专利名称：海洋球石藻病毒外壳重组蛋白原核表达的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种海洋球石藻(Emiliania huxleyi)病毒外壳重组蛋白原核表达的 制备方法。
背景技术：
目前就藻类病毒在全球气候变化、生物地化循环和有害赤潮生消过程中的生态学 作用和意义受到极大关注。在自然海域中，病毒感染是导致浮游植物裂解和自然死亡的主 要因素之一。高达0. 3% /d的浮游植物死亡率情况不仅出现在藻类赤潮暴发后的消亡阶 段。由于缺乏用于病毒诱导的宿主死亡率测定的可靠方法，有关自然海域中病毒对微藻裂 解率的报道很少，尤其是对由于病毒裂解导致的浮游植物原位损失率知之甚少。目前用于估计病毒介导的浮游植物死亡率的方法主要有①用透射电镜观察被感 染的细胞，以被感染细胞出现的频率为基础评估病毒介导的死亡率；②是通过病毒总量和 每个细胞释放的病毒粒子数来计算细胞的裂解率，使用这种方法估计微藻死亡率的前提是 假设病毒粒子的释放量是已知的，而且可以将我们感兴趣的病毒与样品中其它病毒区分开 来；③通过病毒产量估计病毒诱导的宿主死亡率。采用稀释技术推算病毒的产量，但稀释前 的浓缩步骤比较复杂，很难在不影响藻类细胞生理状态的情况下浓缩出相对易碎的藻类细 胞，因此这种技术迟迟未被用于浮游植物上。目前就病毒对微藻的感染率及导致宿主裂解 率的各种估计方法都存在不同程度的缺陷，相比而言，采用电镜技术以被感染细胞出现的 频率为基础评估病毒介导的死亡率，这种方法最直接、准确而且不需要对样品进行培养，但 电镜的制样和观察过程仍比较烦琐，成本也高。在自然水体中，浮游植物病毒种类复杂多样，病毒的感染活性、裂解周期、病毒粒 子的释放量等方面都相差极大，加之高度种内特异性和宿主对抗病毒感染的寄生抗性使得 对藻病毒的生态学研究显得更加复杂。因此，采用一种通用的检测方法实现对自然水体中 病毒介导的总的浮游植物死亡率的估计是不可能的。目前，我们面临的挑战是如何结合现 有方法并发展更精确、方便可行的方法和技术，就某种感兴趣的病毒与宿主藻系统，建立室 内培养条件下病毒对宿主感染和裂解率的精确检测和估计方法，并延伸到自然海域中进行 校正和改进。病毒感染微藻通常是宿主特异性的，有时甚至只专一地感染一个宿主株系，而 病毒的感染特性往往取决于病毒颗粒外壳蛋白的结构.因此，从病毒外壳蛋白着手有望寻 找出病毒感染检测的新方法。海洋球石藻是海洋中碳循环的重要部分，它们吸收海水中的碳，并将其转变为类 似于坚硬的轮毂罩的盘状物，最终沉积海底。该藻在全球广泛分布，每年都会发生无数次 水华，由于球石藻外覆由特殊成分构成的球石粒，因此它的水华能够对周围环境产生诸多 重要影响；其次，由于球石粒的主要成分是碳酸钙，在它的产生过程中伴随着二氧化碳的生 成，同时球石藻还是高产DMSP生产者中最为重要的种类。在发生大面积的球石藻赤潮时， 病毒的裂解促使藻细胞产生的DMSP及释放到外界的DMS对于局部甚至整个海域环境都会 产生很大影响。可见，球石藻类在全球碳循环中起着重要作用。球石藻中以E. huxleyi最
3为重要，目前已分离到十多株海洋球石藻病毒(EhVs)，均属于藻类双链DNA病毒，也是迄今 发现的最大的病毒，其基因组大小在560kb左右，且为裂解性病毒。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供了一种海洋球石藻病毒外壳重组蛋白 原核表达的制备方法，本发明的方法能快速、准确检测球石藻病毒感染导致的宿主细胞裂解率。为达到上述的目的，本发明采用如下技术方案一种海洋球石藻病毒外壳重组蛋白原核表达的制备方法，包括如下步骤a)海洋球石藻病毒EhV (分离于挪威海域，由挪威卑尔根大学生物系微生物研究 所赠送)与宿主之间稳定感染体系的建立，病毒感染90小时后取病毒裂解上清液进行病毒 的纯化与浓缩；b)根据海洋球石藻病毒EhV外壳蛋白基因的全长序列设计引物；c)从步骤a)中已提纯的海洋球石藻病毒EhV中提取DNA ；d)PCR扩增海洋球石藻病毒EhV外壳蛋白基因；e)PCR电泳回收产物，连接质粒，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取克隆，提取质粒采 用EcoR I和Not I进行双酶切后电泳分析PCR产物并进行测序鉴定，海洋球石藻病毒EhV 外壳蛋白基因测序结果见序列表1。f)选择与预期大小相符的条带进行回收，通过双酶切得到目的基因片断，连接质 粒，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选得到重组载体；g)将构建好的重组载体转化入大肠杆菌表达菌株内，挑取单克隆进行目的基因 的小量表达；h)挑取单克隆进行目的基因的大量表达；i)将诱导前的样品、诱导后及纯化后的样品进行SDS-PAGE鉴定蛋白表达量。所述的纯化过程中采用SM缓冲液，其配方为10mmol/L NaCl, 50mmol/L Tris (三 羟甲基氨基甲烷)，IOmmol/L MgSO4和0. gelatin.(明胶)(购于上海生工AMERSC0分 装)，pH 7. 5。所述引物采用SEQIDN0. 1和SEQIDN0. 2 ；其核苷酸序列分别为:SEQIDN0.] MCP-F 5' -GACGAATTCCTCTGGATTTGGTGGTGG-3‘(划线部分为 EcoRI 酶切位点)；SEQIDN0. 2 =MCP-R 5' -ACCGCGGCCGCTCAGTTCGAGTATAATA-3 ‘(划线部分为 NotI 酶切位点)。所述PCR的反应条件为94°C预变性1分钟后进行94°C变性15秒、55°C复性30 秒、68°C延伸2分钟的30个循环的扩增，保存于4°C。所述步骤e)中大肠杆菌采用DH5ci ；所述步骤g)中大肠杆菌采用BL21 (DE3)。(均 购于碧云天生物技术研究所)所述的双酶切采用的酶为EcoRI和NotI (均购于TaKaRa广州瑞真生物技术有限 公司)。所述步骤e)中的质粒采用pMD19-T作为载体(购于TaKaRa广州瑞真生物技术有 限公司)。
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所述步骤f)采用pGEX-4T-3作为表达载体。(购于GE Healthcare厦门鹭隆生物 科技发展有限公司)，所述的重组载体为pGEX-4T-3-EhVMCP，含有权利要求1所述的海洋球 石藻病毒外壳重组蛋白基因的DNA序列。本发明的有益效果是本发明基于对病毒主要外壳蛋白(MCP)基因片段的研究分 析得到，EhV与其它藻类双链DNA病毒之间差异甚大，因此，球石藻病毒已被划分为藻类双 链DNA病毒科中的一个新的属(Coccolithovirus)。同时，不同EhVs株系之间MCP基因 保守区中某些碱基的变异性也较高。因此，MCP基因已作为一种新的更稳定的分子遗传标 记以区分自然群落中EhVs的不同基因型。虽然，不同的EhVs分离株的MCP基因保守区域 在核酸序列上存在一定的多样性，但其推导的对应的氨基酸序列的相似性却非常高，达到 99% -100%。另外，该类病毒具有独特的类似于动物病毒而不同于其它藻类病毒的感染方 式，病毒通过细胞内吞作用或是膜融合的方式，将包括外壳蛋白在内的整个病毒颗粒完整 的纳入宿主细胞。基于EhVs外壳蛋白氨基酸保守区高度的同源性及其独特的感染方式使 得MCP可以作为一种蛋白检测标记在自然海域中能够将EhVs与其他的藻类DNA病毒区分 开来。因此，通过表达EhVs MCP，建立血清学方法，将可以替代烦琐的TEM方法，用以追踪检 测自然海域中EhVs的存在、估计其对宿主的感染率、裂解率及致死情况，为快速、准确检测 球石藻病毒感染导致的宿主细胞裂解率提供新的方法。本发明所阐述的这种新的利用重组 技术和原核表达技术对一些较难提纯的病毒进行克隆，制备的方法，使得利用免疫学方法 检验出这些病毒导致的宿主细胞的感染和裂解率变为可能，以评估经由球石藻细胞死亡后 沉降到海底的二氧化碳总量及DMS的释放量，为政府制定二氧化碳排放量规范以及综合评 价球石藻病毒在全球气候变化中的重要作用提供理论依据。
图1是本发明海洋球石藻病毒(Emiliania huxleyivirus, EhV)外壳重组蛋白原 核表达的制备方法的PCR扩增结果；图2是本发明低含量烟草环斑病毒外壳重组蛋白的原核表达的制备方法的表达 及纯化产物的SDS-PAGE分析。图3是本发明重组载体的质粒构建策略图。
具体实施例方式下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。实施例1本实施例主要包括如下步骤来制备海洋球石藻病毒外壳重组蛋白原核表达。a)海洋球石藻病毒EhV与宿主之间稳定感染体系的建立，海洋球石藻病毒(EhV) 接种于海洋球石藻(Emiliania huxleyi, Eh)，90h小时后取病毒裂解上清液进行病毒的纯 化与浓缩将病毒裂解液离心除去大的细胞碎片(1000r/min，4°C离心lOmin)，然后分别经 0. 45 μ m和0. 2 μ m无菌滤膜过滤，滤液经卷式切向流超滤浓缩至约20_50ml后0. 2 μ m无 菌滤膜过滤，加入终浓度为100g/L的PEG 8000 (聚乙二醇8000)浓缩沉淀病毒，4°C搅拌过 夜。离心收集病毒沉淀，沉淀用SM缓冲液(10mmol/L NaCl, 50mmol/L Tris, 10mmol/L MgSO4 和0. 1% gelatin, pH 7.5)悬浮并于4°C静置过夜，PEG 8000反透析浓缩至适当的体积。取上述病毒浓缩液，与CsCl制成勻浆液(CsClO. 625g/ml)，装入IOml梯度离心管中，水平转 头60000r/min，4°C离心24h。小心收集离心后形成的病毒区带，于SM缓冲液中透析除去残 余的CsCl，再用PEG8000浓缩后4°C保存备用。b)根据海洋球石藻病毒EhV外壳蛋白基因的全长序列设计引物根据已报道的海 洋球石藻病毒(EhV)MCP全长基因(GeneBank登录号EU006629)设计一对特异引物进行 PCR扩增，本实验中采用的引物为SEQIDN0. 1 =MCP-F 5' -GACGAATTCCTCTGGATTTGGTGGTGG -3‘(划线部分为 EcoRI 酶切位点)；SEQIDN0. 2 =MCP-R 5' -ACCGCGGCCGCTCAGTTCGAGTATA ATA-3 ‘(划线部分为Not I酶切位点)。c)从步骤a)中已提纯的海洋球石藻病毒EhV中提取DNA ⑴取150 μ L纯化的病 毒液，加入500 μ L 0. 5% SDS (十二烷基磺酸钠)和终浓度为20 μ g -mL-1的蛋白激酶K(购 于AMERSC0上海生工分装)，旋涡混合30秒，55°C孵育30min，每IOmin轻轻的旋涡混合一 次。(2)加入80 μ L4. 5Μ的NaCl和65°C预热的CTAB溶液，轻轻混勻，65°C恒温孵育10分钟。 (3)将样品取出降至室温，加入500 μ L体积比为24 1的氯仿-异戊醇(480 μ L 20 μ L) 和60 μ LTris平衡酚(购于Biotech上海生工)轻轻颠倒离心管混勻样品。(4)室温下高 速(13. 4Krpm)离心10分钟。(5)移出最上层部分的水相于新的无菌的离心管中加入0. 6 倍体积的异丙醇，上下轻轻颠倒几次混勻，于室温下静止10分钟使沉淀形成。(6)全速离 心(13. 4Krpm) 10分钟，使DNA沉淀下来，取出异丙醇，加入预冷的70%乙醇500L最高速度 (13. 4Krpm)离心5分钟(7)加入35mL TE缓冲液(购于碧云天生物技术研究所)可用无菌 水代替)和终浓度为0. lmg/ml的Rnase37°C孵育2个小时，以除去RNA。d) PCR扩增海洋球石藻病毒EhV外壳蛋白基因PCR反应体系为25μ 1，含3μ 1模 板DNA、0.5yl KOD DNA polymerase (KOD DNA聚合酶)(购于TOYOBO厦门鹭隆生物科技发 展有限公司)、1μ 1 上游引物 SEQIDN0. 1 (IOpmol/μ 1)、1 μ 1 下游引物 SEQIDN0. 2 (IOpmol/ μ 1) ,2. 5μ 1 dNTP(脱氧核苷三磷酸)(2mmol/L)、1· 5μ 1 MgSO4 (25mmol/L)、2· 5 μ 1 10XPCR缓冲液(购于Τ0Υ0Β0厦门鹭隆生物科技发展有限公司)、11 μ 1无菌水。PCR的反应条件为94°C预变性1分钟后进行94°C变性15秒、55 °C复性30秒、68 °C 延伸2分钟的30个循环的扩增，保存于4°C。e) EhV MCP的PCR扩增后的产物鉴定用设计的EhV MCP基因特异性引物 EhV-F和EhV-R进行PCR，扩增产物经1 %的琼脂糖凝胶电泳，可见大小149 Ibp的特 异性扩增片段，与预期大小相符，结果见图1。其中M为DNA Marker (标记)(TaKaRa 1 OObpDNALadderMarker 1500,1000，900，800，700，600，500，400，300，200，100) ； 1，2 为纯病 毒扩增产物。PCR电泳产物(与预期大小相符的条带)经DNA (脱氧核糖核酸)回收试剂盒 回收后，进行T-A克隆，所用载体为PMD19-T (购于TaKaRa广州瑞真生物技术有限公司)，并 转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞。加入800μ1 LB (LB培养基)，37°C，150rpm (每分钟转 数)60min，取200ul涂布至Amp板(氨苄青霉素)板(10mg/ml)，37°C倒置培养过夜，至克 隆长出，进行蓝白斑筛选。挑取白色菌落，采用试剂盒小量提取质粒.采用EcoR I和Not I 双酶切后电泳分析并进行测序鉴定，测序结果(见序列表1)证明阅读框架正确。序列表1 是本发明海洋球石藻病毒(Emiliania huxleyivirus,EhV)外壳重组蛋白基因测序结果表。 利用GeneBank(核酸序列数据库)进行比对，同源性高达99%以上，结果证明测定序列为 EhV MCP全序列。得到了含有目的基因片段的重组载体pMD19-T-EhV-MCP。
f)PCR产物经切胶回收后以，用EcoR I和Not I经37°C 10小时双酶切获得 1491bp (碱基对)的目的基因片段，与经EcoRI和NotI37°C 10小时双酶切的pGEX_4T_3表 达载体以DNA Ligation kit (购于TaKaRa广州瑞真生物技术有限公司)16°C，连接16小 时，之后将保存于_70°C的E. coliDH5a克隆宿主取出冰上放置15min直至全化，将10 μ 1 连接产物加入其中冰上放置30min (需要做阴阳性对照)。42°C热激90S，迅速转移至冰上 放置2min。加入到含有SOOyL LB培养基的试管中混勻，37°C培养lh。将未离心的菌液 取200 μ L涂存，8000rpm Imin的上清200 μ L涂布，沉淀200 μ L涂布(所有培养基都含有 氨苄青霉素)，37°C倒置培养12h。氨苄抗性筛选得到重组载体pGEX-4T-3-EhV MCP (质粒 构建图如图3)，生物材料分类命名为大肠埃希氏菌(其拉丁文为Escherichia coli)，该 重组菌株于2010年5月24日送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)鉴定，证明为存活的重组菌 株，并于2010年5月24日将菌株保藏于该中心，保藏号为=CGMCC No. 3869。对重组载体进 行PCR验证和酶切验证可见一 1491bp条带，与预期大小相符，说明EhV MCP基因已连接到 PGEX-4T-3 载体上。g)将构建好的重组载体转化入大肠杆菌表达菌株内，挑取单克隆进行目的基因的 小量诱导表达；将构建好PGEX-4T-3的重组载体转化入大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)(为特 定大肠杆菌名称)。挑取单克隆，加入IOml Amp抗性/LB液体培养基(1 %蛋白胨，1 % NaCl， 0. 5%酵母提取物；Amp浓度为10mmg/ml)中37°C、180rpm，培养过夜。取3ml菌液离心后去
上清，沉淀备用。诱导表达另取200 μ 1菌液，加入IOml Amp抗性/LB液体培养基中30°C、180rpm, 3hr，至OD (光密度值)600为0.6。加IPTG (异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至菌液中，终浓 度为0. 3mM，25°C继续培养8小时。取3ml菌液离心弃上清，沉淀备用。将菌体以500 μ IPBS (磷酸钠缓冲液)重悬，超声波破碎5min。IOOOOrpm离心lOmin，分别回收上清和沉。 SDS-PAGE的浓度为10%，电泳鉴定表明，目的基因已经表达。h)挑取单克隆进行目的基因的大量诱导表达；挑取单克隆，加入10ml Amp抗性/ LB液体培养基中37°C、ISOrpm，培养过夜。取3ml菌液离心后去上清，沉淀备用。大量诱导表达另取2ml菌液，加入100ml Amp抗性/LB液体培养基中30°C、 180rpm，3hr，至OD (光密度值)600为0.6。加IPTG (异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至菌液 中，终浓度为0. 3mM，25°C继续培养8小时。离心弃上清，沉淀备用。i)将诱导前的样品、诱导后及纯化后的样品进行SDS-PAGE鉴定蛋白表达量。将 诱导前的样品、诱导后及纯化后的样品(包括上清和沉淀)取20 μ 1分别加入20 μ 1 2χ蛋 白 Ioadingbuffer (上样缓冲液)，配方为 0. lmol/L Tris · Cl pH6. 8，20%甘油，4% SDS， 2% β-巯基乙醇，0.001 %溴酚蓝)混勻，95°C变性5分钟，13000rpm离心15分钟，留取上 清做SDS-PAGE。凝胶浓度为10%。进行SDS-PAGE之后考马斯亮蓝染色结果表明 经IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导，含重组载体的菌株特异的产生了一条分子量 为SOkDa(千道尔顿)的条带(GST标签为26kDa)。此条带大小与预期相符(如图3所示， Fermentas 116. 0，66. 2，45. 0，35. 0,25. 0,14. 4)，1为未诱导的全菌总蛋白；2为诱导的全 菌总蛋白；3为诱导的上清；4为诱导的沉淀；5为洗脱纯化蛋白)。对SOkDa的条带切胶， 电洗脱得到高纯度的融合表达蛋白。[0045序列表[0046<110>申请人的姓名或名称(集美大学，刘静雯)[0047<120>海洋球石藻病毒外壳重组蛋白原核表达的制备方法[0048<160>1[0049<210>1[0050<211>1491[0051<212>DNA[0052<213> 海洋球石藻病毒(Emiliania huxleyi virus)[0053<220>[0054<221>CDS[0055<220>[0056<221>gene[0057<400>1[0058atgtctggatttggtggtggtagttctggagcgggtagtctgacccagttattggcaacg60[0059gggtctatggacgccgcgct 3. C 3. C 3.3.3.3. Cgctacacgtaccttctggaagtcttcgtac120[0060cagaagcactcgcttttcgcgctcgagtcgatcaaccagccattcacaacccaggttcag180[0061tttggggctgagtcgcatattaccgtcaatcgtcaaggcgatttgctatcgtggatgtac240[0062ctcaagattgtcctccctggcctaaaggtccagaaccaggcggacaccgttcagccaact300[0063cagcagtcattcgcgtcgctcgacaacgacgtcgctgcgcaggctgacgtatcgcacgtc360[0064cttccatacattgagggtgcgtacaccgaggcgtccctcaacaccaaggagcagctcatt420[0065gctgaggccaagaactcgtacgaggctgccaagtacaacgctgcgccactcccagtcgct480[0066gcgcagatgcagtcgaccgagatgcccgactttgattatgcgtattggactgaggcgatt540[0067ggctttcacctaattaagcgggcggaatttaaggtcggtggtgccacaattgacaccatt600[0068tggtcggaacttcttttcgcgatggaggagcttatgggccgcgcgggccgccgtcttact660[0069gagaccattggccgtaccctccgccgcccaaccgagctcatgaaggcctcgcgccaggag720[0070cagatcctctacgtcccacttccatggtacttcaccaagcacccatcgcttgcgttccca780[0071CttgttgCggcgacctaccacaacatccagctctgggtgcagtgggcgcagctcaactcg840[0072tgcattatcaagtcgcgctccaacctcgtcgtcctccacgccgagcgtaacgtcccaatt900[0073tcggacgatcacctacgtgcgtcccttgagtgcacgtacgtccacctcgaggcggccgag960[0074cgtgatgcgctcaccgcgaacgctggcacccagctcatcgttcagcaccaggcgcacctc1020[0075cagcaggtctcgtccaacaacgtcaccgcgcgcctcaacttcaacttcccagttcttgag1080[0076ttctactacttcctccgccgtaaggcgaacaaggacgcgggtgatcattttaatttctcg1140[0077ggcattggtggtcgcgatccagtcgtatcggcggagcttctatttaacaacacggcgcgt1200[0078gtcacgcagaagccggcggtatggtggcgtgcggtacaggcgcttcagttccactcgtct1260[0079gcgcccctcaccaacatctactcgtactcgttctcgctctcgccagaggacccaattacc1320[0080ccatcgggttcggccaattt ctcgcgtcta gattccgtcg agcttgcgct aaccctacag1380[0081gacgatttcg gtgccgcgca cgacgcgaac tccgagctct tcgtctttgc gcgctcgtac1440[0082aacattcttaaatttaccaa tggtcttgct ggactattat actcgaactg a1491
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权利要求
一种海洋球石藻病毒外壳重组蛋白原核表达的制备方法，其特征在于包括如下步骤a)海洋球石藻病毒EhV与宿主之间稳定感染体系的建立，病毒感染90小时后取病毒裂解上清液进行病毒的纯化与浓缩；b)根据海洋球石藻病毒EhV外壳蛋白基因的全长序列设计引物；c)从步骤a)中已提纯的海洋球石藻病毒EhV中提取DNA；d)PCR扩增海洋球石藻病毒EhV外壳蛋白基因；e)PCR电泳回收产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑取克隆，提取质粒采用EcoR I和Not I进行双酶切后电泳分析PCR产物并进行测序鉴定，海洋球石藻病毒外壳重组蛋白基因测序结果见序列表1。f)选择与预期大小相符的条带进行回收，通过双酶切得到目的基因片断，连接质粒，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选得到重组载体；g)将构建好的重组载体转化入大肠杆菌表达菌株内，挑取单克隆进行目的基因的小量表达；h)挑取单克隆进行目的基因的大量表达；i)将诱导前的样品、诱导后及纯化后的样品进行SDS PAGE鉴定蛋白表达量。
2.如权利要求1所述的海洋球石藻病毒外壳重组蛋白原核表达的制备方法，其特征在 于所述的纯化过程中采用SM缓冲液，其配方为10mmol/L NaCl, 50mmol/L Tris, IOmmol/ L MgSO4 和口 0.1% gelatin, pH 7.5。
3.如权利要求1所述的海洋球石藻病毒外壳重组蛋白原核表达的制备方法，其特征在 于所述引物采用SEQIDN0. 1和SEQIDN0. 2 ；其核苷酸序列分别为SEQIDN0. 1 =MCP-F 5' -GACGAATTCCTCTGGATTTGGTGGTGG-3‘(划线部分为 EcoRI 酶切 位点)；SEQIDN0. 2 =MCP-R 5' -ACCGCGGCCGCTCAGTTCGAGTATAATA-3‘(划线部分为 Not I 酶 切位点)。
4.如权利要求1所述的海洋球石藻病毒外壳重组蛋白原核表达的制备方法，其特征在 于所述PCR的反应条件为940C预变性1分钟后进行94°C变性15秒、55 °C复性30秒、68 °C 延伸2分钟的30个循环的扩增，保存于4°C。
5.如权利要求1所述的海洋球石藻病毒外壳重组蛋白原核表达的制备方法，其特征在 于所述步骤e)、f)中大肠杆菌采用DH5ci ；所述步骤g)中大肠杆菌采用BL21(DE3)。
6.如权利要求1所述的海洋球石藻病毒外壳重组蛋白原核表达的制备方法，其特征在 于所述的双酶切采用的酶为EcoRI和NotI。
7.如权利要求1所述的海洋球石藻病毒外壳重组蛋白原核表达的制备方法，其特征在 于所述步骤e)中的质粒采用PMD19-T作为载体。
8.如权利要求1所述的海洋球石藻病毒外壳重组蛋白原核表达的制备方法，其特征在 于所述步骤f)中采用PGEX-4T-3作为表达载体，所述的重组载体为pGEX-4T-3-EhV MCP, 含有权利要求1所述的海洋球石藻病毒外壳重组蛋白基因的DNA序列。
全文摘要
本发明公开了一种海洋球石藻病毒外壳重组蛋白原核表达的制备方法，步骤为a)海洋球石藻病毒的纯化与浓缩；b)设计引物；c)提取DNA；d)PCR扩增海洋球石藻病毒EhV外壳蛋白基因；e)PCR电泳回收产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑取克隆，提取质粒进行酶切后电泳分析PCR产物并进行测序鉴定；f)通过双酶切得到目的基因片断，连接质粒，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选得到重组载体；g)目的基因的小量表达；h)大量表达；i)SDS-PAGE鉴定蛋白表达量。本发明获得了大量纯化的重组病毒外壳蛋白，下一步可用于免疫生产抗体，为建立快速、准确检测球石藻病毒感染导致的宿主细胞裂解率的免疫荧光检测技术提供了物质基础。
文档编号C07K14/01GK101974541SQ20101023650
公开日2011年2月16日 申请日期2010年7月16日 优先权日2010年7月16日
发明者刘静雯, 张雅兰, 董双林, 郑天凌 申请人:集美大学