用Z4处理的HepG2；-■-，用VGZ3处理的HeLa；-□-，用Z4处理的HeLa。图23是编码疱疹性口腔炎病毒G糖蛋白的质粒BV-CZPG的核苷酸序列列表。发明详述病毒的遗传操作与常规基因表达方法相反，本发明涉及修饰天然不感染哺乳动物细胞并不在哺乳动物细胞中复制的非哺乳动物DNA病毒。因此，本发明基于将新特性加入非哺乳动物DNA病毒，使其能够将基因传递给哺乳动物细胞，并指导在所述哺乳动物细胞中的基因表达。与之相反，常规基因治疗载体需要使病毒功能失效，所述功能诸如病毒基因的表达和病毒基因组复制。在本发明的方法中，病毒颗粒用做将DNA传递给哺乳动物细胞的“壳”。工程改造病毒DNA，使之含有在哺乳动物细胞中有活性的转录控制序列，以在靶细胞中表达目的基因。可以使用常规重组DNA技术插入这种序列。由于本发明使用的非哺乳动物DNA病毒不能在哺乳动物细胞中复制，因此不需要缺失基本病毒功能以使之缺陷。但是，最好所述病毒天然就在真核生物物种(例如，昆虫、植物或真菌)中复制。可以工程改造以按照本发明表达外源基因的病毒的实例列于表1中。最好是，本发明中使用的病毒基因组在其天然宿主物种中通常被运输至核，因为核定位信号在无脊椎动物和在哺乳动物细胞中起类似作用。以下概括的数据显示与常规知识相反，非哺乳动物DNA病毒可以(1)感染广泛种类的哺乳动物细胞，以及(2)指导外源基因在所述细胞中表达。另外，在病毒颗粒表面表达改变的外壳蛋白，增强了病毒在哺乳动物细胞中表达外源基因的能力。可以将已建立的操作重组病毒的方法结合到在哺乳动物细胞中表达外源基因的这些新方法中。例如，可以从病毒中删除病毒基因，并借助包装系以反式提供。可能需要缺失这类基因，以(1)抑制可能引起免疫应答的病毒基因产物的表达，(2)在病毒载体中提供额外空间，或(3)提供在细胞中保持所述病毒的额外的安全水平。本发明涉及在病毒颗粒表面表达改变的外壳蛋白，以增强非哺乳动物DNA病毒感染哺乳动物细胞并在所述哺乳动物细胞中表达外源基因的能力。可以使用常规分子生物学技术和标准，鉴别并在病毒上表达结合哺乳动物细胞的多肽。通常，编码改变的外壳蛋白的基因可操作地与非哺乳动物活性启动子连接，并从所述病毒基因组表达。或者，可以由所述病毒在其中繁殖的非哺乳动物细胞的染色体中含有的序列编码所述改变的外壳蛋白。在从所述细胞染色体表达所述改变的外壳蛋白时，所述改变的外壳蛋白与非哺乳动物DNA病毒一起包装。在再一替代方法中，可以从共感染所述非哺乳动物DNA病毒在其中繁殖的非哺乳动物细胞的第二种病毒的基因组，表达所述改变的外壳蛋白。因此，在第二种病毒共感染并从第二种病毒的基因组表达所述改变的外壳蛋白时，所述改变的外壳蛋白与所述非哺乳动物DNA病毒一起包装。不管使用的表达改变的外壳蛋白的方法如何，在使得所述改变的外壳蛋白在所述病毒颗粒表面表达的条件下，保持所述非哺乳动物DNA病毒。为此目的，可以使用常规的在非哺乳动物细胞中繁殖病毒的方法(以下进一步讨论)。如果需要，使用常规技术，诸如免疫印迹、免疫荧光等等，可以确认改变的外壳蛋白在病毒颗粒表面上的表达。可以使用常规分子生物学技术，产生做为改变的外壳蛋白使用的合适的融合蛋白。例如，当使用杆状病毒做为所述非哺乳动物DNA病毒时，使用杆状病毒外壳蛋白gp64可以产生广泛种类的融合蛋白(Whitford等，1989，J.Virol.631393-1399和Ayres等，1994，Virology202586-605)。杆状病毒表达载体pAcSurf-2提供了这样的gp64基因，该基因在gp64信号序列和编码成熟糖蛋白序列之间具有同相定位的多克隆位点(Boublik等，1995，Biotechnology131079-1084)。可以容易地将编码结合哺乳动物细胞的多肽的序列插入该载体的多克隆位点，产生的融合蛋白的表达由所述gp64序列可操作地连接的多角体蛋白启动子驱动。如果需要，所述病毒壳体或包膜可以含有做为改变的外壳蛋白的一部分，或做为改变的外壳蛋白之外的独立分子的配体，该配体与哺乳动物细胞结合以促进进入。例如，所述病毒可以包括做为配体的脱唾液酸糖蛋白，该糖蛋白与哺乳动物凝集素(例如，肝脱唾液酸糖蛋白受体)结合，促进进入哺乳动物细胞。因为大多数非哺乳动物病毒的启动子在哺乳动物细胞中无活性，所述外源基因应可操作地连接至可以在哺乳动物细胞中指导基因转录的启动子(即，“哺乳动物活性”启动子)。合适的启动子的实例包括RSVLTR、SV40早期启动子、CMVIE启动子(例如，人CMVIE1启动子)、腺病毒主要晚期启动子和乙型肝炎病毒启动子。其它合适的“哺乳动物活性”启动子包括“哺乳动物启动子”，即对应于在哺乳动物细胞中天然存在并驱动基因表达的启动子的序列。“哺乳动物启动子”在指导基因转录的能力方面常常亦是细胞类型特异性、细胞阶段特异性或组织特异性的，这类启动子可以有利地用于本发明做为控制所述外源基因表达的手段。例如，已描述了几种肝脏特异性启动子，诸如白蛋白启动子/增强子，它们可以用于达到所述外源基因的肝脏特异性表达(参见，例如，Shen等，1989，DNA8101-108；Tan等，1991，Dev.Biol.14624-37；McGrane等，1992，TIBS1740-44；Jones等，J.Biol.Chem.26514684-14690；和Shimada等，1991，FEBSLetters279198-200)。当使用本发明治疗肝细胞癌时，甲胎蛋白启动子特别有用。该启动子通常仅在胎儿组织中有活性；但是，它在肝脏肿瘤细胞中亦有活性(Huber等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.888039-8043)。因此，可以使用甲胎蛋白启动子对肝脏肿瘤细胞定向表达肝癌治疗剂。如果需要，可以工程改造病毒基因组使之携带复制起点，以促进所述外源基因在所述哺乳动物细胞中持久。已鉴别了源自哺乳动物细胞的复制起点(即，“哺乳动物复制起点”)(Burhans等，1994Science263639-640)。其它在哺乳动物中起作用的复制起点(即“哺乳动物活性”起点，例如EB病毒oriP)亦可以在存在适当反式作用因子(例如EBNA-1)的情况下促进保持表达。如果需要，可以工程改造所述病毒，以表达超过一个的外源基因(例如，所述病毒可以被工程改造以同时表达OTC和AS)或超过一种的改变的外壳蛋白。以下是在下述实施例中使用的几种病毒的描述。这些实施例仅供说明之用，不限制本发明的范围。转移质粒的实施例构建pZ4转移质粒使用原先为在杆状病毒中表达蛋白而开发的众所周知的重组技术(参见，例如，O’Reilly等，1992，载于杆状病毒表达载体，W.H.Freeman，NewYork)，可以完成用于本发明的杆状病毒的遗传操纵。在该实施例中，通过用指导报道基因表达的盒打乱所述病毒的多角体蛋白基因构建AcMNPV。所述报道基因盒包括对应于劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子的DNA序列，该序列可操作地连接至大肠杆菌lacZ基因(图1)。所述报道基因盒亦包括编码猴病毒40(SV40)RNA剪接和多聚腺苷酸化信号的序列。将用于以下描述的几个实施例中的RSV-lacZAcMNPV转移质粒命名为Z4并如下构建。使用BglII和BamHI切出包括SV40RNA剪接信号和多聚腺苷酸化信号的pRSVPL9的847bp片段。质粒pRSVPL9源自pRSV珠蛋白(Gorman等，Science221551-553)，方法是用BglII消化pRSV珠蛋白，加入HindIII接头，然后用HindIII酶切所述DNA。将使寡聚核苷酸5’AGCTGTCGACTGGAGGTACCAGATCTCTAGA3’(SEQIDNO1)和5’AGCTTCTAGAGATCTGGTACCTCGAGTCGAC3’(SEQIDNO2)杂交而制备的双链多接头，连接至具有RSV启动子和SV40剪接和多聚腺苷酸信号的4240bp片段。产生的质粒具有取代了珠蛋白序列的所述多接头。使用标准技术将pRSVPL9的SV40序列克隆入pVL1392(Invitrogen和Pharmingen)的BamHI位点。将产生的中间质粒命名为pVL/SV40。用BglI和SpeI从pRSVlacZII(Lin等，1991，Biotechniques11344-348，和350-351)切出RSV-lacZ盒，并插入pVL/SV40的BglII和XbaI位点。通过Z4转移质粒与线性化AcMNPVDNA的同源重组，制备命名为Z4的AcMNPVRSV-lacZ病毒。用于制备该DNA的AcMNPV病毒是AcV-EPA(Hatig等，1992，J.Virol.Methods3861-70)。构建pZ5转移质粒某些非哺乳动物病毒(例如，杆状病毒)可以包含于蛋白包含体中(即，包含体源病毒(ODV))，或者它们可以以质膜芽生形式存在。当在本发明中使用包含体型病毒时，如果需要可以首先从蛋白包含体释放病毒。可以使用常规的使用碱的方法释放病毒(O’Reilly等，1992，载于杆状病毒表达载体，W.H.Freeman，NewYork)。包含体型的碱释放的杆状病毒比非包含体型芽生病毒更易被细胞摄入(Volkmar和Goldsmith，1983，Appl.AndEnviron.Microbiol.451085-1093)。为在本发明中使用包含体型病毒而构建pZ5转移质粒，使用BglII和BamHI从pZ4转移质粒切出RSV-lacZ盒，然后插入pAcUW1(Weyer等，1990，J.Gen.Virol.711525-1534)的BglII位点。构建pZ-EBV#1转移质粒可以工程改造本发明使用的非哺乳动物DNA病毒，以允许病毒在哺乳动物细胞中游离型复制。这种病毒持久性更长，由此优化了外源基因在细胞中长期表达的方法。这种复制型病毒的实例是pZ-EBV#1(图3)，如下构建。使用EcoRI和XbaI从pREP9(Invitrogen)切出EBVoriP和EBNA-1区，然后插入杆状病毒转移质粒pBacPAK9(Clontech)的EcoRI和XbaI位点，产生pEBVBP9。使用BglII和BamHI从pZ4转移质粒切出RSV-lacZ盒，然后插入pEBVBP9的BamHI位点，产生质粒pZ-EBV#1。构建pZ4loxPZ4loxP病毒基因组是使用噬菌体P1cre重组酶的重组的底物。采用标准程序，可以使用该病毒将携带loxP位点的基因盒插入病毒(Patel等，1992，Nucl.AcidsRes.2097-104)。可以工程改造变异的该插入系统，使得从剩余的基因表达序列切出病毒序列。例如，可以构建自主切除转移质粒(图4A-4B)，以在哺乳动物细胞中表达外源基因。该质粒具有促进切除杆状病毒序列的loxP序列。通过将合成的loxP位点插入pZ4转移质粒，构建pZ4loxP转移质粒。合成二个loxP寡聚核苷酸并相互退火。所述寡聚核苷酸是5’GATCTGACCTAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTAAGG3’(SEQIDNO3)和5’GATCCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCA3’(SEQIDNO4)。在用于连接反应之前，通过将寡核苷酸在存在0.25MNaCl时加热至80C，然后使混合物缓慢冷却至室温，将所述寡聚核苷酸退火。然后将退火的寡聚核苷酸连接至已用BglII消化的pZ4转移质粒。使用标准克隆技术进行产生的质粒的连接和分析。然后使用常规的重组进入线性杆状病毒DNA的方法产生重组Z4loxP杆状病毒。构建pBV-AVneo，一种AAV嵌合体转移质粒可以整合入宿主细胞染色体的杆状病毒基因组亦可以用于本发明。这种整合病毒可以比非整合病毒在细胞中更加持久。因此，涉及这种病毒的基因表达方法可以消除将病毒重复给予细胞的需要，由此降低了对所述病毒产生免疫应答的可能性。转移质粒pBV-AVneo(图5)包括腺伴随病毒(AAV)的末端反向重复序列。通过从pFasV.neo切出编码G418抗性、做为BglII-BamHI片段的neo基因，并将此片段插入pAVgal的BamHI位点以取代lacZ基因，而构建该转移质粒。通过用CMV启动子和lacZ基因取代AAV的rep和cap编码序列，构建质粒pAVgal。将产生的命名为pAV.neo的中间片段用PvuI消化。然后将具有驱动表达neo基因的CMV启动子、侧翼为AAVITR的大PvuI片段插入pBacPAK9的PacI位点。如果需要，可以将合适的可操作地连接至AAVrep基因的启动子插入该构建物(例如，在AAVITR和多角体蛋白启动子之间)，以促进切除和重组入所述基因组。可以插入该构建物的rep基因的实例包括rep40、rep52、rep68和rep78。构建pCMV-BV转移质粒从pCMV-EBNA(Invitrogen)的HindIII、BamHI切出人细胞肥大病毒立即早期启动子，它是758bpHindIII-XbaI片段，将其插入pBluescript(SKII+)的HindIII位点，产生质粒pCMV-SKII+。然后从CMV-SKII+的XboI、BamHI位点切出启动子，并插入pSV/BV的XhoI、BglII位点，产生质粒pCMV-BV(图6)。pSV/BV是杆状病毒转移质粒pBacPAK9(Clontech)的修饰形式，具有改变的多接头和SV40剪接和多聚腺苷酸化信号。通过用NotI限制性酶切pBacPAK9，用T4DNA聚合酶产生平端，并自连接去除NotI位点，构建pSV/BV。然后通过将接头pGCGGCCGC连接入SmaI位点，加入一个新的NotI位点。最后，通过用BglII-BamHI消化pRSVPL，将847bp片段插入修饰的BacPAK9的BamHI位点，加入SV40剪接和多聚腺苷酸化信号，产生pSV/BV。构建pCMVZ-BV转移质粒通过用NotI限制性酶切pCMV-BV，并连接插入3kblacZ片段，构建pCMVZ-BV(图7)。通过用NotI限制性酶切pAlb-Gal制备lacZ片段。构建pAct-BV转移质粒从pINA(Morgenstern，JP，1989，博士论文，UniversityCollege，London，UK)于BglII、BamHI切出345bp大鼠β-肌动蛋白启动子，插入pSV-BV的BglII位点，产生pAct-BV(图8)。构建pAZ-BV转移质粒通过用NotI限制性酶切pAct-BV并连接插入3kblacZ片段，构建pAZ-BV(图9)。通过用NotI限制性酶切pAlb-Gal制备lacZ片段。构建pIE45-BV转移质粒通过用SphI限制性酶切pHSVPrPUC(Neve等，1997，Neuroscience79435-447)，接着在存在三磷酸核苷酸时用T4DNA聚合酶处理产生平端，构建pIE45-BV(图10)。然后通过用T4DNA连接酶处理，加入PstI接头(NewEnglandBiolabs，目录号#1024，pGCTGCAGC)，用PstI消化约850bp的片段，并克隆入pSV/BV的PstI位点。构建pNSE4-BV转移质粒通过用SalI和EcoRI限制性酶切pNSE4(参见，例如，Quon等，1991，Nature352239-241和Forss-Petter等，1990，Neuron5187-197)，并连接入pSV/BV的XhoI和EcoRI位点，构建pNSE4-BV(图11)。构建nTH/SV40/BP9转移质粒通过用EcoRI和NotI限制性酶切pTH4.8Thdno(Banerjee等，1992，J.Neuroscience124460-4467)，并将4.0kb启动子片断连接入也用EcoRI和NotI消化的pSV/BV，构建pTH/SV40/BP9(图12)。构建pTH-Lac/BP9转移质粒通过用NotI限制性酶切pALB-Gal并分离3kblacZ片段，然后使用T4DNA连接酶将该片段连接入亦用NotI限制性酶切的pTH/SV40/BP9，构建pThlac(图13)。病毒繁殖可以使用常规方法繁殖本发明中使用的病毒(参见，例如，Burleson等，1992，病毒学实验手册，AcdemicPress，Inc.，SanDiego，CA和Mahy编辑，1985，病毒学实用方法，IRLPress，Oxford，UK)。繁殖病毒的常规条件适合允许改变的外壳蛋白在用于本发明的病毒颗粒表面上表达。例如，按照标准程序，将用于下述实验的杆状病毒进行噬斑纯化和扩增(参见，例如，O’Reilly等，见下述和Summers和Smith，1987，杆状病毒载体和昆虫细胞培养程序方法手册，TexasAgriculturalExperimentStationBulletinNo.1555，CollegeStation，Texas)。通过在含有10％胎牛血清(FBS)和0.1％PLURONICF-68TM的HinksTNM-FH培养基(JRHBiosciences)上旋动培养，繁殖AcMNPV和Sf21细胞。使用5mMNaCl、10mMTrispH7.5和10mMEDTA中的27％(w/v)蔗糖垫层，在SW28转头(24,000rpm，75分钟)中通过超离心浓缩扩增的病毒。然后将病毒沉淀再悬浮于磷酸缓冲盐水(PBS)中，通过0.45μm滤器(Nalgene)除菌。如果需要，可以在杯式超声波仪(cupsonicator)中通过超声处理再悬浮病毒。通过在Sf21昆虫细胞上的噬斑检测测定AcMNPV滴度。外源基因表达的实施例因为长期以来都认为非哺乳动物DNA病毒不能感染哺乳动物细胞并在哺乳动物细胞内指导基因表达，下述实施例的A部分提供了非哺乳动物DNA病毒(例如，杆状病毒)事实上可以用于在哺乳动物细胞中表达外源基因的证据。尽管A部分中描述的实施例使用了外壳蛋白未改变的病毒，但这些实施例对非哺乳动物DNA病毒可以用于在哺乳动物细胞中表达外源基因的主张提供了支持。另外，这些实施例为使用具有改变的外壳蛋白的病毒实践本发明提供了指南。下述B部分的实施例使用了具有改变的外壳蛋白的非哺乳动物DNA病毒。由于改变的外壳蛋白的存在是本发明的病毒与缺乏改变的外壳蛋白的病毒之间的唯一显著区别，所以这些实施例证明，改变的外壳蛋白的表达增强非哺乳动物DNA病毒在哺乳动物细胞中表达外源基因的能力。因此，在下述的每一个方法中(例如，体内表达外源基因)，预期具有改变的外壳蛋白的病毒比缺乏改变的外壳蛋白的病毒优越。A部分可以用于在哺乳动物细胞中表达外源基因的非哺乳动物DNA病毒I.体外在哺乳动物细胞中表达外源基因的实施例几乎所有的哺乳动物细胞都是非哺乳动物病毒的潜在靶，可以快速地测试任何培养的细胞或初级细胞。在以下实施例中，检测了Z4杆状病毒感染19种不同类型细胞的能力。在该实施例中，所述杆状病毒是Z4病毒，通过Z4转移质粒与线性化AcMNPVDNA同源重组制备。受检测的细胞是HepG2、Sk-Hep-1、NIH3T3、表达细胞表面脱唾液酸糖蛋白受体的NIH3T3细胞、HeLa、CHO/dhfr-、293、COS、Ramos、Jurkat、HL60、K-562、C2C12成肌细胞、C2C12肌管细胞、初级人肌肉成肌细胞、Hep3B细胞、FTO2B细胞、Hepa1-6细胞和神经生长因子-分化的PC12细胞。细胞生长可以使用常规的组织培养方法生长欲感染的哺乳动物细胞(Freshney，1987，动物细胞培养基本技术手册，第二版，AlanR.Liss，Inc.NewYork，NY)。如上述使这些细胞生长并进行感染。如下述使细胞生长。在含有10％FBS的Eagle改良极限必需培养基(EMEM)中培养HepG2和Sk-Hep-1细胞。在含有10％FBS的DMEM中培养NIH3T3、HeLa、293和COS细胞。在含有10％FBS的MEMα中培养CHO/dhfr-细胞。在含有10％FBS的RPMI1640培养基中培养Ramos、Jurkat、HL60和K-562细胞。通过在含有0.5％二甲基亚砜和1μm视黄酸(Sigma)的同样培养基中培养，诱导HL60细胞分化。在含有20％FBS的DMEM中繁殖C2C12成肌细胞，并在含有10％马血清的DMEM中培养期间分化成为肌管。在含有5％FBS和10％马血清的DMEM中繁殖PC12细胞，在含有10％FBS、5％马血清和100ng/ml神经生长因子的DMEM中培养期间被诱导分化。在用AcMNPV感染前一天将所有的细胞接种，假设在此期间细胞数量翻倍来计算感染复数(multiplicitiesofinfection)。C2C12和PC12细胞在分化时细胞数量可能增加，因此反映出略低的moi。体外感染细胞可以通过使病毒吸附至细胞上0.1-6小时，完成病毒对哺乳动物细胞的体外感染；最好是，持续吸附1-2小时。一般地，0.1-1,000的感染复数是合适的；moi优选为100-500。对于相对难感染的细胞，优选moi为100-1,000。对于用于本发明的病毒，使用所述病毒天然感染的非哺乳动物细胞的常规方法可以确定滴度。如果需要，可以在含有胶原蛋白(例如，大鼠尾类型I胶原蛋白)的基质上保持欲感染的哺乳动物细胞。基于在胶原蛋白包被板上培养和感染细胞后细胞计数和与在常规EHS基质上生长的细胞之间的比较，本人发现与常规EHS基质相比，胶原蛋白基质将细胞(例如，肝细胞)受非哺乳动物病毒感染的易感性提高10-100倍。可以得到市售的含有胶原蛋白基质的平板(例如，BIO-COATTM板，CollaborativeResearch)，大鼠尾胶原蛋白亦有市售(SigmaChemicalandCollaborativeResearch)。在以下描述的体外检测中，感染的标准条件使用了2×106细胞和moi为15的RSV-lacZAcMNPV。在感染一天前将贴壁细胞系接种。将细胞暴露给2ml培养基中的病毒90分钟，然后除去含有病毒的培养基，并用新鲜培养基更换。模拟感染的细胞用缺乏病毒接种物的2ml培养基处理。检测感染和基因表达使用标准技术，可以监测病毒传递至细胞和外源基因的表达。例如，通过检测病毒DNA或RNA(例如，通过DNA印迹法或RNA印迹法、狭线印迹法或斑点印迹法、或原位杂交、用或不用PCR扩增)，可以测定病毒(例如，AcMNPV)传递至细胞。分子生物学领域的技术人员可以方便地制备与所述病毒、调节序列(例如，启动子)或所述外源基因杂交的合适的探针。当本发明用于体内在细胞内表达外源基因时，通过在活检中得到细胞，可以检测病毒传递至细胞。例如，当本发明用于在肝细胞中表达基因时，可以进行肝活检，可以使用常规方法检测肝细胞中的病毒。亦可以通过检测从所述哺乳动物得到的细胞或体液(例如，血清)中对应于所述基因的RNA或蛋白质，跟踪哺乳动物的细胞中外源基因的表达。可以使用分子生物学家通常使用的检测技术(例如，RNA印迹法或蛋白质印迹法、原位杂交、狭线印迹法或斑点印迹法、PCR扩增、SDS-PAGE、免疫染色、RIA和ELISA)测定基因表达。如果需要，可以使用报道基因(例如，lacZ)测定特定杆状病毒将基因表达导向某些组织或细胞的能力。组织检查可以涉及(a)在用液氮冷冻的异戊烷中快速冷冻所述组织；(b)使用O.C.T.将组织固定于木栓上并冷冻；(c)在恒冷箱切片机上将所述组织切成10μm切片；(d)干燥所述切片，用PBS中的4％多聚甲醛处理所述切片，接着在PBS中漂洗；(e)将所述组织用PBS中的X-gal(0.5mg/ml)/亚铁氰化物(35mM)/高铁氰化物(35mM)染色；和(f)通过显微镜术分析组织。为检测报道基因在受感染细胞中的表达，使用标准方法进行β-半乳糖苷酶活性的比色测定(Norton等，Molecular&amp;CelluarBiology5281-290)。可以使用检测β-半乳糖苷酶活性的其它常规方法代替在该实施例中使用的方法。于感染后一天制备细胞提取物。用PBS漂洗细胞单层三次，从平皿刮下，通过低速离心收集。将细胞沉淀再悬浮于25mMTrispH7.4/0.1mMEDTA中，然后进行三个循环的液氮中冷冻和37℃水浴解冻。通过于14,000×g离心5分钟澄清提取物。检测β-半乳糖苷酶活性的标准条件使用了0.1ml细胞提取物、0.8mlPM-2缓冲液和0.2mlPM-2缓冲液中的邻硝基苯-α-D-半乳吡喃糖苷(4mg/ml)，于37℃10分钟(Norton等，1985，Mol.&amp;Cell.Biol.5281-290)。通过加入0.5ml1M碳酸钠终止反应。于420nm分光光度分析检测底物水解量，使用常规方法计算β-半乳糖苷酶活性(Norton等，1985，Mol.&amp;Cell.Biol.5281-290)。确认所述检测与提取物浓度和时间成线性关系。用牛血清白蛋白做为标准，使用CoomassiePlus蛋白分析(Pierce)测定提取物蛋白浓度，以每毫克蛋白质β-半乳糖苷酶活性单位表达β-半乳糖苷酶活性水平。如果需要，可以使用其它标准蛋白分析法。为进行β-半乳糖苷酶活性的组织化学染色，用PBS中的2％(w/v)甲醛-0.2％(v/v)多聚甲醛固定细胞5分钟。用PBS漂洗几次后，通过加入PBS中的0.5mg/mlX-gal(BRL)，于37℃将细胞染色2-4小时。检测19种哺乳动物细胞类型以下19个实例描述了可以在测试的19种哺乳动物细胞类型中的14种检测到外源基因的表达。这些分析使用了二种不同的β-半乳糖苷酶活性检测法。使用更加敏感的检测即X-gal染色，在19种哺乳动物细胞类型中的14种中检测到外源基因表达。使用敏感性略低的检测即细胞提取物的ONPG检测，三个细胞系(HepG2、293和PC12)在暴露给病毒后显示统计学显著(P＜0.05，斯氏t检验)的较高的β-半乳糖苷酶活性。暴露给RSV-lacZ杆状病毒的人肝脏肿瘤系HepG2表达的β-半乳糖苷酶水平比模拟感染的对照高80倍。腺病毒转化的人胚胎肾细胞系293表达的lacZ报道基因比本底高约4倍。另外，用神经生长因子分化成为神经元样表现型的PC12细胞在用RSV-lacZ杆状病毒感染后，表现出高约2倍的β-半乳糖苷酶水平。该差异为统计学显著的(P＝0.019)。表3.杆状病毒介导的RSV-LacZ报道基因在哺乳动物细胞系中的表达β-半乳糖苷酶活性(单位/mg)平均值±SD通过更加敏感的检测即组织化学染色，在暴露给病毒的19个细胞系中的14个细胞系中检测到β-半乳糖苷酶活性。因此，某些细胞系在提取物中没有检测到产生了显著高水平的β-半乳糖苷酶，它们实际上可以用更加敏感的X-gal染色程序，检测到低但是可重复的频率表达β-半乳糖苷酶。通过使用更高的感染复数可以提高该频率，使得在低moi下好象不表达所述基因的细胞，在较高的moi下染成蓝色。可以以此方式转染的细胞系的实例包括SK-Hep-1、NIH3T3、HeLa、CHO/dhfr-、293、Cos和C2C12细胞。另外，在暴露给病毒的初级人肌肉成肌细胞中检测到β-半乳糖苷酶活性。该发现表明，杆状病毒既可以介导基因转移至初级细胞，亦可以介导基因转移至对应的确立细胞系(C2C12)，表明外源基因在确立细胞系中的表达对用初级细胞得到的结果具有预测价值。在用所述病毒处理的Hep3B细胞中亦检测到β-半乳糖苷酶活性；这些细胞中表达水平几乎与在HepG2细胞中检测到的水平相同。另外，在暴露给病毒的FTO2B(大鼠肝细胞癌)细胞和Hepa1-6(人肝细胞癌)细胞中发现β-半乳糖苷酶活性。在已工程改造以在所述细胞表面上表达脱唾液酸糖蛋白受体的NIH3T3细胞中，亦检测到β-半乳糖苷酶活性。这些细胞表达的β-半乳糖苷酶水平约是正常NIH3T3细胞的二倍。这个观察提示，可以使用脱唾液酸糖蛋白受体增强对病毒介导的基因转移的易感性。感染后的β-半乳糖苷酶酶测定揭示，在使用的moi下，Ramos、Jurkat、HL60和K-562细胞系不表达统计学显著水平的β-半乳糖苷酶。基于使用其它哺乳动物细胞系得到的结果，预期当采用较高的病毒剂量(即，moi)或较长的吸附时间时，可以在这些明显较难感染的细胞系中检测到β-半乳糖苷酶活性。即使将细胞暴露给所述病毒导致在相对低百分比的细胞中表达所述外源基因(体外或体内)时，可以使用本发明鉴别或确认驱动外源基因(例如，诸如氯霉素乙酰转移酶基因、碱性磷酸酶基因、荧光素酶基因或绿荧光蛋白基因的报道基因)表达的启动子的细胞或组织类型特异性。一旦鉴别出，可以将这种启动子用于任何常规基因表达方法中。类似地，仅仅相对低水平的表达对在哺乳动物中引起针对所述异源基因产物的免疫应答(即，产生抗体)是必需的。因此，本发明的基因表达方法，可以用于通过在哺乳动物细胞中表达所述抗原制备抗优选的异源抗原的抗体。这类抗体特别可以用来纯化所述异源抗原。所述基因表达方法亦可以用于在哺乳动物中诱发抗异源抗原的免疫保护应答(即，做为疫苗使用)。另外，本发明可以用于从其中病毒介导表达细胞永生化序列(例如，SV40T抗原)的细胞产生永久细胞系。使用X-gal的组织化学染色提供了在暴露给修饰的AcMNPV的细胞中检测β-半乳糖苷酶表达的高度敏感方法。当HepG2细胞暴露给moi为15的修饰AcMNPV时，约5-10％的细胞被X-gal染色(图14A)。当感染复数(moi)为125时，约25-50％的细胞被染色(图14B)。未观察到任何暴露给所述病毒的不良效应，例如核膨胀。这些数据证明，当使用足够剂量的病毒时，修饰的AcMNPV在将基因转移入HepG2细胞方面高度有效。当Sk-Hep-1细胞暴露给moi为15的病毒时，未观察到染色细胞(未给出数据)。虽然大多数暴露给moi为125的病毒的Sk-Hep-1细胞未染成蓝色(图14C)，但发现少数细胞在用该较高剂量病毒处理后染色很深(图14D)。这些数据表明，在相对moi下看来较难感染病毒的细胞，实际上在较高moi下可以被感染并表达所述外源基因。在模拟感染的培养物中未发现染色的细胞(未给出数据)。据细胞计数确定，估计在暴露给相同剂量的所述修饰病毒后，Sk-Hep-1细胞系中染色细胞的频率比HepG2细胞中低2,000-4,000倍。因此，由修饰的AcMNPV证明的细胞类型特异性是相对的，而不是绝对的。这些数据亦表明，当细胞混合物与病毒接触时(体外或体内)，可以调节病毒剂量以在较低感染复数下将病毒导向被感染的细胞。大鼠肝细胞初级培养物中的表达该实施例描述了非哺乳动物DNA病毒亦可以用于在大鼠肝细胞初级培养物中高水平表达外源基因。在该实验中，将新鲜制备的大鼠肝细胞铺平板于如前述用大鼠尾胶原蛋白包被的平皿(Rana等，1994，Mol.Cell.Biol.145858-5869)。24小时后，用含有感染复数约430的RSV-lacZ杆状病毒的新鲜培养基饲养细胞。再24小时后，固定细胞并用X-gal染色。超过70％的细胞被染成蓝色，表明它们已摄入并表达RSV-lacZ盒(图15)。在该实施例中得到的表达频率比使用基因治疗中使用的常规病毒载体(例如，反转录病毒载体和单纯疱疹病毒载体)报道的频率高。模拟感染的培养物没有含有任何阳性染色的细胞(未给出数据)。可以使用其它优选的外源基因代替lacZ基因。另外，可以容易地将其它初级细胞铺平板，并与非哺乳动物细胞温育以取代初级大鼠肝细胞。皮质培养物中的表达以下二个实施例描述非哺乳动物DNA病毒可以用于在培养的神经元细胞和胶质细胞中表达外源基因。对此实施例，如上述从在含有10％FCS的HinkTNM-FH培养基中生长的Sf9细胞制备Z4病毒。通过在磷酸缓冲盐水中的20-60％蔗糖梯度中形成区带，纯化所述病毒。在以下实验中使用的病毒滴度是3×108pfu/ml(病毒贮液#1)或2×109pfu/ml(病毒贮液#2)，系在Sf9细胞上测定。在使用前将每种病毒贮液进行超声处理。对于第一个实施例，从E16胚胎幼仔制备大鼠大脑皮质培养物。用300,000细胞/孔接种24孔平皿，植板后4天，通过将含血清培养基中的各种量的病毒加入所述孔中感染所述细胞，如表4中表明。使病毒吸附至细胞上24小时。表4.外源基因在大鼠皮质细胞中的表达通过计数用X-gal染色细胞后蓝色细胞的数目，测定外源β-半乳糖苷酶基因的表达。表4提供了10X放大倍数时显微镜的5个视野内观察到的蓝色细胞的数目，每孔含有约65个视野。在一些孔中，孔周边的细胞被优先染色。这些数据表明，从培养神经元细胞中的病毒表达了外源β-半乳糖苷酶基因。与之相反，当用PBS模拟感染所述细胞培养物时，未检测到任何蓝色细胞。因此，通过按照标准准则，将蓝色细胞通过细胞形态学鉴别为神经元和胶质细胞的检测确定，该非哺乳动物病毒可以用于在神经元细胞和胶质细胞中表达外源基因。在第二个实施例中，使用Z4杆状病毒，在从E20和P1阶段的大鼠幼仔得到的培养皮质细胞中表达外源基因。将E20幼仔的细胞以380,000细胞/孔植板于24孔平皿。将P1幼仔的细胞以300,000细胞/孔植板。植板后6天，用araC(以抑制胶质生长)处理E20培养物，植板后10天将其感染。P1培养物于植板后2天用araC处理，于植板后6天感染。用滴度为2×109pfu/ml的各种稀释度的Z4病毒感染每个培养物的样品。为测定RSV启动子的强度，在独立实验中，用在二个不同启动子下表达lacZ基因的单纯疱疹病毒(HSV)感染所述细胞。在一种情况下，用lacZ基因在RSV启动子控制下的HSV感染细胞。该HSV贮液的滴度是2×107IU/ml，由在PC12细胞上用X-gal组织化学测定。为了对比，用lacZ基因在HSVIE4/5启动子控制下的HSV感染细胞。该病毒的滴度是2×108IU/ml，由在PC12细胞上用X-gal组织化学测定。对于阴性对照，将细胞用PBS模拟感染。通过计数用X-gal对细胞染色时得到的蓝色细胞数，测定外源lacZ基因的表达。本发明的非哺乳动物Z4病毒成功地在从E20和P1发育阶段大鼠幼仔得到的培养皮质细胞中表达了外源lacZ基因。使用1-100μlZ4病毒，4.9-10％的E20阶段的皮质细胞和2.1-5.75％的P1阶段的皮质细胞被X-gal染成蓝色，表明所述外源基因在这些细胞中的表达。用做为阳性对照的0.1-5.0μlHSVRSVlacZ病毒感染的细胞中，1.9-3.4％的E20细胞和0.45-4.2％的P1细胞被X-gal染成蓝色。当用5μl从IE4/5启动子表达lacZ的HSV样品感染所述细胞时，几乎100％的细胞被染成蓝色。当用PBS模拟感染E20或P1皮质细胞时，未检测到蓝色细胞。这些数据提供了非哺乳动物Z4杆状病毒可以用于在皮质细胞中表达外源基因的另一证据。这些数据亦表明，用Z4病毒得到的表达水平与用HSV得到的表达水平相当。杆状病毒介导的基因转移的剂量反应上述组织化学数据表明，将哺乳动物细胞暴露给增加量的病毒时，产生了增加量的β-半乳糖苷酶。为将杆状病毒介导的基因表达的剂量依赖性定量，将HepG2细胞暴露给增加剂量的病毒，并检测β-半乳糖苷酶活性。产生的酶量与以广泛剂量范围内使用的病毒接种物成线性关系(图16)。这提示每个病毒颗粒的进入独立于其它病毒颗粒的进入。在该检测中使用的最大病毒剂量受限于病毒贮液的滴度和体积，使用较高剂量病毒时未观察到表达量的平台。因此，这些数据表明，在实践本发明时，可以通过调节病毒的使用剂量调节表达水平(即，表达外源基因的细胞的百分比)。杆状病毒介导的基因转移的时程将HepG2细胞暴露给RSV-lacZ病毒1小时，然后在不同时间收获细胞，并定量检测β-半乳糖苷酶活性。如图17中所示，最早在暴露给病毒6小时后即检测到β-半乳糖苷酶活性，感染后12-24小时表达达到高峰。如同对游离DNA分子预期的那样，RSV-lacZ盒的表达在后来减退(图17，未给出数据)。感染后12天，通过X-gal染色在少于1/1000细胞中仍然可以检测到LacZ表达(未给出数据)。LacZ的这种表达不是病毒扩散的结果，因为通过Sf21细胞上的噬斑检测测定，感染后10天的HepG2细胞培养上清液的滴度为10pfu/ml。这些数据提示，当本发明用于生产从HepG2细胞纯化的蛋白时，可能最好是在感染细胞后6小时从所述细胞分离所述蛋白。根据所述蛋白的半衰期，可能最好在蛋白表达高峰期后不久分离所述蛋白(即，对于HepG2细胞，感染后约22-26小时(例如，约24小时)后)。可以容易对每种蛋白、病毒和细胞确定最大量分离产生的蛋白的最佳时间。哺乳动物细胞中从头发生表达这些实施例确认了所述外源基因在哺乳动物细胞中从头发生表达。为证明在所述哺乳动物细胞中检测到的报道基因活性不是物理伴随进入所述哺乳动物细胞的AcMNPV病毒体的β-半乳糖苷酶的结果，进行了几个实验，它们证明，观察到的lacZ报道基因表达是β-半乳糖苷酶从头合成的结果。首先，检测RSV-lacZ病毒接种物的β-半乳糖苷酶活性，发现该β-半乳糖苷酶活性水平低于HepG2细胞感染后表达水平的10％。第二，用RSV-lacZ病毒感染HepG2细胞，然后在蛋白合成抑制剂环己酰亚胺的存在下培养。感染后加入环己酰亚胺，将β-半乳糖苷酶活性积累抑制90％以上(表5)。第三，用BacPAK6(Clontech)以相同的moi感染HepG2细胞，BacPAK6是lacZ基因在病毒多角体蛋白启动子而不是RSV启动子控制下的杆状病毒(表5)。后一病毒在该启动子有活性的昆虫细胞中表达极高水平的β-半乳糖苷酶活性(未给出数据)。在哺乳动物细胞中，所述病毒多角体蛋白启动子无活性，含有该启动子的病毒不能在哺乳动物细胞中提供任何酶活性(表5)。与先前杆状病毒与哺乳动物细胞相互作用的研究相反，这些数据证明，在杆状病毒介导的基因转移进入哺乳动物细胞后发生lacZ的从头合成。表5.杆状病毒介导的基因表达从头发生杆状病毒介导的基因转移被lysomotropicagnet抑制为探索杆状病毒在哺乳动物细胞中表达外源基因的机制，检测了基因表达对lysomotropicagnet的敏感性。与其它包膜病毒类似，AcMNPV的芽生形式通常通过胞吞进入细胞，接着通过病毒包膜与内体膜的低pH激发的融合，由此使之进入细胞质(Blissard等，1993，J.Virol.666829-6835；Blissard等，1990，Ann.Rev.ofEntomol.35127-155)。为确定内体酸化作用对杆状病毒介导的基因转移进入哺乳动物细胞是否是必需的，在存在氯喹(lysomotropicagnet)的情况下用RSV-lacZAcMNPV感染HepG2细胞。将HepG2细胞在含有或缺乏抑制剂的培养基中暴露给AcMNPV病毒90分钟，然后除去含有病毒的培养基，如所列出的用含有或缺乏抑制剂的新鲜培养基置换。感染后1天，收获细胞，检测提取物的β-半乳糖苷酶活性和蛋白含量。表中的每个值代表三个独立测定的平均，将不存在抑制剂时由RSV-lacZAcMNPV病毒产生的β-半乳糖苷酶的量做为100％。对每个提取物的蛋白含量将β-半乳糖苷酶活性归一化。当HepG2细胞暴露给所述病毒时以及暴露给病毒后持续存在25μm氯喹时，完全防止了β-半乳糖苷酶的从头表达(表5)。这提示，杆状病毒介导的基因转移依赖于内体酸化。当细胞暴露给病毒90分钟后向细胞加入氯喹时，只观察到部分抑制β-半乳糖苷酶表达。显然，在暴露给病毒的90分钟期间，一部分(≈22％)的病毒颗粒可以通过内体途径进行。丁酸增强杆状病毒介导的基因转移该实施例描述了丁酸增强杆状病毒在哺乳动物细胞中表达外源基因的能力。制备具有不同哺乳动物启动子的5种转移质粒，如图21中所示。使用pSV/BV构建这些载体，pSV/BV是杆状病毒转移质粒pBacPAK9(Clontech)的修饰形式，具有一个改变的多接头和SV40剪接和多聚腺苷酸化信号。通过用NotI限制性酶切pBacPAK9，用T4DNA聚合酶处理产生平端并自连接除去NotI位点，构建pSV/BV。通过将接头pGCGGCCGC连接入SmaI位点，加入一个新的NotI位点。最后，通过用BglII-BamHI消化pRSV珠蛋白的变异体，并将850bp片段插入修饰的BacPAK9的BamHI位点，加入SM40剪接和多聚腺苷酸化信号，产生pSV/BV。从pCMV-EBNA(Invitrogen)的HindIII、BamHI切出人细胞肥大病毒立即早期启动子的758bpHindIII-XbaI片段，并插入pBluescript(SKII+)的HindIII、BamHI位点，产生质粒pCMV-SKII+。然后从CMV-SKII+的XhoI、BamHI位点切出所述启动子，插入pSV/BV的XhoI、BglII位点，产生质粒pCMV/BV。通过用EcoRI酶切pKJ1-neo(Tybulewicz，1991，Cell651153-1163)，制备500bp小鼠磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子，用T4DNA聚合酶产生平端以除去EcoRI位点。通过pfu聚合酶链式反应，使用引物5’ACCGCGGATCCAATACGACTCACTATAG3’(SEQIDNO5)和5’CGGAGATCTGGAAGAGGAGAACAGCGCGGCAG3’(SEQIDNO6)，扩增产生的缺失EcoRI位点的pKJ1质粒。然后用XhoI和BglII消化扩增的PGK启动子，插入pSV/BV的同样位点，产生PKJ1/BV。从pINA(6)的BglII、BamHI切出345bp大鼠β-肌动蛋白启动子，并插入pSV/BV的BglII位点，产生pβ-肌动蛋白/BV。从pGEMA1bSVPA(Zaret等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.859076-9080)的NaeI、NsiI切出2.3kb白蛋白增强子和700bp白蛋白启动子，并插入pSV/BV的SmaI、PstI位点。使用的RSVlacZ转移质粒(本文亦称为Z4病毒)见上述。将3.0kbLacZ盒插入所有构建的质粒的NotI位点(参见图21)。通过将所述杆状病毒转移载体与线性BP6病毒DNA(Clontech)共转染入Sf21细胞，产生重组病毒。通过三轮在Sf21细胞上的噬斑分离和扩增纯化重组病毒。如上述通过超离心浓缩扩增的病毒，通过在Sf21昆虫细胞上的96-孔方法测定滴度(O’Reilly等，杆状病毒表达载体实验手册，W.H.Freeman，NewYork，NY)。以感染复数100用每种重组病毒感染人肝细胞癌细胞系HepG2。在60mm组织培养皿中最终体积为1ml的Eagle极限必需培养基中感染200万细胞。使感染进行2小时，然后将4ml完全培养基加入细胞。在第二系列HepG2感染中，重复第一次感染的条件，除了在感染进行2小时后，用1.5ml的完全培养基将25μl丁酸钠(100mM)加入细胞。做为对照，模拟感染细胞以评价本底β-半乳糖苷酶活性。24小时后收集细胞单层，如上述为比色测定(用ONPG)β-半乳糖苷酶活性做准备。通过胶原蛋白酶灌注分离肝细胞，如前述在大鼠尾胶原蛋白上铺平板(Boyce等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.932348-2352)。变化检测条件(时间和使用的提取物的量)，以使之处于该检测的线性范围内。通过分光光度分析测定产物量，计算β-半乳糖苷酶活性。使用CoomassiePlus蛋白分析(Pierce)确定提取物的蛋白浓度，以对提取物总蛋白含量归一化的β-半乳糖苷酶单位表示结果。对于每个启动子，从酶活性总量减去模拟感染细胞的本底活性量。每个感染进行三份，以平均加标准差表达(表6)。如表6所示，将病毒或哺乳动物细胞启动子加入杆状病毒，使得可以在哺乳动物细胞中表达外源基因。CMV启动子导致最高水平的β-半乳糖苷酶活性，而RSV和β-肌动蛋白产生较低水平的β-半乳糖苷酶活性。在该实施例中使用的病毒moi复数下，白蛋白和PGK启动子在未用丁酸处理的细胞的提取物中未显示高于本底的活性，尽管通过X-gal染色检测到了阳性染色的细胞。感染后向细胞加入丁酸钠，导致所有测试的启动子的可检测水平的β-半乳糖苷酶表达。用丁酸钠处理细胞后，CMV启动子显示β-半乳糖苷酶报道基因表达增加了5倍。用丁酸盐处理后，RSVLTR、白蛋白、pGK1和β-肌动蛋白启动子都导致基因表达增强。在不限于任何特定理论的情况下，推测丁酸钠增强了细胞分化和组蛋白乙酰化，其增强了转录。表6.有或没有丁酸钠时比较各种启动子的强度a以单位/mgβ-半乳糖苷酶表示启动子强度。HepG2细胞中病毒启动子的RNA表达分析使用非哺乳动物细胞病毒在哺乳动物细胞中表达外源基因的一个优点是，由于缺乏适合的宿主细胞因子，所述非哺乳动物病毒启动子在所述哺乳动物细胞中可能无活性。为确定AcMNPV病毒基因是否在HepG2细胞中表达，分析所述病毒的RNA。在这些实验中，以约30的moi用Z4病毒感染HepG2细胞。感染后18小时，收获细胞，从所述细胞提取总细胞RNA。通过RNA印迹分析总细胞RNA中病毒基因的表达。探针包括源自pAcUW1(Pharmingen)的1.7kbpPacI-SalI片段，其含有病毒晚期基因p74以及极迟(超表达)基因p10。使用Z4感染的Sf9昆虫细胞的总细胞RNA做为阳性对照。虽然在对照昆虫细胞中检测到p10和p74的极强的信号，但在Z4感染的HepG2细胞或未感染的对照细胞中未观察到任何信号。使用高敏感性方法逆转录酶-PCR(RT-PCR)的其它实验，提供了大多数病毒基因未在哺乳动物HepG2细胞中转录的进一步的证据。使用从感染后6或24小时的Z4感染的HepG2、未感染的HepG2或感染的Sf9细胞制备的RNA进行RT-PCR分析。以10或100的moi感染HepG2细胞。感染后6小时，在这二种病毒剂量下，在Z4感染的HepG2细胞中未观察到病毒p39、ETL、LEF1、IE1、或IE-N基因的任何RT-PCR产物。与之相反，容易地在Z4感染的Sf9细胞中检测到RT-PCR产物。感染后24小时，在以moi为10感染的HepG2细胞中未检测到这些基因的表达。感染24小时后，在以moi为100感染的HepG2细胞中未检测到病毒p39、ETL或LEF1基因的表达。但是，在此高病毒剂量下，观察到病毒IE1和IE-N基因的低水平表达。不过moi为100下，检测到的低水平表达显著低于昆虫细胞中的表达水平。这些基因的表达可能是因为哺乳动物转录因子识别病毒TATA盒(即，由RNA聚合酶II转录立即早期基因(参见，例如，Hoopes和Rorhman，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.884513-4517)。与立即早期基因相反，由病毒编码的RNA聚合酶转录晚期或极迟病毒基因，该酶不需要TATA盒，在TAAG基元起始转录(O’Reilly等，见上述)。因此，哺乳动物细胞中天然地阻断了病毒晚期或极迟基因的表达。如果需要，使用常规方法通过缺失那些基因，可以阻断所述立即早期基因的表达。某些病毒具有感染肝细胞的固有能力，而其它病毒感染肝细胞可以由诸如细胞表面脱唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)的细胞受体促进。HepG2细胞不同于Sk-Hep-1人肝细胞和NIH3T3小鼠成纤维细胞，因为在细胞表面存在ASGP-R。在某些上述实验中，在少于HepG2细胞的Sk-Hep-1细胞(图14B)或NIH3T3细胞中表达β-半乳糖苷酶。根据X-gal染色细胞的定量计数，HepG2细胞中lacZ基因的表达频率估计比Sk-Hep-1细胞中的表达频率高1000倍。正常肝细胞具有100,000-500,000个ASGP-R，每个受体每天内化多至200个配体。ASGP-R通过提供病毒体上糖蛋白的细胞表面受体，促进所述病毒进入所述细胞。昆虫和哺乳动物细胞的糖基化型式不同，昆虫细胞中产生的病毒体表面的碳水化合物部分缺乏末端唾液酸。那些碳水化合物部分可以介导病毒体的内化和运输。除ASGP-R之外，存在于哺乳动物中的其它半乳糖结合凝集素(参见，例如，Jung等，1994，J.Biochem.(Tokyo)116547-553)可以介导摄取病毒。如果需要，可以修饰欲感染的细胞，以促进所述杆状病毒进入所述细胞。例如，可以在欲用所述病毒(例如，杆状病毒)感染的细胞表面表达ASGP-R。已充隆了编码ASGP-R的基因(Spiess等，1985，J.Biol.Chem.2601979和Spiess等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.826465)，可以使用标准方法(例如，反转录病毒载体、腺伴随病毒载体或腺病毒载体或化学方法)，在欲用病毒感染的细胞中表达ASGP-R。其它合适的哺乳动物凝集素可以替换ASGP-R用于这种方法中(参见，例如，Ashwell等，1982，Ann.Rev.Biochem.51531-534)。亦可以在欲感染的哺乳动物细胞表面表达病毒体上配体的其它受体，例如昆虫碳水化合物受体或HIV的CD4受体，以促进感染(参见，例如，Monsigny等，1979，Biol.Cellulaire33289-300)。亦可以通过例如借助化学手段修饰病毒体促进进入细胞，使病毒体与哺乳动物细胞上的其它受体结合(参见，例如，Neda，等，1991，J.BioI.Chem.26614143-14146和Burns等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.908033-8037)。或者，通过在源自盐泽灯蛾(Estigmenaacrea)的Ea4细胞上生长病毒，可以修饰杆状病毒的糖基化型式和水平(例如，如Rooney等在NatureBiotech中所述)。另外，可以修饰病毒，使得它表达哺乳动物糖基化酶(Jarvis等，1996，NatureBiotech，141288-1292)。II.表达外源基因的非哺乳动物DNA病毒的治疗用途非哺乳动物DNA病毒在几种哺乳动物细胞中有效地表达lacZ报道基因的发现，表明非哺乳动物DNA病毒可以用于在哺乳动物的细胞中治疗性地表达外源基因。例如，本发明的方法可以有助于在患者的细胞中表达外源基因，以治疗由基因表达缺陷引起的疾病。已知许多疾病由单基因缺陷引起(参见表7)，已鉴别和充隆了许多涉及基因缺陷疾病的基因。使用标准克隆技术(参见，例如，Ausubel等，分子生物学现行方法，JohnWiley&amp;Sons，(1989))，可以工程改造非哺乳动物病毒以在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中表达所需外源基因。表7.可以用本发明治疗的疾病实例和可以用本发明生产的基因产物的实例基因产物疾病延胡索酰乙酰乙酸水解酶遗传性酪氨酸血症苯丙氨酸羟化酶苯酮尿症LDL受体家族性高胆固醇血症α-1抗胰蛋白酶α-1抗胰蛋白酶缺乏症葡萄糖-6-磷酸酶糖原储积病胆色素原脱氨基酶由卟啉代谢错误引起的疾病，例如急性间歇性血卟啉病CPS-I，OTC，AS，ASL或精氨酸酶尿素循环紊乱因子VIII和IX血友病Cystathioneβ-合酶高胱氨酸尿支链酮酸脱羧酶械糖尿病白蛋白血清蛋白减少异戊酰-辅酶A脱氢酶异戊酸血症丙酰辅酶A羧化酶丙酸血甲基丙二酰辅酶A变位酶甲基丙二酸血症戊二酰辅酶A脱氢酶戊二酸血胰岛素胰岛素依赖性糖尿病β-萄糖苷酶戈谢病丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶缺乏肝磷酸化酶或磷酸化酶激酶糖原储积病甘氨酸脱羧酶，H-蛋白，或T-蛋白非-ketotic高甘氨酸血症Wilson病铜运输ATP酶Wilson病Menkes病铜运输ATP酶Menkes病囊性纤维化跨膜传导调节蛋白囊性纤维化</table></tables>本发明亦可以用于促进所需基因在没有明显缺陷的细胞中表达。例如，本发明可以用于在患者的肝细胞中表达胰岛素，为所述患者在机体内提供胰岛素。可以在哺乳动物细胞(例如，肝细胞)中表达以传递入所述哺乳动物的系统循环的蛋白质的其它实例，包括激素、生长因子和干扰素。本发明亦可以用于在细胞中表达调节基因或编码转录因子的基因(例如，VP16-tet阻抑物基因融合物)，以控制另一基因的表达(例如，可操作地连接至tet操纵基因序列的基因；参见，例如，Gossen等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.895547-5551)。另外，本发明可以用于通过在细胞中表达癌症治疗基因治疗癌症的方法中，所述治疗基因诸如编码肿瘤抑制因子(例如，p53)、肿瘤坏死因子、胸苷激酶、白喉毒素嵌合体或胞苷脱氨酶的基因(参见，例如，Vile和Russel，1994，GeneThreapy188-98)。其它有用的基因产物包括用于基于RNA引诱物、反义或核酶的抑制基因表达的方法(参见，例如，Yu等，GeneTherapy113-26)。如果需要，本发明可以用于表达诸如胞苷脱氨酶的、其产物将改变药物或药物前体诸如5-氟胞嘧啶在细胞中的活性的基因(参见，例如，Harris等，1994，Genetherapy1170-175)。可以使用诸如使用核酶、反义RNA、反式显性阻抑物聚合酶突变体、或核心抗原突变体或表面抗原突变体的方法，抑制细胞中的肝炎病毒(例如，甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或丁型肝炎病毒)。通过用受影响基因的正常型式处理，亦可以用本发明治疗诸如家族性血色病的其它疾病。优选表达的基因包括编码在正常哺乳动物细胞(例如，肝细胞或肺细胞)中表达的蛋白的那些基因。例如，可以用于本方法的有编码参与尿素循环的酶的基因，例如编码氨甲酰磷酸合成酶(CPS-I)、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)、精氨琥珀酸合成酶(AS)、精氨琥珀酸裂解酶(ASL)和精氨酸酶。这些基因均已被克隆(关于OTC，参见Horwich等，1984，Science2241068-1074和Hata等，1988，J.Biochem(Tokyo)103302-308；关于AS，参见Bock等，1983，Nucl.AcidsRes.116505；Surh等，1988，Nucl.AcidsRes.169252；和Dennis等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.867947；关于ASL，参见O’Brien等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.837211；关于CPS-I，参见Adcock等，1984，(摘要)Fed.Proc.431726；关于精氨酸酶，参见Haraguchi等，Proc.Natl.Acad.Sci.84412)。使用常用技术可以容易地完成将这些基因亚克隆入杆状病毒。通过监视患者疾病的已知症候和症状，可以评价在细胞中表达外源基因的治疗效力。例如，通过监视血浆铵或乳清酸水平可以检测OTC缺乏和CPS缺乏的减轻。类似地，血浆瓜氨酸水平提供AS缺乏的指标，通过监视血浆精氨琥珀酸水平可以追踪ASL缺乏。评价治疗方法的参数对医学领域技术人员是已知的(参见，例如，Maestri等，1991，J.Pediatrics，119923-928)。通过与用于给予哺乳动物的药学上可接受的无毒赋形剂或载体(例如，盐水)混合，可以将非哺乳动物DNA病毒(例如，杆状病毒)配制成为药用组合物。在实践本发明时，可以制备所述病毒用于肠胃外给予(例如，用于静脉注射(例如，注入门静脉))、动脉内注射(例如，注入股动脉或肝动脉)、腹膜内注射、鞘内注射或直接注射入组织或器官(例如，肌内注射)。特别是，所述非哺乳动物病毒可以以常规赋形剂中的液体溶液或悬浮液的形式制备。所述病毒亦可以制备用于鼻内或支气管内给予，特别是以常规赋形剂中的滴鼻剂或气溶胶形式。如果需要，可以超声处理所述病毒，以在最大程度地降低制备病毒中所述病毒凝集。在实践本发明时，可以使用所述病毒在欲治疗的哺乳动物之外感染细胞(例如，供体哺乳动物中的细胞或体外细胞)，然后将受感染的细胞给予欲治疗的哺乳动物。在该方法中，所述细胞可以是欲治疗的哺乳动物自体的或异体的。例如，可以使用肝活检中得到的自体肝细胞(参见，例如，Grossman等，1994，NatureGenetics6335)。然后可以将所述细胞通过注射(例如，注入门静脉)给予所述患者。在这种方法中，最好肝细胞体积为整个肝脏体积的约1％-10％。当本发明用于在肝细胞中表达外源基因时，可以将所述肝细胞传递给脾脏，所述细胞可以接着在体内迁移至肝脏(参见，例如，Lu等，1995，Hepatology217752-759)。如果需要，通过使用将液体灌注入器官、细胞或组织的常规技术(包括使用输注泵和注射器)，可以将所述病毒传递给细胞。对于灌注，一般在1分钟至6小时的时间范围内，以1-500ml的体积中的1×106-1×1010pfu/ml(最好是1×109-1×1010pfu/ml)的滴度给予所述病毒。如果需要，可以在几天内静脉内将多剂量的所述病毒给予患者，以增加所需要的表达水平。给予哺乳动物的病毒的最佳量或受感染细胞的最佳数目以及给予的频率，取决于诸如检测外源基因表达的方法的敏感性、使用的启动子的强度、欲治疗的疾病的严重性和所述病毒的靶细胞等因素。一般地，以约0.1-1,000的感染复数给予所述病毒；优选感染复数是约5-100；更优选感染复数是10-50。III.使用非哺乳动物病毒体内表达外源基因的实施例以下的实施例证明，非哺乳动物DNA病毒可以用于体内在细胞中表达外源基因。这些实施例亦证明，通过静脉内注射、鼻内给予或将所述病毒直接注射入靶组织给予所述病毒，可以达到体内基因表达。第一个实施例证明体内在大脑细胞中表达外源基因。第二个实施例提供了在静脉内注射所述病毒后在肝脏表达外源基因的证据。在第三个实施例中，在向受伤的皮肤局部使用Z4病毒后，在皮肤内检测到所述外源基因的表达。在余下的实施例中，将携带外源基因的病毒直接注射入器官。这些实施例证明外源基因在皮肤、肝脏、脾脏、肾脏、胃、骨骼肌、子宫和胰脏中的体内表达。注射入门静脉对于第一个实施例，将0.5ml的Z4病毒(≈1.4×109pfu/ml)注射(速率≈1ml/min)进入单只大鼠的门静脉。感染后约72小时，在用常规组织化学方法检测的冰冻切片的至少一个肝细胞中检测到lacZ表达。通过以下程序的任何一种或其组合可以提高表达效率(1)用生长因子预先处理所述动物；(2)部分肝切除，(3)给予免疫抑制剂以抑制对所述病毒的任何免疫应答；(4)使用较高滴度或剂量的病毒；(5)通过外科手术灌注，将所述病毒输注至肝脏(例如，为限制所述病毒与红细胞的可能的非特异性结合)；和/或(6)超声处理病毒以最大限度地降低所述病毒凝集。大脑中的表达对于第二个实施例，使用sterotactic程序，将2μl的Z4病毒样品(滴度为4.8×1010pfu/ml)注射入麻醉的成年大鼠大脑的嗅球。缓慢地注射所述病毒(超过30分钟)，以避免压迫大脑组织。注射后1天，将所述大鼠无痛致死，处理大脑组织以通过X-gal组织化学检测外源lacZ基因的表达。将Z4病毒注射入大脑导致体内lacZ表达，强烈地染成蓝色的细胞块提供了证据。在注射约107pfu时，超过104细胞被染成蓝色。这些数据由此表明，通过将其基因组包括所述外源基因的非哺乳动物DNA病毒注射入大脑，可以在哺乳动物的大脑中表达外源基因。局部使用和在皮肤中的表达该实施例证明，向小鼠刮擦的皮肤局部使用所述Z4病毒，可以导致在所述皮肤中表达异源基因。这些实验涉及小鼠皮肤上四种不同处理的区。二个区(一个刮擦区和一个未刮擦区)用磷酸缓冲盐水处理。另外二个区(一个刮擦区和一个未刮擦区)用所述Z4病毒处理(50μl，4.8×1010pfu/ml)。处理后，使用恒冷箱切片机将每个皮肤区切成切片。向小鼠受伤的皮肤局部使用所述Z4病毒(50μl，4.8×1010pfu/ml)，导致所述外源基因在表皮基底层的几乎100％的细胞中表达。未检测到较深层结构的染色。在一个恒冷箱切片中，表皮的各种区在多个区域中被染色。在第二个恒冷箱切片中，偶然存在蓝色细胞。在第三个恒冷箱切片中，检测到染色斑，在第四个恒冷箱切片中，染色几乎是连续的且非常深。尽管从皮肤的这个区域得到的四个恒冷箱切片之间基因表达的型式略有不同，但该实施例证明，向刮擦的皮肤局部使用所述Z4病毒，一致地导致所述异源基因在皮肤中表达。注射入组织或器官在以下实施例中，在将携带外源基因的非哺乳动物DNA病毒直接注射入四种不同的器官后，体内检测到该基因的表达。对于这些实施例，从1升Z4感染的(moi为0.5)、在无血清培养基的旋动培养中生长的Sf9细胞制备所述Z4病毒。通过将所述细胞培养物于2000rpm离心10分钟除去细胞和碎片。通过蔗糖垫层在SW28转头中以24,000rpm离心75分钟，沉淀所述病毒。为制备该病毒贮液，将33ml澄清的病毒在3ml蔗糖垫层(10mMTris-HCl(pH7.5)、1mMEDTA(TE)中的27％蔗糖(w/v))上铺层。通过于4℃在0.3mlTE/管中温育过夜，再悬浮所述病毒。通过在SW41管中的20-60％蔗糖(TE中的w/v)梯度中于38,000rpm离心75分钟形成区带，纯化所述病毒。用注射器收集所述病毒区带，在SW50.1转头中于30,000rpm离心60分钟，沉淀所述病毒。在总共0.7mlPBS中通过于4℃温育过夜再悬浮所述病毒沉淀。由常规噬斑检测测定，所述浓缩Z4贮液的滴度是4.8×1010pfu/ml。为检测体内基因表达，通过直接注射50μl等分的浓缩病毒(总共2.4×109pfu)进入小鼠的或者肝脏、脾脏、肾脏、肌肉、子宫、胰脏或者皮肤，将Z4病毒给予Balb/c雌性小鼠。给予肝脏、脾脏和肾脏时需要手术。为使所述病毒传播到整个器官，将50μl病毒样品注射入器官中的二个或三个位点。使用50μl的PBS样品做为阴性对照。为检测肝脏中的基因表达，仅在肝脏的一叶注射，将接受PBS注射的独立的小鼠做为阴性对照。为检测脾脏中的基因表达，将未注射的小鼠做为阴性对照。为检测肾脏、肌肉和皮肤中的基因表达，进行对侧对照(将Z4病毒注射入右边器官，将PBS注射入所述左边器官)。为检测肌肉中的表达，在给小鼠剃毛后将所述病毒注射入胫骨后腿前肌(tibealisanteriorhindlegmuscle)。为检测皮肤中的表达，将小鼠的腹部剃毛，将50μl的Z4病毒注射入腹部的标记区。注射后24小时，处死小鼠并进行解剖。将Z4和PBS注射的器官在液氮中冷冻，使用恒冷箱切片机(Reichert-JungCryocut1800)制备7μm的薄切片。如上述通过固定所述薄切片并用X-gal染色，测定β-半乳糖苷酶活性。接受Z4病毒的每个器官都在体内表达外源lacZ基因。在每种情况下，PBS阴性对照未启动所述外源基因的表达。皮肤中注射和表达在该实施例中，在2.4×109pfu注射入皮肤后，在小鼠皮肤中观察到Z4的外源lacZ基因的体内表达。皮下注射所述病毒后，在真皮中达到高水平表达(注射区内超过25％的细胞)。尽管肌肉层基本上未染色，但观察到一些骨骼肌纤维的阳性染色。做为阴性对照，将PBS注射入皮肤。尽管在皮脂腺中观察到一些染色，但它很可能是由于存在细菌。亦在真皮中检测到低水平染色。当将所述Z4病毒局部使用于未受伤(未刮擦)的皮肤时，获得类似的结果，尽管未检测到清晰的表皮染色。不过，这些数据表明，当将Z4病毒皮下注射入所述哺乳动物时，可以使用所述病毒在哺乳动物皮肤中表达异源基因。肝脏中的表达在该实施例中，在肝脏中检测到所述外源基因的表达。在受注射的叶的多个区域中检测到做为β-半乳糖苷酶表达指示的蓝色。尽管最深的颜色在注射点，但所述肝区的内部区域展示出基因表达指示的蓝色。看来在接受所述Z4病毒的叶的肝细胞和肝巨噬细胞中都检测到所述外源基因的表达。与之相反，同一肝脏的未注射叶是阴性的。这些结果由此表明，通过将编码外源基因的非哺乳动物DNA病毒注射入肝脏，可以在肝细胞中表达所述基因。脾脏中的表达在该实施例中，在将携带所述外源基因的病毒注射入脾脏后，检测脾脏薄切片的基因表达。接受Z4病毒的脾细胞体内表达了lacZ基因。在位于整个脾脏的细胞中都检测到蓝色。用脾细胞得到的蓝色深度低于用肝细胞得到的深度。然而，蓝色是所述外源基因显著表达的指示。在未接受所述病毒的脾脏中未检测到蓝色。这些数据由此表明，在将其基因组携带外源基因的非哺乳动物DNA病毒注射后，可以体内在脾细胞中表达所述基因。肾脏中的表达在该实施例中，在如上述用Z4注射的肾脏中检测到外源基因的体内表达。注射了Z4的肾脏显示了指示lacZ表达的清晰的蓝色；与之相反，注射了PBS的对照肾脏未显示蓝色。蓝色主要在所述肾脏的切片边缘。间接免疫荧光亦表明。病毒颗粒集中在所述切片的边缘，提供了基因表达与所述病毒定位的对应关系。这些数据由此表明，可以使用非哺乳动物DNA病毒在肾脏细胞中体内表达外源基因。胃中的表达在该实施例中，将Z4病毒(50μl)注射入Balb/c小鼠胃的中央。注射后次日处死动物，将胃在液氮中冷冻，如前述进行恒冷箱切片和固定(stated)。在胃粘膜和肌肉细胞中观察到细胞转染。在腺体中检测到阳性染色，大多数染色发生在腺体的基部。这些观察表明，可以使用非哺乳动物DNA病毒在小鼠的胃部表达异源基因。在这些实验中，亦在腔中检测到蓝色。在此特定区域的蓝色可能由肠中的细菌引起，而不是由所述病毒的表达引起。骨骼肌中的表达在该实施例中，在将病毒直接注射入胫骨前肌后，在肌肉中检测到Z4的外源lacZ基因的体内表达。仅在肌肉内的分离位点发现蓝色，颜色的深度或分布不如在肝脏、脾脏或皮肤中观察到的颜色。不过，蓝色是显著的，表明可以使用非哺乳动物DNA病毒在肌肉中体内表达外源基因。子宫中的表达在该实施例中，在子宫中检测到lacZ报道基因的表达。将50μl等分的所述Z4病毒(2.4×109pfu)直接注射入小鼠的子宫。注射后次日处死动物，如前述制备恒冷箱切片。用X-gal染色所述切片，在几乎没有组织破坏的情况下，在子宫一个区域产生蓝色。阳性细胞大多数是子宫内膜基质细胞，而不是腺体成份。这些数据表明，可以使用非哺乳动物DNA病毒在哺乳动物的子宫中表达异源基因。胰脏中的表达该实施例证明，可以使用非哺乳动物DNA病毒在哺乳动物胰脏中表达异源基因。将50μl等分的所述Z4病毒(2.4×109pfu)直接注射入小鼠胰脏。注射后次日，处死小鼠，将胰脏用X-gal按照常规方法染色。检测到大面积的阳性细胞，表明所述Z4病毒成功地在所述胰脏中表达了lacZ基因。概要总之，这些实施例证明，可以使用非哺乳动物DNA病毒(例如，杆状病毒)，体内在哺乳动物细胞内表达外源基因。这些实施例使用了几种独特的动物模型系统和给予所述病毒的方法。在每种和所有情况下，所述非哺乳动物DNA病毒均成功地在体内表达了所述外源基因。这些数据由此为非哺乳动物DNA病毒可以用于在体内在其它未举例的细胞中表达外源基因的主张提供了支持。另外，在至少一些组织中，体内表达的水平令人惊异的高于从对应的体外实验预期的水平(例如，大脑与培养神经元对比)。所有的这些实施例都为本发明的体内应用提供了证据。B部分改变的外壳蛋白增强非哺乳动物DNA病毒在哺乳动物细胞中表达外源基因的能力因为已证明可以使用非哺乳动物DNA病毒在哺乳动物细胞中表达外源基因，所以提供以下实施例证明，改变的外壳蛋白增强所述非哺乳动物DNA病毒在哺乳动物细胞中表达所述外源基因的能力。构建杆状病毒转移质粒pVGZ3这些实施例使用的杆状病毒已被工程改造，表达做为改变的外壳蛋白的疱疹性口腔炎病毒糖蛋白G(VSV-G)。杆状病毒转移质粒pVGZ3是在以上概述的许多实施例中使用的杆状病毒转移质粒Z4的衍生物。通过将编码VSV-G和报道基因lacZ的表达盒插入杆状病毒转移载体BacPAK9(Clontech；PaloAlto，CA)，构建杆状病毒转移质粒pVGZ3。为制备此转移质粒，从pLGRNL(Burns，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.908033-8037)切出做为l,665bpBamHI片段的编码VSV-G的cDNA。将产生的质粒命名为VSVG/BP9(图18)。使用BglII和BamHI从Z4转移质粒切出RSVLTR、lacZ基因和SV40多聚腺苷酸化信号，产生4,672bp片段。将此片段插入VSVG/BP9的BglII位点，使得lacZ基因定位于VSV-G基因下游，以产生VGZ3转移质粒(图19)。在VGZ3中，VSV-G和lacZ基因的转录方向是会聚的。换言之，启动子位于所述插入序列的相对端，使得lacZ和VSV-G基因朝对方方向转录。SV40多聚A位点是双向的，VSV-G和lacZ基因都使用该SV40多聚A位点。由于此转移质粒中的VSV-G基因可操作地连接至杆状病毒多角体蛋白启动子，因此所述质粒提供了在昆虫细胞中高水平表达VSV-G基因和在哺乳动物细胞中相对低水平表达的优点。改变的外壳蛋白的表达型式是需要的，因为在昆虫细胞中有效地产生所述改变的外壳蛋白，在此在将所述病毒传递给哺乳动物细胞之前产生具有蛋白的非哺乳动物DNA病毒。在使用所述病毒感染哺乳动物细胞之前，在昆虫细胞中产生所述病毒消除了在哺乳动物细胞中表达病毒外壳蛋白(例如，VSV-G)的忧虑。在图20中提供了具有改变的外壳蛋白的芽生病毒的图解说明。一旦所述病毒感染哺乳动物细胞，则不需要表达改变的外壳蛋白。因此，最好使用在哺乳动物细胞中无活性的非哺乳动物(例如，昆虫)病毒启动子驱动改变的外壳蛋白表达。与之相反，将目的外源基因(例如，lacZ报道基因)可操作地连接至RSVLTR。正如所需要的，在昆虫细胞和哺乳动物细胞中都可以得到由RSVLTR驱动的基因表达。使用标准程序从上述pVGZ3转移质粒产生重组杆状病毒VGZ3。简言之，按照制造商说明书，通过用pVGZ3和已用Bsu36I消化的杆状病毒基因组DNABacPAK6(Clontech；PaloAlto，CA)脂转染，共转染Sf9细胞。噬斑纯化所述病毒，按照标准技术扩增。使用Sf9细胞上的常规噬斑测定，测定病毒滴度为3.1×107pfu/ml。在HepG2、Vero和HeLa细胞中的增强表达该实施例证明，相对于上述Z4病毒而言，具有改变的外壳蛋白的杆状病毒VGZ3具有在哺乳动物细胞中表达外源基因的增强能力。为提供检测中的敏感性，在Z4病毒以相对低水平表达外源基因的条件下进行这些实验。使用了三种不同细胞类型，包括HepG2细胞、Vero细胞(肾细胞系)和HeLa细胞(宫颈癌细胞系)。在这些实验中，将每种细胞类型的1×105细胞独立地接种入12孔培养板的多个孔中。次日，用新鲜培养基更换该组织培养基，向细胞独立地加入Z4和VGZ3病毒。以0、1.25、10和80的感染复数使用病毒(假设过夜后细胞数目加倍)，双份进行每个实验。加入病毒后次日，收获细胞，通过X-gal染色或通过使用定量化学发光β-半乳糖苷酶测定(Clontech；PaloAlto，CA)，检测外源lacZ基因的表达。将这些检测的结果示于表8中。表8.使用具有改变的外壳蛋白的非哺乳动物DNA病毒达到外源基因在HepG2和HeLa细胞中的增强表达a以每种细胞类型的VGZ3转导单位÷Z4转导单位计算优越性。b0.02是化学发光测定中的本底水平c在确定VGZ3优越性时考虑moi的差异(VGZ3为1.25，Z4为80)。该实施例证明，相对于缺乏所述改变的外壳蛋白的杆状病毒，被工程改造以表达VSV糖蛋白G的杆状病毒具有在哺乳动物细胞中增强表达外源基因的能力。在该实施例中，在100％的用moi为80的VGZ3接触的HepG2细胞中，检测到外源lacZ基因的表达。与之相反，在这些条件下，只有15％的用Z4病毒(不具有改变的外壳蛋白的病毒)接触的细胞中检测到外源基因的表达。因此，这些数据显示，改变的外壳蛋白增强病毒在哺乳动物细胞中表达外源基因的能力。使用Vero细胞亦达到了所述外源基因的增强表达用X-gal染色时，超过50％的用VGZ3处理的细胞变为蓝色，而只有5-10％的用Z4处理的细胞变为蓝色。改变的外壳蛋白增强病毒在哺乳动物细胞中表达外源基因的能力的进一步证据，来自使用HeLa细胞的相对敏感的测定。在该实施例使用的条件下，Z4病毒在HeLa细胞中未能有效地表达外源基因。在moi为80时未检测到蓝色细胞，表明基因表达的频率低于1×105。与之相反，约3％的用VGZ3病毒处理的HeLa细胞是蓝色，表明基因表达的效率是3×10-2，比用Z4得到的效率好12,000倍。使用VGZ3病毒时，在1.25的低moi时亦检测到蓝色HeLa细胞，而用Z4病毒时在同一moi时未检测到蓝色细胞。总之，这些数据表明，非哺乳动物DNA病毒上改变的外壳蛋白可以增强所述病毒感染哺乳动物细胞并在哺乳动物细胞中表达基因的能力。另外，使用改变的外壳蛋白使得以较低的moi感染细胞。因此某些看来耐受给定感染复数的病毒的细胞(例如，HeLa细胞)可以用具有改变的外壳蛋白的病毒感染，由此扩展病毒的表观宿主范围。具有改变的外壳蛋白的病毒由此提供的优点是，相对于缺乏改变的外壳蛋白的病毒需要的感染复数，允许在低感染复数下外源基因的表达。如以上对Z4病毒所述，用VGZ3病毒处理的细胞中外源基因的表达是所述哺乳动物细胞内的基因从头表达的结果。抑制蛋白合成的环己酰亚胺和抑制抑制内体酸化作用的氯喹都独立地抑制VGZ3处理的哺乳动物细胞中β-半乳糖苷酶表达(未给出数据)。因此，这些实验中在所述哺乳动物细胞中检测到的β-半乳糖苷酶可以归因于所述哺乳动物细胞内的蛋白从合成。PC12细胞中的增强表达在该实施例中，相对于用Z4病毒得到的水平而言，VGZ3病毒显示提高大鼠皮质神经元细胞中外源基因表达的水平。使用常规方法，将PC12细胞以10,000细胞/孔植板于24孔平皿中。第一天，用亦含有50ng/ml神经生长因子(NGF)的新鲜细胞培养基置换该细胞培养基(含有5％FBS和10％马血清的DMEM)。在第3天和第5天，再次加入含有NGF的新鲜培养基。在第6天，用各种稀释度的Z4病毒和VGZ3病毒感染所述细胞，如表9中所示。在第7天时，固定细胞，用抗β-半乳糖苷酶抗体(可从5’-＞3’Inc.得到)通过免疫细胞化学进行β-半乳糖苷酶染色。在这些条件下，少于1％的用2×108pfuZ4感染的PC12细胞表达所述外源基因，约17.5％的用1×107pfuVGZ3感染的细胞表达所述外源基因。因此，这些数据提供了具有改变的外壳蛋白的病毒具有在哺乳动物细胞中表达外源基因的优越能力的额外证据。在大鼠初级皮质细胞中的增强表达该实施例证明，与缺乏改变的外壳蛋白的病毒相比，具有改变的外壳蛋白的病毒提供了在大鼠皮质细胞初级培养物中外源基因的增强表达。对于该实施例，如上述“皮质培养物中的表达”中制备和感染大鼠皮质细胞培养物。在表9中所示的moi下使用Z4和VGZ3病毒(注Z4的moi约比VGZ3的moi高10倍)。当将得到的蓝色细胞数目与使用的Z4或VGZ3的moi相比较时，VGZ3病毒明显地比Z4病毒更有效地在哺乳动物细胞中表达所述外源基因。另外，该实施例证明，具有改变的外壳蛋白的非哺乳动物DNA病毒可以指导大鼠初级神经元中的外源基因表达(除以上所示细胞系PC12之外)。表9.使用具有改变的外壳蛋白的非哺乳动物DNA病毒达到外源基因在大鼠皮质细胞初级培养物中的增强表达a基于感染前1天植板的细胞数目估计moi。b由于在此孔发生细胞死亡，因此检测到较少的染色细胞。不过，蓝色细胞的百分比很高。HepG2、HuH7、HeLa、WISH、A549、VERO、CHO和Balb/c3T3细胞中的增强表达该实施例提供了进一步的数据，表明改变的外壳蛋白增强非哺乳动物DNA病毒指导哺乳动物细胞中外源基因表达的能力。在此，用VGZ3杆状病毒感染各种细胞。首先描述在这些实验中使用的方法。细胞从ATCC得到人肝细胞癌系HepG2和HuH7、人子宫颈癌细胞株HeLa、人羊膜细胞系WISH、人肺癌A549、非洲绿猴肾细胞系VERO、仓鼠上皮细胞系CHO和小鼠胚胎成纤维细胞系Balb/c3T3。所有的哺乳动物细胞均在含有10％胎牛血清和4mM谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)的Dulbecco改良Eagle培养基(GibcoBRL，GrandIsland，NY)中生长，除了WISH细胞之外，WISH在含有Hank盐、20％胎牛血清和4mM谷氨酰胺的MEM(GibcoBRL)中生长。感染和报道基因的检测以2×105细胞/孔在12孔板中接种细胞。在细胞粘附至塑料后，用培养基漂洗细胞，加入新鲜的完全培养基。以标明的感染复数(moi)向培养基中加入病毒，进行病毒感染。于37℃在50％CO2中培养18-24小时后，用X-gal染色细胞，以显示表达β-半乳糖苷酶的细胞，或者取出细胞裂解液，按照制造商说明书，通过发光β-半乳糖苷酶检测(Clontech目录号#K2048-1)定量测定β-半乳糖苷酶活性。结果与用Z4病毒得到的基因表达水平相比较，使用VGZ3病毒增强外源基因表达。培养物中的感染细胞的X-gal染色表明，与用Z4病毒(未给出数据)相比，用VGZ3感染后，表达所述外源基因的HepG2细胞百分比约高10倍。另外，VGZ3处理的细胞中蓝色染色较深，提示VGZ3感染的细胞中基因表达水平较高。当使用VGZ3病毒感染HeLa细胞时，亦检测到增强的基因表达。当moi为100时，Z4病毒每孔产生了很少的蓝色细胞(约1-5个细胞)，而约10％的VGZ3细胞被X-gal染成蓝色。在图22中显示了β-半乳糖苷酶表达的定量检测的结果。在测试的每个moi下，用VGZ3处理的HepG2细胞中的β-半乳糖苷酶表达水平约比用Z4病毒得到水平高10倍。在HeLa细胞中，Z4病毒和VGZ3病毒之间的转导效率的差异更加明显。在moi为1或10时，用Z4病毒未检测到超过本底水平的β-半乳糖苷酶活性。与之相反，使用moi为1的VGZ3处理的HeLa细胞中可以检测到β-半乳糖苷酶活性。当以moi为100使用Z4病毒时，检测到刚刚超出本底水平的β-半乳糖苷酶活性。当以moi为100使用VGZ3病毒时，在HeLa细胞中检测到的β-半乳糖苷酶活性水平约比Z4处理的细胞中检测到的水平高约350倍。使用一组8个不同细胞系比较moi为50时Z4和VG23病毒的转导效率。在此低moi下，如表10中所示，在用Z4病毒处理的某些细胞系中未检测到外源基因表达。与之相反，在moi为50时，VGZ3病毒导致在所有的细胞系中可检测水平的外源基因表达。总之，这些数据提供了改变的外壳蛋白增强非哺乳动物DNA病毒的外源基因表达的进一步证据。表10.Z4和VGZ3处理的细胞中的β-半乳糖苷酶活性β-半乳糖苷酶活性aa对于每个细胞系，测定未感染细胞中的β-半乳糖苷酶活性，从Z4处理的和VGZ3处理的细胞中的β-半乳糖苷酶活性的原始值中减去此值。每个数据点代表三个样本的平均值。b在moi为50下进行所有的Z4和VGZ3处理。其它实施方案可以将除了以上描述的苜蓿银纹夜蛾病毒之外的非哺乳动物病毒用于本发明；这类病毒列于表1。最好使用核型多角体病毒，例如多核壳病毒(MNPV)或单核壳病毒(SNPV)。特别是可以使用云杉卷叶蛾MNPV、甘蓝夜蛾MNPV、油桐尺蠖核型多角体病毒、花旗松毒蛾MNPV、家蚕SNPV、美洲棉铃虫SNPV和甘兰尺蠖SNPV。诸如以下病毒的颗粒症病毒(GV)亦属于可以用于本发明的那些病毒CryptophlebialeucotretaGV、印度谷螟GV、甘兰尺蠖GV、甘兰菜粉蝶GV、菜粉蝶GV和苹蠹蛾颗粒症病毒(CpGV)。亦可以使用非包含体杆状病毒(NOB)，例如美洲棉铃虫NOB和榔二庞独角仙病毒。其它昆虫(例如，鳞翅目)和甲壳动物病毒亦可以用于本发明。有用的病毒的其它实例包括感染真菌(例如，Strongwellseamagna)和蜘蛛的那些病毒。已从螨、甲壳纲(例如，Carcinusmaenus，蓝蟹，对虾的黄头杆状病毒，和Penaeusmonodon-类型杆状病毒)和鞘翅目分离出与杆状病毒类似的病毒。舞毒蛾杆状病毒亦可以用于本发明。如果需要，可以工程改造所述病毒，以促进所述病毒导向某些细胞类型。例如，可以在病毒体的表面表达与除了ASGP-R之外的细胞表面受体结合的配体。或者，可以化学修饰所述病毒，以将所述病毒导向特定受体。如果需要，可以首先刺激欲感染的细胞，使之有丝分裂活跃。在培养中，可以使用诸如氯仿的药剂达到这种效果；在体内，例如通过部分肝切除可以诱导刺激肝细胞分裂(参见，例如，Wilson，等，1992，.J.Biol.Chem.26711283-11489)。可选地，可以工程改造病毒基因组，使之携带单纯疱疹病毒胸苷激酶基因；这将使得包含所述病毒基因组的细胞被丙氧鸟苷杀伤。如果需要，可以工程改造病毒，使得其在其天然非哺乳动物宿主细胞(例如，昆虫细胞)上生长方面有缺陷。这种病毒株可以提供额外的安全，可以在互补包装系上繁殖。例如，可以制备缺陷型杆状病毒，其中缺失诸如IE1的立即早期基因。通过酵母或大肠杆菌中的定向重组，可以产生这种缺失，可以在其中以反式提供IE1基因产物的昆虫细胞中复制所述缺陷型病毒。如果需要，可以用神经氨酸酶处理所述病毒，以在感染前显露额外的末端半乳糖残基(参见，例如，Morell等，1971，J.Biol.Chem.2461461-1467)。权利要求1.在哺乳动物细胞中表达外源基因的方法，所述方法包括a)将非哺乳动物DNA病毒导入所述细胞，其中所述病毒具有改变的外壳蛋白，所述病毒的基因组包含在所述细胞中诱导所述外源基因表达的启动子控制下的外源基因；和b)在使得所述外源基因表达的条件下保持所述细胞。2.权利要求1的方法，其中所述无脊椎动物病毒是昆虫病毒。3.权利要求2的方法，其中所述昆虫病毒是杆状病毒。4.权利要求3的方法，其中所述杆状病毒是苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒。5.在哺乳动物中治疗疾病的方法，包括a)将治疗有效量的非哺乳动物DNA病毒导入细胞，产生受感染细胞，其中所述病毒具有改变的外壳蛋白，并且所述病毒的基因组包含外源基因；和b)在使得所述外源基因在所述哺乳动物中表达的条件下保持所述受感染细胞。6.权利要求5的方法，其中所述改变的外壳蛋白包含哺乳动物病毒的外壳蛋白。7.权利要求5的方法，其中所述改变的外壳蛋白是融合蛋白。8.权利要求5的方法，其中所述病毒是昆虫病毒。9.权利要求8的方法，其中所述昆虫病毒是杆状病毒。10.在哺乳动物中治疗癌症的方法，所述方法包括a)将具有改变的外壳蛋白的非哺乳动物DNA病毒导入所述哺乳动物的癌性细胞，产生受感染细胞，其中所述病毒的基因组包含编码选自肿瘤坏死因子、p53、胸苷激酶、白喉毒素嵌合体和胞苷脱氨酶的蛋白质的癌症治疗基因；和b)在使得所述癌症治疗基因表达的条件下在所述哺乳动物中保持所述受感染细胞。11.权利要求10的方法，其中所述改变的外壳蛋白包含哺乳动物病毒的外壳蛋白。12.权利要求10的方法，其中所述改变的外壳蛋白包含融合蛋白。13.权利要求10的方法，其中所述癌性细胞选自肝细胞、胰脏细胞、肺细胞、甲状腺细胞、胸腺细胞、前列腺组织细胞、乳腺组织细胞、大脑细胞、神经元细胞、胶质细胞、皮肤细胞、脾细胞、肌肉细胞、肾细胞和膀胱细胞。14.权利要求10的方法，其中所述非哺乳动物DNA病毒是昆虫病毒。15.权利要求14的方法，其中所述昆虫病毒是杆状病毒。16.在哺乳动物中治疗神经疾病的方法，所述方法包括a)将治疗有效量的具有改变的外壳蛋白的非哺乳动物DNA病毒导入细胞，产生受感染的细胞，其中所述病毒的基因组包含编码选自神经生长因子、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、酪氨酸羟化酶、多巴脱羧酶、大脑源神经营养因子和碱性成纤维细胞生长因子的治疗蛋白质的外源基因；和b)在使得所述外源基因在所述哺乳动物中表达的条件下保持所述受感染细胞。17.权利要求16的方法，其中所述病毒是昆虫病毒。18.权利要求17的方法，其中所述昆虫病毒是杆状病毒。19.权利要求16的方法，其中所述改变的外壳蛋白包含哺乳动物病毒的外壳蛋白。20.权利要求16的方法，其中所述改变的外壳蛋白包含融合蛋白。21.包含以下的核酸非哺乳动物DNA病毒的基因组；一个外源哺乳动物基因；与所述外源哺乳动物基因可操作地连接的一个外源哺乳动物活性启动子；和一个编码改变的外壳蛋白的基因。22.权利要求21的核酸，其中所述编码改变的外壳蛋白的基因编码哺乳动物病毒的外壳蛋白。23.权利要求21的核酸，其中编码所述改变的外壳蛋白的基因编码融合蛋白。24.权利要求21的核酸，其中所述病毒是昆虫病毒。25.权利要求21的核酸，其中所述昆虫病毒是杆状病毒。26.包含以下的核酸非哺乳动物DNA病毒的基因组；一个编码改变的外壳蛋白的基因；一个外源反义RNA基因，从所述外源反义RNA基因转录的RNA与在细胞中以不合需要的高水平表达的基因的核酸互补；和一个外源哺乳动物-活跃启动子，其中所述外源反义RNA基因可操作地连接至所述启动子。27.权利要求26的核酸，其中所述编码改变的外壳蛋白的基因编码哺乳动物病毒的外壳蛋白。28.权利要求26的核酸，其中编码所述改变的外壳蛋白的基因编码融合蛋白。29.权利要求26的核酸，其中所述病毒是昆虫病毒。30.权利要求29的核酸，其中所述昆虫病毒是杆状病毒。31.含有核酸的细胞，其中所述核酸包含非哺乳动物DNA病毒的基因组；一个编码改变的外壳蛋白的基因；和与外源哺乳动物活性启动子可操作地连接的一个外源哺乳动物基因。32.权利要求31的细胞，其中所述编码改变的外壳蛋白的基因编码哺乳动物病毒的外壳蛋白。33.权利要求31的细胞，其中编码所述改变的外壳蛋白的基因编码融合蛋白。34.权利要求31的细胞，其中所述病毒是昆虫病毒。35.权利要求34的细胞，其中所述昆虫病毒是杆状病毒。36.包含以下的核酸非哺乳动物DNA病毒的基因组；一个编码改变的外壳蛋白的基因；选自肿瘤坏死因子基因、胸苷激酶基因、嵌合白喉毒素基因和胞苷脱氨酶(diaminase)基因的一个外源癌症治疗基因；和一个外源哺乳动物活性启动子，其中所述外源癌症治疗基因可操作地连接至所述启动子。37.权利要求36的核酸，其中所述编码改变的外壳蛋白的基因编码哺乳动物病毒的外壳蛋白。38.权利要求36的核酸，其中编码所述改变的外壳蛋白的基因编码融合蛋白。39.权利要求36的核酸，其中所述病毒是昆虫病毒。40.权利要求39的核酸，其中所述昆虫病毒是杆状病毒。41.包含以下的核酸非哺乳动物DNA病毒的基因组；一个编码改变的外壳蛋白的基因；选自RNA引诱物基因和核酶基因的一个外源基因；和与所述外源基因可操作地连接的一个外源哺乳动物活性启动子。42.权利要求41的核酸，其中所述编码改变的外壳蛋白的基因编码哺乳动物病毒的外壳蛋白。43.权利要求41的核酸，其中编码所述改变的外壳蛋白的基因编码融合蛋白。44.权利要求41的核酸，其中所述病毒是昆虫病毒。45.权利要求44的核酸，其中所述昆虫病毒是杆状病毒。46.包含以下的药用组合物(A)药学上可接受的赋形剂和(B)非哺乳动物DNA病毒，其中所述病毒的基因组包含一个外源哺乳动物基因；与所述外源哺乳动物基因可操作地连接的一个外源哺乳动物活性启动子；和一个编码改变的外壳蛋白的基因。47.权利要求46的药用组合物，其中所述病毒是昆虫病毒。48.权利要求47的药用组合物，其中所述昆虫病毒是杆状病毒。49.权利要求46的药用组合物，其中所述改变的外壳蛋白包含哺乳动物病毒的外壳蛋白。50.权利要求46的药用组合物，其中编码所述改变的外壳蛋白的基因编码融合蛋白。51.在其表面具有改变的外壳蛋白的非哺乳动物DNA病毒，其中所述病毒的基因组包含一个外源哺乳动物基因和与所述外源哺乳动物基因可操作地连接的一个外源哺乳动物活性启动子。52.权利要求51的非哺乳动物DNA病毒，其中所述病毒的基因组还包含编码改变的外壳蛋白的基因。全文摘要公开的是在哺乳动物细胞中表达外源基因的方法、核酸和细胞,包括将具有改变的外壳蛋白的非哺乳动物DNA病毒(例如,杆状病毒)导入所述细胞,该病毒的基因组携带外源基因;并且在使得该基因表达的条件下生长所述细胞。亦公开了治疗哺乳动物中基因缺陷疾病、神经疾病或癌症的方法,该方法为(1)向细胞提供治疗有效量的具有改变的外壳蛋白的非哺乳动物DNA病毒,该病毒的基因组携带外源的治疗基因和(2)在使得该外源基因在所述哺乳动物中表达的条件下生长所述细胞。文档编号C12N15/86GK1241216SQ97199427公开日2000年1月12日申请日期1997年9月11日优先权日1997年9月11日发明者F·博伊斯,J·G·巴索姆申请人:综合医院公司,生物遗传学公司